Nghiên cứu một số tính chất sinh hóa và tác dụng sinh học của protease từ cây thuốc xuân hoa pseuderanthemum palatiferum (nees) radlk

Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà LỊI CẢM ON Đế hồn thành khóa luận này, em xin tó lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS.Võ Hồi Bắc, người tận tình hướng dẫn chi bảo truyền đạt cho em kinh nghiệm vô quý báu suốt trình thực tập viết báo cáo tốt nghiệp Em chân thành cám ơn toàn thê cán phịng Sinh hóa thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học cho phép tạo điều kiện thuận lợi đế em thực tập phòng nghiên cứu Em chân thành cám ơn quý Thày, Cô khoa Công nghệ Sinh học- Viện đại học Mờ Hà Nội truyền đạt cho em vốn kiến thức năm em học tập trường Với vốn kiến thức tiếp thu q trình học khơng chi táng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà hành trang quý báu để em bước vào đời cách vững tự tin Cuối em xin kính chúc q Thầy, Cơ doi sức khỏe đạt nhiều thành công nghiệp cao quý Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hà nội, ngày 22, tháng 5, năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CÁM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC NHÙNG TỪ VIẾT TẨT DANH MỤC CÁC BÁNG DANH MỤC CÁC HÌNH VÈ VÀ sơ ĐỊ MỚ ĐÀU CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MÔ TÂ THỰC VẬT CÂY XUÂN HOA 1.2 NHŨNG NGHIÊN cửu VÈ CÂY XUÂN HOA 1.2 1.3 ỉ Kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa 1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa 1.2.3 Nghiên cứu dược tính ĐỊNH NGHĨA VÀ PHÂN LOẠI PROTEASE 1.3.1 1.3.2 Định viện-ViệnĐại-họeMỞHàNội Phân loại 1.4 ỨNG DỤNG CÙA PROTEASE 1.5 NHŨNG NGHIÊN củu VỀ PROTEASE TỪ THỰC VẬT VÀ TỪ CÂY XUÂN HOA II CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 12 2.1 VẬT LIỆU 12 2.1.1 Mầu thí nghiệm 12 2.1.2 Hóa chất sử dụng 12 2.1.3 Máy móc, thiết bị 12 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 12 2.2.1 Phương pháp chiết rút protease từ Xuân Hoa 12 2.2.2 Xác định hoạt độ protease khuếch tán đĩa thạch có chứa chất Lcluk cộng 13 2.2.3 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cài tiến 13 2.2.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 15 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp 2.2.5 Phương pháp tinh enzyme .16 2.2.6 Điện di protein 18 2.2.7 Phương pháp nghiên cứu tính chất cùa protease 19 2.2.8 Xác định hoạt tính quét gốc tự sử dụng phương pháp DPPH 20 2.2.9 Xác dinh hoạt tính kháng viêm invitro sử dụng phương pháp ức enzyme hyaluronidase theo phương pháp Reissig 20 chế CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ 22 3.1 KHÁO SÁT HÀM LƯỢNG ENZYME TRONG LÁ XUÂN HOA THEO MÙA 22 3.2 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEASE TÙ' LÁ CÂY XUÂN HOA 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SĨ CHÁT HOẠT HĨA VÀ KÌM HÃM LÊN 22 CHÉ PHẢM ENZYME PROTASE 29 3.3.1 Anh hưởng cúa Mercapetanol lên hoạt tính protease 29 3.3.2 Anh hướng cùa Sodium thiosulfate (NajSiOs) lên hoạt tính protease29 3.3.3 Anh hướng EDTA lên hoạt tính protease 30 3.3.4 Anh hướng ctja H2O2 lện l^Ịị ^(ỹ^ỡ^hTNỜÌ 31 3.4 ẢNH HƯỚNG CÙA PH VÀ NHIỆT DỘ LÊN HOẠT TÍNH PROTEASE 3.5 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CUA PROTEASE 31 TINH SẠCH TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA 32 3.5.1 Tác dụng ức chế enzyme hyaluronidase, kháng viêm cùa protease từ Xuân Hoa 32 3.5.2 Đđnh giá hoạt tính quét gốc tự cùa protease Xuân Hoa 34 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHAO 36 PHỤ LỤC 40 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà DANH MỤC NHŨNG TÙ VIÉT TẤT APS: Amonium Persulfat BSA: Bovine Seurum Albumin DMAB: p-dimethylamino benzaldehyde DMSO: Dimethyl Sulfoxide DPPH: 1, l-diphenyl-2 icrylhydrazyl EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GFP: Green Fluorescent Protein HA: Hyaluronic Acid HPLC: High Performance Liquid Chromatography OD: Optical Density SDS: Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfat PolyAcrylamide TCA: Tricloacetic UV: Ultra vỊiịỉẹr viện Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bring Bàng 2.1 Xác định đường cong chuẩn cùa tyrosine 14 Bang 2.2 Xác định đường cong chuan protein 15 Bàng 2.3: Công thức pha gel tách (12%) 18 Băng 2.4: Công thức pha gel cô (5%) 18 Bàng 2.5: Nồng độ chất ảnh hường đến hoạt tính protease 20 Bàng 2.6: Xác định kháng viêm cùa enzyme protease Xuân Hoa 21 Băng 3.1: Hàm lượng enzyme Xuân Hoa theo mùa 22 Báng 3.2: Tóm tắt q trình tinh protease từ Xuân Hoa 26 Bảng 3.3: Ket quà xác định hoạt tính quét gốc tự protease 34 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ so ĐƠ Hình Trang Hình 1.1: Cây Xn Hoa Hình 3.1: Sơ đồ làm protease từ Xuân Hoa 23 Hình 3.2: Tinh protease từ Xuân Hoa cột DEAE-Sephadex A-50.25 Hình 3.3: Điện di protein phân đoạn sau qua cột sac kí trao đồi ion DEAESephadex A-50trên gel polyacrylamit 12.5% 25 Hình 3.4: Tinh protease từ phân đoạn ống 12-16 cùa DEAE-Sephadex A-50 cột Sephacryl S-200 26 Hình 3.5 Kiểm tra hoạt tính protease cùa Xuân Hoa qua bước tinh 27 Hình 3.6: Phố điện di protein bước tinh enzyme 28 Hình 3.7: Phố điện di protein bước tinh enzyme 28 Hình 3.8: Ánh hường cùa Mercapetanol lên hoạt tính protease 29 Hình 3.9: Ảnh hường cúa NaiSiOi lên hoạt tính protease 29 Hình 3.10: Ảnh hướng EDTA lên hoạt tính protease 30 Hlnh 3.11: Ảnh hư0gỊCÙajHgOịl^âị^}.ựp^ìpriotẹệ$ẹ! Ị.Ị.jt xlẠj 31 Hình 3.12: Ánh hường cứa nhiệt độ lên hoạt tính protease từ Xuân Hoa 31 Hình 3.13: Ảnh hướng cúa pH lên hoạt tính protease từ Xuân Hoa 32 Hình 3.14: Tác dụng ức chế enzyme hyaluronidase cùa protease 33 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà MỞ ĐẦU Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radik thuộc họ Ơrơ Acanthaceae dùng dân gian để chữa nhiều bệnh như: nhiễm khuẩn tiêu hóa, trĩ, chan thương cháy máu, tiêu mủ vết thương Trong khoảng 15 năm gần đây, nhiều nhà khoa học Việt Nam giới xác minh số tác dụng sinh học thuốc như: kháng khuấn kháng nấm, tác dụng chống oxi hóa, giám huyết áp, hạ đường huyết, ức chế enzyme acetylcholinesterase Tuy nhiên việc nghiên cứu cấu trúc, đặc tính tác dụng dược lý chi tập trung vào nhóm chất thứ cấp cịn nhiều cơng dụng khác lưu truyền dân gian Xuân Hoa chưa chứng minh Trong năm gần đây, việc ứng dụng protease Y học nhà khoa học giới quan tâm Các nghiên cứu cho thấy protease có hiệu q điều hịa mien dịch, kháng viêm, tiêu cục máu đông, làm mau lành vết thương, chống tắc nghẽn mạch máu, chống ung thư Các nghiên cứu trước cúa cho thấy Xuân Hoa chứa hàm lượng lớn enzyme protease Cho đến chưa có nghiên cứu cách có hệ thống protease từ Xuân Hoa, chưa có nghiên cứu sâu tìm hiếu đặc lính sinh hóa chế tác dụng ứng dụng Y học cùa protease Do tiến hành thực đề tài: "Nghiên cún số tính chất sinh hóa tác dụng sinh học protease từ thuốc Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radik Đe tài nghiên cứu cần thiết, góp phần bổ sung thơng tin khoa học thuốc quý cùa Việt Nam Trong đề tài này, tập trung nghiên cứu nội dung sau đây: - Tinh protease từ thuốc Xuân Hoa p palatiferum (Ness) Radik - Xác dịnh số tính chất sinh hóa cúa protease tinh - Đánh giá số tác dụng sinh học cúa protease từ thuốc: hoạt tính quét gốc tự kháng viêm Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà CHUÔNG 1: TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MÔ TẢ THỤC VẬT CÂY XUÂN HOA Cây Xuân Hoa thuộc họ Acanthaceae, cịn có tên Tu Linh, Nhật Nguyệt hay Con Khỉ, Hoàn Ngọc, Thần dường sinh, Trác Mã, Điền Tích, Lan Điều Tên khoa học Pseuderanthemum Palatiferum Radik (Nees) Họ Ơ rơ (Acanthaceae) họ thực vật hai mam thực vật có hoa, chứa khống 250 chi khoảng 2.700 loài I Henrik Fischer w Jensen, 1988] Theo Phạm Hoàng Hộ [Phạm Hoàng HỘ.2000], chi Pseuderanthemum có khoảng 196 lồi, Việt Nam, chi Pseuderanthemum có lồi thứ Đề tài cùa chúng tơi kháo sát thành phần hóa học Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radik Mơ tá: Cây mọc cao từ l-2m sống lâu năm, thân xanh màu tím lục, già chuyên thành màu nâu, phân nhiêu nhánh, mọc dơi diện có hình mũi mác, dài từ 12-15cm, rộng 3,5-5cm, nếp nguyên, cuống dài -2,5cm, cụm hoa dài 10-16cm Hoa mọc kẽ đầu cành Hoa lưỡng tính, khơng BộphậndùĩM^11 Viện Đại học Mơ Hà Nội Phân bố: Cây Xuân Hoa mọc hoang nhiều nơi, coi thuốc q có uy tín dân gian tinh thành miền Bắc, thù đô Hà Nội Từ năm 1998, rộ lên việc trồng Xuân Hoa đế chữa bệnh thuộc nhóm bệnh đường tiêu hóa Hình 1.1: Cây Xn Hoa Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà 1.2 1.2.1 nhũng nghiên Cửu vê xuân hoa Kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa Năm 2005, bác sĩ Xuân Lục [Xuân Lục,2005] dưa số thuốc từ kinh nghiệm dân gian sừ dụng Xuân Hoa: • Chữa bệnh đường tiêu hóa (đi lỏng, rối loạn tiêu hóa, táo bón, đau bụng khơng rõ nguyên nhân); ăn từ 7-9 lá, khoảng 2-3 lần/ngày khỏi, có thê nâu canh nhạt đê ăn • Bệnh kèm theo chảy máu (chày máu dày, đường ruột, đái máu, phân máu kề că đái buốt, đái rắt, ): ăn đói sắc nước đặc đề uổng, có thề nau canh độ bát nhỏ Ăn 1-5 lần, máu cầm, nên ăn ngày lần • Các bệnh ung thư thời kì phát bệnh: ăn xong, đau giảm dần, người tinh táo, ăn ngừ tốt, có cảm giác khói bệnh Thử nghiệm qua số bệnh ung thư dày, gan, phổi, thấy có diễn biến tốt Lượng dùng thường xuyên theo mức độ đau thông thường ngày lan, lần 3-7 tùy theo hiệu giám đau • Các bệnh u phổi, tiền liệt tuyến: liều dùng trên, sau tuần triệu chứng giám bệnh nhân ăn ngụ tốt, Rịệng u\xơ tịền liệt tuyến, ăn vào cuối tháng, khống tháng liên tục • Các bệnh gan (xơ gan cổ trướng, viêm gan, ): ăn tươi ngày lan đói Bột khô với bột Tam thất theo ti lệ 1:1 thuốc trị xơ gan đặc hiệu • Bệnh thận (viêm thận cấp mãn, suy thận, tượng nước đái dục, dái máu): diều trị trôn sau I tuần Ăn lần/ngày, nước giãi chi nứa ngày tăng lên lần/ngày Trong thời gian nửa tháng, triệu chứng bệnh giảm rõ rệt • Chữa viêm loét (loét dày, hành tá tràng, đại tràng, trĩ nội ngoại, trực tràng, ): ăn tươi đói (tot nhát vào buổi sáng) Với vết thương thuộc phạm vi dày, chì cần ăn tuần, tránh uống rượu mạnh Khi chữa vết loét thuộc phần ruột, liều lượng cần nhiều tùy theo nặng, nhẹ • Điều chinh huyết áp, ổn định thần kinh: biến đối huyết áp (cao hay thấp) theo liều lượng trên, ăn xong chợp mát nghi thời gian ngấn, huyết áp trờ lại bình thường, lên rối loạn thần kinh thực vật, tùy theo mức độ đề định Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà liều lượng, ăn vào buổi sáng giúp thê ổn định ngày đề phòng thời tiết thay đối đột ngột • Chữa chấn thương (các loại chấn thương, đặc biệt chấn thương sọ não, va đập, gãy dập xương hay bắp thịt): thuốc có tác dụng cầm máu, khôi phục mô bị dập kháng viêm nhiễm, làm cà thuốc đắp thuốc uống Với vết thương kín nhai đế đắp, vết thương hở nên giã đế đắp • Chữa cám cúm: kéo theo rối loạn tiêu hóa, đau đầu, mệt mòi, nhiệt độ cao nên ăn cách giờ, sốt nhanh chóng hạ đồng thời rối loạn tiêu hóa khói Sau sốt, nên ăn cháo có thuốc trộn vào giúp cho người bệnh mau chóng trờ lại bình thường • Khơi phục sức khỏe: mệt mỏi toàn thân cần nâng cao sức chịu đựng cường độ cao, nên ăn liều đinh 5-7 trước nửa Trẻ lóng nên lấy từ -2 giã lấy nước cho uống 1.2.2 Nghiên cún thành phần hóa học Xuân Hoa Năm 2000, Nguyễn Thị Minh Thu cộng [Nguyễn Thị Minh Thu Trần Công Khánh 20001 dã cô lập hợp chất phytol P-sitostcrol hồn họp hai đồng phân stigmasterol poriferasterol P-sitosterol 3- p-ơ-D-glucopyranoside từ Xuân Hoa Năm 2003 Phan Minh Giang cộng [Phan Minh Giang, 2003] cô lập từ khô Xuân Hoa hợp chất 1-pentacosanol, palmitic acid, p-sitosterol, stigmasterol, hỗn hợp P-sitosterol 3-O-p-D-glucopyranoside stigmasterol 3-ơ-PD-glucopyranoside apigenin 7-ơ-P-D-glucopyranoside Năm 2004, Nguyễn Văn Hùng cộng [Nguyền Văn Hùng, 2004] cô lập tứ Xuân Hoa hợp chất 1-triacotanol, hexadecanoate glycerol, salicylic acid palmitic acid Năm 2005, Mai Đình Trị cộng [Mai Đình Trị, 2005] cô lập hợp chất từ Xuân Hoa bao gồm: P-amyrin, oleanolic, P-sitosterol stigmasterol, hỗn hợp hợp p-sitosterol 3-ơ-p-D-glucopyranoside stigmasterol 3ơ-P-D-glucopyranoside Năm 2007, Trần Kim Thu Liều [Trần Kim Thu Liều, 2007] cô lập từ Xuân Hoa hợp chất squalene, dotriacontane, phytol, palmitic acid, p- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà Từ kết trình bày báng 3.2 chúng tơi nhận thấy quy trình đế tinh protease từ Xuân Hoa (theo hình 3.1) cho chế phẩm enzyme có độ tăng gap 11,48 lan hoạt độ riêng ( 2,44 đv/ mg Pr) Protease sau tinh che qua giai đoạn khác kiếm tra hoạt tính đĩa thạch có chứa casein theo phương pháp mô mục 2.2.2 Kết quà hình 3.5 cho thấy protease qua bước tinh có hoạt tính mạnh Chúng tơi tiến hành kiếm tra protein hoạt tính protease qua bước tinh phương pháp điện di gel polyacrylamide (hình 3.6) Ket quà cho thấy sau tinh qua cột Sephacryl S- 200 cho băng protein có kích thước khoảng 80 KDa Hình 3.5 Kiểm tra hoạt tính protease Xuân Hoa qua bước tinh Nước cất, Enzyme qua tủa cồn, Enzyme qua Caỉ(PO4)2 Enzyme qua DEAE-Sephadex A-50, Enzyme qua Sephacryl S-200 27 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà Hình 3.6: Phổ điện di protein bước tinh enzyme 1-Dịch chiết 2- Tủa cồn 3- Qua Cữ}(PO4)2 4- QuacộtDEAE-^^ẹ^Sẹ-^ Đại học Mơ Hà Nộị 5- Qua Sephacryl S-200; 6- Maker protein Hình 3.7: Phổ điện di protein bước tinh enzyme I-Dịch chiết, 2- Tủa còn, 3-Qua Ca_ì(PO4)2, 4- Qua cột DEAE- Sephadex A-50, 5- Qua Sephacryl S-200 28 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà Kết điện di protease (hình 3.7) qua bước tinh khác cho băng hoạt tính 3.3 ẢNH HƯỜNG CỦA MỘT SĨ CHÁT HOẠT HĨA VÀ KÌM HÃM LÊN CHÉ PHÁM ENZYME PROTASE 3.3.1 Ảnh hưởng Mcrcapetanol lên hoạt tính protease Hoạt tính enzyme tương đối(%) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 Nồng độ mercapetanol (%) Hình 3.8: Ánh hưóngcúa Mercapetanol lên hoạt tính protease Kết hình 3.8 cho thấy Mercapetanol nồng độ 0.02 (%) có lác dụng hoạt hóa protease hoạt hóa tối đa nồng độ 0.08 (%) 3.3.2 Ánh hưõng Sodium thiosulfate (Na2S2O() lên hoạt tính protease Hoạt tính enzyme tương đối (%) Hình 3.9: Ánh hường Na2S2O.jlên hoạt tính protease 29 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà Kết hình 3.8 cho thấy NaiSiOi nồng độ 0.001 (M) có tác dụng hoạt hóa protease hoạt hóa tối đa nồng độ 0.015 (M) Qua kết trình bày hình 3.8; 3.9 chúng tơi nhận thấy hợp chất có tác động hoạt hoá protease từ Xuân Hoa hợp chất có tác dụng liên kết với nhóm SH cúa protease [Rawling, 1994] Vì có khả protease từ Xuân Hoa thuộc nhóm cysteine protease (trung tâm hoạt động cùa có chứa nhóm -SH), thuộc nhóm protease papain, ficin bromelain I Konno, 2004], Vì thời gian điều kiện kinh phí đề lài hạn chế chúng tơi chưa đánh giá ảnh hướng cúa chất ức chế đặc hiệu cystein protease đến hoạt động protease 3.3.3 Ánh hưỏTig EDTA lên hoạt tính protease Hình 3.10: Ánh hưởng EDTA lên hoạt tính protease Kết hình 3.10 cho thấy EDTA nồng độ 0.02 (M) có tác dụng hoạt hóa protease hoạt hóa tối da nồng độ 0.1 (M) EDTA ức che Mctalloproteasc protease từ Xuân Hoa khơng thuộc nhóm Metalloprotease 30 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà Hình 3.11: Ảnh hưỏng H2O2 lên hoạt tính protease H2O2 với nồng độ 0,2 M có tác dụng ức chế hoạt tính cùa protease từ Xuân Hoa ức chế 50 % hoạt tính nồng độ 0,5 M Ket quà phù hợp với kết quà tác già khác nghiên cứu chất có tác dụng ức chế enzyme thuộc nhóm cystcin protease [Rawling, 1994J 3.4 ẢNH HƯỞNỌiCỦA R^^ẬịNpỊ|JjỉỊƠ L^j HOẠT TÍNH PROTEASE Hình 3.13 cho thấy hoạt tính protease Xuân Hoa tinh mạnh vùng pH 7-8 Điều chứng tó protease Xuân Hoa thuộc loại kiềm yếu Tính chất tương tự protease tìm thấy papain từ nhựa đu đú (Carica papaya L Latex), bromelain từ dứa (Ananas Comususae) protease nghiên cứu gần từ Nicotiana tobaccum, Muraya koenigii, Moringa oleifera Coriandrum sativum [Sharmila, 2012J Hoạt tính tương đối (%) Hình 3.12: Ánh hướng cùa nhiệt độ lên hoạt tính protease từ Xn Hoa 31 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà Hoạt tính tương đối (%) Hình 3.13: Anh hưỏng pH lên hoạt tính protease từ Xuân Hoa Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hường đến hoạt độ cùa enzyme Kết quà hình 3.12 cho thấy nhiệt độ tối ưu protease từ Xuân Hoa cao 70°C, chứng tò protease bền nhiệt Tính chất bền nhiệt thuận lợi cho ứng dụng protease Y học Cơng nghệ Sinh học 3.5 NGHIÊN CỨU MỘT SƠ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA PROTEASE TINH SẠCH TÙ LÁ CÂY XUÂN HOA 3.5.1 Tác dụng ức chế enzyme hyaluronidase, kháng viêm protease Xuân Hoa 32 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà I Hình 3.14: Tác dụng ức chế enzyme hyaluronidase protease A Nồng độ ức chế enzyme hyaluronidase cùa protease tinh từ Xuân Hoa B Hình ánh phàn ứng màu sử dụng thuốc thử đặc hiệu DMAB xác định HA 1: đối chứng; 2: Phản ứng thủy phân HA; 3: Enzyme Xuân Hoa ức che hyaluronidase nồng độ 0.002 (U); 4: Enzyme Xuân Hoa ức chế hyaluronidc&iỉl&\AệAị''^fệỉlĩ.ỉ)Ò4i\^\(Etiz\>>Aie^'Xudn Hoa ức chế hyaluronidase nồng độ 0.008 (U); 6: Phán ứng enzyme Xuân Hoa ức che hyaluronidase nồng độ 0.016 (U) Hình 3.14 (A) cho thấy, protease Xuân Hoa nồng độ 0.002(U) có tác dụng ức che enzyme hyaluronidase ức che đến 50% hoạt động hyaluronidase nồng độ 0.016 (U) Kết quà cho thấy protease Xuân Hoa có kháng viêm bời việc ức chế hoạt động hyaluronidase Hyaluronidase thủy phân mucopolysaccharid loại acid hyaluronic mô liên kết Các nhà khoa học giới nghiên cứu chứng minh vai trò cùa enzyme thúc đay hoạt động nhân tố gây viêm mô Hoạt động hyaluronidase tăng lên bệnh viêm nhiễm, dị ứng, ung thư Phương pháp ức che hoạt động cúa hyaluronidase nhiều nhà khoa học giới sừ dụng đe xác định hoạt tính kháng viêm chất có hoạt tính sinh học [Ghiware, 2012; Trilochan, 2013] Papain từ nhựa đu đủ bromelain từ dứa protease từ thực vật 33 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà nghiên cứu ứng dụng Y học đế điều trị bệnh viêm [Maria,2013], 3.5.2 Đánh giá hoạt tính quét gốc tự cùa protease Xuân Hoa Bảng 3.3: Kết xác định hoạt tính quét gốc tụ ciía protease STT Tên mẫu ECso pg/nil Protease qua canxiphosphat >128 Tham khâo Resveratrol 8.3 Dựa vào bảng 3.3 cho thấy protease Xn Hoa khơng có tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH l.l-diphcnyl-2 icrylhydrazyl (DPPH) chất tạo gốc tự dùng để sàng lọc tác dụng chống oxi hóa cùa chất nghiên cứu Tuy nhiên, cần có thời gian dế nghiên cứu khà chong oxy hóa protease phương pháp khác Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội 34 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 1, KÉT LUẬN Chế phâm protease tinh từ Xuân Hoa có độ táng gap 11,48 lần so với hoạt tính protease dịch chiết thơ, hoạt tính đặc hiệu 2.44 (U/mg protein) có trọng lượng phân từ khoảng 80 KDa Đã nghiên cứu số tính chat sinh hóa protease: protease Xuân Hoa thuộc loại kiềm yếu Hoạt tính protease tinh mạnh vùng pH 7-8, nhiệt dộ tối ưu protease từ Xuân Hoa 70°C Các họp chat EDTA, NaiSjOi Mercapetanol có liên quan đến nhóm -SH tác động hoạt hố protease tinh từ Xn Hoa Vì có khă protease thuộc nhóm proteinaza cysteine protease (trung tâm hoạt động cùa có chứa nhóm -SH) Đã nghiên cứu số tác dụng sinh học protease tinh sạch: protease Xuân Hoa ức chế 50% hoạt động cùa hyaluronidase nồng độ 0.016 (Ư), khơng có hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH 2, KIÊN NGHỊ [hựy ieu uVjen Đại học MáJU Nội Cẩn tiếp tục ng hiên cứu anh hưởng cãc chat ức chê đặc hiệu để xác định xác protease từ Xn Hoa thuộc nhóm cystcin protease Cần tiếp tục nghiên cứu tác dụng sinh học khác cúa protease mô hình invitro invivo 35 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà TÀI LIỆU THAM KHẢO 11] Brand-Williams w., Cuveliver M E Bersct c (1995), “Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity”, Lebensmittel Wissenschaft und Technologic, 28, 25-30 [2] Đặng Thị Thu (2012), “ Công nghệ enzyme” NXB Khoa học, tr 233-299 [3] Dicu HK., Loc CB Yamasaki s (2006), “The effects of Pseuderanthemum palatiferum, a new medicinal plant, on growth performances and diarrhea of piglets”, Japa Agri Res Qua., 40 (1) pp 85-91 14] Garbin F., Harrach T., Eckert K Maurer H R (1994) "Bromelain proteinase F9 augments human lymphocyte-mediated growth inhibition of various tumor cells in vitro” Int J Oncol 5: 197-203 [5] Ghiware N.B., Aseemuddin N, Kawade R.M, Vadvalkar S.M (2012) “Pharmacological Exploration Of Saccharum offtcinarum Leave Extracts For Its Anti-Oxidant And Anti-Inflammatory Activity” International Journal of PharmTech Research Vol 4, No.4: 1785-1791 [6] Grabowska E., Eckert K Fichtner I Schulze-Forster K Maurer H R (1997) “Bromelain proteases suppress growth, invasion and lung metastasis of Bl6F10 mouse melanoma cells” Int J Oncol 11: 243-248 [7] Greenberg D.M; Winnick T, Ann.Rev.Biochem., 1945, 14, 31 [8] Henrik Fischer w Jensen, Soren Rosendal Jensen Bent Juhl Neilsen (1988), “Chemotaxonomy of the Acanthaceae Iridoids and quaternary amines”, Phytochemistry, 27 (8), pp 2581-2589 |9] Huang JR Wu cc, Hou RC, Jeng KC “Bromelain inhibits lipopolysaccharide- induced cytokine production in human THP-1 monocytes via the removal of CD 14" Immunological Investigations 2008; 37(4):263-77 [10] Indranil c, Usha s, Sanat K B Mangala L and Sadhan K D.A “Protease Isolated from the Latex of Plumeria rubra Linn (Apocynaceae) 2: Anti­ inflammatory and Wound-Healing Activities ’’.Tropical Journal of Pharmaceutical Research December 2011: 10 (6): 755-760 36 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà 111] Konno K Hirayama c Nakamura M Tateishi K Tamura Y, Hattori M, Kohno K Papain protects papaya trees from herbivorous insects: role of cysteine proteases in latex Plant J 2004 Feb;37(3):370-8 112] Lamport DT; JW Catt, “Plant carbohydrates II Encyclopedia of plant physiology”, 1982, 14B, 133-157 113] Lê Thị Lan Oanh, Võ Hoài Bắc, Nguyễn Vãn Thiết, Nguyễn Thị Dung, Hoa Thị Hằng, Trần Thị Thơm (1999), “Kháo sát so chi tiêu sinh hóa tác dụng thủy phân protein Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferuin (Nees)”, Tạp chí Dược liệu, 4(1), tr 13-17 114] Lê Ngọc Tú ( 2010), “Hố sinh cơng nghiệp”, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 31 [15] Leluk J, Pham Tran Chau, Kieleczawa.(1985) XXI Meet Pol Biochem Soc., Krakov, Abstract, 139 [16] Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent J Biol Chern 193 (1): 265-75 [17] Loew , Rep.U.S.Dep.Agric., 1900, 65 Hà Nội [18] Laemmli 119] Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng, Nguyễn Công Hào, Phan Phước Hiền (2005), “Triterpenoid steroid phân lập từ Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum, Acanthaceae”, Tuyến tập cơng trình Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hóa học Hữu Tồn quốc lần thứ ba, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 422-425 [20] Maria E Errasti, Néstor o Caffini, Lilian E Pelzer, Alejandra E Rotell Anti­ inflammatory Activity ofBromelia hieronymi: Comparison with Bromelain Planta Med2ữ\y, 79(03/04): 207-213 [21] Nath LK, Dutta SK Wound healing Response of the Proteolytic Enzyme Curcain Indian J.Pharmacol 1992; 24: 114-115 [22] Netti c., Bandi G L., Pecile A (1972) Antiinflammatory action of proteolytic enzymes administered orally compared with antiphlogistic compounds Pharmaco Ed Pr 8, 27: 453-466 37 II Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà [23] Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh Nguyễn Văn Hùng (2000), “ Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa", Tạp chí Dược Liệu, (6), tr 16 [24] Nguyễn Văn Hùng, Lê Anh Tuan, Nguyền Quyết Chiến (2004), "Nghiên cứu thành phan hóa học Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radik”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 2, tr 75-79 [25] Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh, Trần Vân Hiền, Tạ Thị Phòng, Trần Lê Dung (1999), “Thừ độc cấp diễn tác dụng háo vệ tế bào gan cùa Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radik ”, Tạp chí dược học, 9, tr 15-17 [26] Phạm Hồng Hộ (2000), “Cây có Việt Nam ”, NXB Tré, Tp Hồ Chí Minh, tr.67 [27] Phan Minh Giang, Hà Việt Báo, Phan Tống Sơn (2003), “Phytochemical study on Pseuderanthemum palatiferuni (Ness) Radik., Acanthaceae”, Tạp chí Hóa học, 41 (2), tr 115-118 [28] Phan Minh Giang, Hà Việt Bào, Phan Tống Sơn(2005), “Nghiên cửu hoạt tính chong oxì hóa kháo sát sơ hộ tác dụng kháng khuân, kháng nam cùa phần chiết giàu flavonoid ti^r Ịá (ỳậyỊ Xttqtf \^\euderaptliemum ^alatiferum (Ness) Radik.", Tạp chí dược học, 9, tr 9-12 [29] Peerawit Padee, Somsak Nualkeaw, Chusri Talubmook Supasorn Sakuljaitrong (2009), “Acute toxicity and sub-acute toxicity of Pseuderanthemum palatiferum", Isan Journal of Pharmaceutical Sciences, 5(1), pp 74-81 [30] Pietrowa JS Wincjunajte MM (1966) Opredelenie proteoliticheskoi aktivnosti fermentnykh preparatov mikrohiologicheskovo proiskhozhdenia, Priklad Biochem Mikro-bio, 232 [31 ] Phạm Thị Trân Châu Trần Thị Áng (2006) “Hoứ Sinh Học” NXB Giáo dục [32] Rabelo A.P.B., E.B Tambourgi, A Pessoa Jr (2004) Bromelain partitioning in two- phase aqueous systems containing PEO-PPO-PEO block copolymers, J Chromatogr., B 807, p 61-68 [33] Reissig J.L, Jack L Strominger and Luis (1955) A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars J Biol Chern., 217:959-966 [34] Rawlfng, N D., and Barrett, A J (1994) Families of cysteine peptidases, Methods Enzymol 244, 461-485 38 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà |35 ] Sharmila s, Rebecca L J, Merina p D, Saduzzaman Md Isolation and partial purification of Protease from plant Journal of Chemical and leaves Pharmaceutical Research, 2012, 4(8):3808-3812 [36] Trần Kim Thu Liều, Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), “Contribution to the study on chemical constituents of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radik (Acanthaceae)”, Tuyến tập cơng trình Hội nghị Khoa học vể Cơng nghệ Hóa học Hữu Toàn quốc lần thứ tư NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 426-429 [37] Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Thị Thanh Nhài, Lê Mai Hương (1998), “Góp phần nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học Xuân hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk,Acanthaceae”, Tạp chí Dược liệu, (2), tr 37-42 [38] Trilochan s, Prasanna KP (2013) Evaluation of Invitro Antioxidant, Anti Inflammatoryand Anti diabetic Potential of Curcumin Indo American Tournal of Pharmaceutical Research, Vol 3, Isue 3: 2808-2818 [39] Veremeenko KN Dosenko VE, Kizim AL Terzov AI The mechanism of the curative action of sỵẹt^ìùc e^ytneiltprapy ^ikJSprava 2000; 2j(^):3-l (A Russian scientifically refereed medical paper) [40] Xuân Lục (2005), “Cây thuốc diệu kỳ, Tu lình, thuốc nhiều tên nhiều tác dụng”, Tạp chí dược liệu sức khóc cộng đồng, 2, tr.22-23 [41] Wararut Buncharoen, Supap Saenphet, Kanokporn Saenphet (2010), “Acetylcholinesterase inhibitory effect of Pseuderanthemum palatiferum in albino rats" Trends Research in Science and Technology, 2(1), pp 13-18 39 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đtròng chuẩn tyrosine OD 660 (nm) Phụ lục 2: Dưòng chuẩn protein 40 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Hà Phụ lục 3: Phưong trình hồi quy tuyến tính HA Phụ lục 4: Đồ thị tương quan giưa mật độ quang học nồng độ DPPH 41 ... sinh hóa chế tác dụng ứng dụng Y học cùa protease Do tiến hành thực đề tài: "Nghiên cún số tính chất sinh hóa tác dụng sinh học protease từ thuốc Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radik... dụng protease Y học Công nghệ Sinh học 3.5 NGHIÊN CỨU MỘT SÔ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA PROTEASE TINH SẠCH TÙ LÁ CÂY XUÂN HOA 3.5.1 Tác dụng ức chế enzyme hyaluronidase, kháng viêm protease Xuân Hoa. .. THỰC VẬT CÂY XUÂN HOA 1.2 NHŨNG NGHIÊN cửu VÈ CÂY XUÂN HOA 1.2 1.3 ỉ Kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa 1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa 1.2.3 Nghiên cứu dược tính