VIẸN ĐẠI HỌC MO HA NỌI KHOA CỐNG NGHỆ SINH HỌC —— Lđ>’ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ TÁC DỤNG HÀN GẤN VÉT THUONG CỦA PROTEASE TÙ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERAN.
VIẸN ĐẠI HỌC MO HA NỌI KHOA CỐNG NGHỆ SINH HỌC —— Lđ>’ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ TÁC DỤNG HÀN GẤN VÉT THUONG CỦA PROTEASE TÙ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERANTHEMVM PALA TIFERUM (NESS) RADLK Người hướng dẫn : TS VƠ HỒI BẢC Sinh viên thục hiện: HỒNG THỊ TRANG Lóp : 13-01 HÀ NỘI-2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CổNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN cưu HỒN THIỆN QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ TÁC DỤNG HÀN GẢN VẾT THƯƠNG CỦA PROTEASE TÙ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERANTHEMƯM PALA TIFERUM (NESS) RADLK Người hướng dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC Sinh viên thực hiện: HỒNG THỊ TRANG Lóp : 13-01 HÀ NỘI -2017 LỜI CẢM ƠN Đổ hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tị lời cảm ơn sâu sắc tới TS Võ Hồi Bắc phịng Sinh hóa Thực Vật, Viện công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dần, tận tinh giúp đờ q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cãm ơn PGS.TS Nguyễn Mai Phương, Trưởng phòng Sinh hóa Thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam, tạo điều kiện cho phép thực tập Tôi xin càm ơn tập thổ cán bộ, nghiên cứu sinh, sinh viên phịng Sinh hóa Thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi tận tình suốt q trình làm khóa luận, tơi xin gứi lời cám ơn sâu sắc Tôi xin cảm ơn Thầy, Cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mớ Hà Nội, quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập hoàn thiện luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè ln động viên giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày ỉ2 tháng năm 2017 Sinh viên Hoàng Thị Trang MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC NHỮNG TÙ VIẾT TẤT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ so ĐỒ MỞ ĐẦU PHẦN I : TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Mô tả thực vật Xuân Hoa p palatiferum 1.2 Những nghiên cứu Xuân Hoa p palatiferutn 1.2.1 Kinh nghiệm dân gian sứ dụng Xuân Hoa 1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa 1.2.3 Nghiên cứu dược tính 1.3 Dịnh nghĩa phân loại protease 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Phân loại 1.4 ủ ng dụng protease 10 1.5 Những nghiên cứu protease từ thực vật từ Xuân Hoa p palatiferum 13 PHẦN II : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 15 2.1 Nguyên vật liệu 15 2.1.1 Mầu thí nghiệm 15 2.1.2 Hóa chất sứ dụng 15 2.1.3 Máy móc, thiết bị 15 2.2 Phuong pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phương pháp chiết rút protease từ Xuân Hoa p palatiferum 15 2.2.2 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cãi tiến 16 2.2.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 18 2.2.4 Phương pháp tinh enzyme 19 2.2.5 2.2.6 2.2.7 Điện di protein 21 Phương pháp nghiên cứu tính chất cùa protease 23 Đánh giá tác dụng làm lành vet thương tế bào nguyên sợi da người theo phương pháp Laing 25 2.2.8 Phương pháp thống kê 26 PHẦN III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Tinh protease từ Xuân Hoa p palatiferum 21 3.2 Điện di biến tính khơng biến tính protein 32 3.3 Ảnh hưởng số chất ức chế đặc hiệu protease 34 3.3.1 Ánh hưởng PMSF lên hoạt tính protease 34 3.3.2 Anh hưởng PCMB lên hoạt tính protease 34 3.3.3 Ánh hưởng HgCl2 lên hoạt tính protease 35 3.3.4 Anh hướng cúa O-phenanthroline lên hoạt tính protease 35 3.4 Khả thủy phân protease CO’ chất khác 36 3.5 Độ bền protease 37 3.5.1 Độ bền với nhiệt 37 3.5.2 Độ bền với pH 38 3.5.3 Ănh hường ion kim loại lên hoạt tính protease 39 3.6 người Đánh giá tác dụng làm lành vết thương tế bào nguyên sợi da 39 PHÀN IV : KẾT LUẬNVÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 49 DANH MỤC NHŨÌNG TỪ VIÉT TẤT Kí hiệu: Tên đầy đủ BSA: Bovine Seurum Albumin DMSO: Dimethyl Sulfoxide EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid HPLC: High Performance Liquid Chromatography OD: Optical Density SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis TCA: Tricloacetic Acid UV: Ultra Violet PCMB: P-chloro-mercuribenzoic acid PMSF: Phenylmethane sulfonyl fluoride DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 Xác định đường cong chuẩn cúa tyrosine .17 Bàng 2.2 Xác định đường cong chuấn protein 19 Bảng 2.3: Công thức pha gel tách (12%) 22 Bàng 2.4: Công thức pha gel cô (5%) 22 Bảng 3.1: Kiêm tra hoạt tính protease cứa phân đoạn qua cột Sephadex G-100 29 Báng 3.2: Kiếm tra hoạt tính protease cúa phân đoạn qua cột DEAE- cellulose 31 Báng 3.3: Tóm tắt q trình tinh protease từ Xuân Hoa p.palatiferum 32 Bảng 3.4: Hoạt tính protease p palatiferum chất khác 36 Bàng 3.5: Ành hưởng ion kim loại lên hoạt tính p palatiferum protease 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ so ĐỊ Hình Trang Hình 1.1: Cây Xuân Hoa p palatiferum Hình 3.1: Sơ đồ làm protease từ Xuân Hoa p palatiferum 27 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn protein protease từ Xuân Hoa sau qua cột lọc gel Sephadex G-100 29 Hình 3.3: Đồ thị biếu diễn protein protease từ Xuân Hoa sau qua cột trao đối ion DEAE- cellulose 30 Hình 3.4: Điện di protein phân đoạn sau qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE- cellulose gcl polyacrylamid 12% 33 Hình 3.5: Phát băng hoạt tính protease từ phân đoạn sau qua cột sắc ký trao đồi ion DEAE- cellulose gel polyacrylamid 12.5% 33 Hình 3.6: Anh hưởng cũa PMSF lên hoạt tính protease 34 Hình 3.7: Ảnh hưởng PCMB lên hoạt tính protease 34 Hình 3.8: Ánh hưởng HgC12 lên hoạt tính protease 35 Hình 3.9: Ảnh hưởng cùa O-phenanthroline lên hoạt tính protease 35 Hình 3.10: Độ bền nhiệt protease 37 Hình 3.11: Độ bền với pH protease 38 Hình 3.12: Hình ảnh kính hiển vi hàn gắn vết rạch nguyên bào sợi cùa protease 40 Hình 3.13: Mức độ hàn gắn vết rạch protease nguyên bào sợi 41 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU ❖ Đặt vấn đề Trong năm gần đây, việc ứng dụng protease Y học nhà khoa học giới quan tâm Các nghiên cứu cho thấy protease có hiệu kháng viêm, tiêu cục máu đông, làm mau lành vết thương, chống tắc nghẽn mạch máu, chống ung thư, điều hòa miễn dịch Các nghiên cứu trước cho thấy Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum ( Ness ) Radik chứa hàm lượng lớn protease Cây Xuân Hoa p palatiferum ( Ness ) Radik thuộc họ Ơrơ Acanthaccac dùng dân gian đễ chừa nhiều bệnh Trong năm gần đây, nhiều nhà khoa học Việt Nam giới xác minh số tác dụng sinh học cùa thuốc như: kháng khuấn, kháng nấm, tác dụng chống oxy hóa, giảm huyết áp, hạ đường huyết, ức chế acetylcholinesterase Tuy nhiên, việc nghiên cứu đặc tính tác dụng dược lý chi tập trung vào nhóm chất thứ cấp cịn nhiều công dụng khác lưu truyền dân gian Xuân Hoa p palatiferum chưa chứng minh Cho đến chưa có nghiên cứu tác dụng hàn gắn vết thương cúa protease từ thuốc Do vậy, tiến hành thực đề tài: “ Nghiên cứu hồn thiện quy trình tinh tác dụng hàn gắn vết thương protease từ thuốc Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radik” Đe tài chúng tơi nghiên cứu góp phần bổ sung thông tin khoa học thuốc quý cúa Việt Nam ❖ Mục tiêu nghiên cứu đề tài: - Hồn thiện quy trình tinh protease từ Xuân Hoa p palatiferum Hoàng Thị Trang Lớp 13 - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp - Viện Đại học Mở Hà Nội Xác định protease từ thuốc thuộc nhóm protease - Xác định tác dụng hàn gắn vết thương cùa protease tinh từ thuốc ❖ Nội dung đề tài: - Tinh protease từ thuốc Xuân Hoa p palatiferum (Ness) - Xác định ành hưởng chất ức chế đặc hiệu lên hoạt tính Radik đạt hiệu cao protease tinh - Đánh giá độ bền cùa protease với nhiệt độ, pH ion kim loại - Đánh giá thúy phân cúa protease số chất khác - Đánh giá tác dụng hàn gắn vết thương cùa protease in vitro Hoàng Thị Trang Lớp 13 - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Kết hình 3.9 cho thấy o-phenanthroline khơng có ảnh hướng đến hoạt tính protease Qua kết nghiên cứu trên, nhận thấy protease bị ức chế mạnh gần 90% hoạt tính protease bới PMSF (chất ức chế đặc hiệu nhóm serine protease), bị ức chế nhẹ khoảng 20-25% chất ức chc (PCMB HgC12) (các chất ức chế đặc hiệu cho nhóm cysteine protease) khơng bị ức chế ^-phenanthroline (chất ức chế đặc hiệu cho nhóm protease kim loại) Như có the kết luận protease tinh từ p palatiferum thuộc nhóm protease serine 3.4 Khả thủy phân protease chất khác Bảng 3.4 cho thấy protease p palatiferum chí có khả thúy phân chất casein, bovine scrum albumin, gelatin and fibrinogen Protease cùa Xuân Hoa p palatiferum không thúy phân BAPNA, chất đặc hiệu cho trypsin, có thề thấy tính chất khác với enzyme tương tự trysin (Souza, 2007) Protease có thúy phân fibrinogen Với việc xác định protease thuộc nhóm serine protease chúng tơi nhận thấy enzyme có tiêu sợi fibrin số serine protease khác (Paik, 2007; Kim, 1996) Bảng 3.4 Hoạt tính protease p palatiferum CO’ chất khác Co' chất Casein BAPNA Gelatin BSA Human fibrinogen Hồng Thị Trang Hoạt tính protease p palatiferum Đặc tính Cơ chất chung cho nhiều loại protease Cơ chất cùa cathepsin H/trypsin Cơ chất chung cho nhiều loại protease Cơ chất chung cho nhiều loại protease Thrombin-scrinc protease Có Khơng có Có Có Có 36 Lớp lĩ - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Trong khuôn khố luận văn này, bước đầu kháo sát khả thủy phân protease tinh số chất khác Đe so sánh, đánh giá cách xác hoạt độ cùa protease chất cần có thời gian tối ưu điều kiện hoạt động enzyme chất Chúng tiếp tục nghiên cứu sâu thời gian tới 3.5 Độ bền protease Trong nghiên cứu trước đây, chúng tơi đà xác định protease có điều kiện tối ưu cho hoạt động (nhiệt độ: 70°C pH: pH 7,0) Trong luận văn này, chúng tơi đánh giá tính bền nhiệt, pH ánh hướng ion kim loại lên hoạt tính protease tinh từ Xuân Hoa p palatiferum 3.5.1 Độ hen với nhiệt Tính bền nhiệt quan trọng cho việc ứng dụng enzyme cơng nghiệp Đế nghiên cứu tính bền nhiệt cùa protease Xuân Hoa p palatiferum, dịch enzyme ủ nhiệt độ khác từ 30-100°C 15 phút, sau đo hoạt tính Hoạt tính tương đối (%) 120 Hình 3.10 Độ bền nhiệt protease Hoàng Thị Trang 37 Lớp lĩ - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Kết hình 3.10 cho thấy protease Xuân Hoa có độ bền nhiệt cao dái nhiệt độ 30-80°C, hoạt tính protease ồn định không giám đáng kế so với dịch enzyme ban đầu Khi ú dịch enzyme 90°C 10 phút protease gần bị biến tính hồn tồn, hoạt tính protease giảm mạnh chi khoảng 5% so với hoạt tính enzyme khơng xử lý nhiệt độ Enzyme có the thích hợp cho ứng dụng việc sản xuất quy mô lớn công nghiệp Y học 3.5.2 Độ hen với pH pH môi trường phản ứng yếu tố ảnh hưởng lớn tới độ bền cúa enzyme Chúng tơi đánh giá tính bền cúa protease khoảng từ pH 212 Ở vùng pH acid 2-3, protease hoạt tính hồn tồn Khi ủ protease pH 4-5 hoạt tính protease cịn khoảng 55-60% Protease bền vùng pH 7- 11, protease tinh từ Xuân Hoa p palatiferum có độ bền cao mơi trường pH kiềm, ( hình 3.11) Hình 3.11 Độ bền vói pH protease Hồng Thị Trang 38 Lớp 13 - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp 3.5.3 Viện Đại học Mở Hà Nội Anh hưởng ion kim loại lên hoạt tính protease Bảng 3.5 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính ciía p palatiferum protease Các ion kim loại Nồng độ Control % Hoạt tính cịn lại 100 Ca2+ 5mM 91 Mg2+ 5mM 89 K+ 5mM 100 Na+ 5mM 100 Cu2+ 5mM 56.5 Pb2+ 5mM 68 Zn2+ 5mM 14.7 Kct bảng 3.5 cho thấy kim loại nhẹ K+, Ca2+, Na+, Mg2+ khơng ánh hướng đến hoạt tính cùa protease từ Xuân Hoa p palatiferum Các ion kim loại nặng Cu2+, Pb2+ với nồng độ 5mM làm giám khống nứa hoạt tính enzyme Riêng Zn2+ ảnh ánh hướng giảm mạnh hoạt tính protease 3.6 Đánh giá tác dụng làm lành vết thưong tế bào nguyên sợi da người Hoàng Thị Trang 39 Lớp lĩ - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 24h điều trị với protease (100pg/ml) 24h điều trị với protease (50pg/ml) Hình 3.12 Hình ảnh kính hiển vi hàn gắn vết rạch nguyên bào sợi protease Khoảng cách vết rạch nguyên bào sợi xác định thời điếm 0, 4, 8, 12, 24, 48 sau tra mẫu protease nồng độ 0, 50, 100 pg/mL Ket quà chụp kính hiến vi cho thấy xâm lấn, tăng sinh nguyên bào sợi vào trung tâm vết rạch, khoảng cách vết rạch thu hẹp dần Tại thời điếm 24 sau tra thuốc, vết rạch thu hẹp đáng ke (hình 3.12; 3.13) Mức độ hàn gắn vet rạch xác định theo tỷ lệ phần trăm khoảng cách trung bình thời diem quan sát sau so với thời điểm quan sát ban đầu (thời điểm sau tra thuốc) Tại thời diêm 4, 8, 12 sau tra protease khơng có khác biệt đáng kể khoáng cách vết rạch so với đối chúng Tại thời diem 24 giờ, Hoàng Thị Trang 40 Lớp lĩ - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội giếng tra thuốc protease nồng độ 50 100 pg/mL có thu hẹp vết rạch có ý nghĩa so với đối chứng không tra thuốc thời điếm quan sát (p < 0.05) Protease bước đầu hiệu hàn gắn vết thương Khoáng cách vết rạch BĐC (% tương đối) Oh 4h 8h BProlũ0ụg 12h ,Pro50p6 24h Thời gian (h) Hình 3.13 Mức độ hàn gắn vết rạch protease nguyên bào sọi * (sự khác có ý nghĩa so với nhóm đối chứng, p