Nghiên cứu điều kiện lên men và thu hồi một số hoạt chất sinh học của chủng nấm cordyceps militaris FNA5

VIỆN ĐẠI HỌC MỎ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -oOo KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Đề tó/.NGHIÊN CỨU ĐIÊU KIỆN LÊN MEN VÀ THU HƠI MỘT SỚ HOẠT CHẤT SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Cordyceps militaris FNA5 Giáo viên hướng dẫn: TS Phí Quyết Tiến TS Phạm Thanh Huyền Sinh viên: Nguyễn Thị Thu Hiền Lớp: 1302 Hà Nội -2017 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i DANH MỤC BÁNG iv DANH MỤC HÌNH V DANH MỤC VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 1.1.1 1.1.2 1.2 Giới thiệu chúng nấm Đông trùng hạ tháo Sơ lược lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thào Sự phân bố cùa nấm Đông trùng hạ tháo tự nhiên Một số chất có hoạt tính sinh học từ nấm Đông trùng hạ thảo 1.2.1 Cordyccpin 1.2.2 Adenosine 1.2.3 Polysaccharide 1.2.4 Các hợp chất khác 10 1.3 Giá trị dược liệu hoạt chất sinh học tới sức khỏe người 12 1.4 ứng dụng cơng nghệ lên men chìm nấm Cordyccps spp đế sản xuất sinh khối exopolysaccharide (EPS) 14 1.5 Thu hồi sinh khối hoạt chất từ Cordyceps spp 17 1.6 Tình hình nghiên cứu nam Đơng trùng hạ tháo vàngồi nước 18 1.6.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo giới 18 1.6.2 Tình hình nghiên cứu nấm Đơng trùng hạ tháo Việt Nam 19 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 2.1 Vật liệu nghicn cứu 20 2.1.1 Chúng giống 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 20 2.1.4 2.2 Môi trường nuôi cấy 20 Phương pháp nghiên cứu 21 Nguyễn Thị Thu Hiền ii Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 2.2.1 Phương pháp báo quán giống 21 2.2.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy 21 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển cứa nấm 22 2.2.3.1 Nhiệt độ lên men 22 2.2.3.2 pH môi trường lên men 22 2.2.3.3 Tý lệ tiếp giống 23 Phương pháp xác định chất có hoạt tính dược học nấm Đông tràng 2.2.4 hạ thào 23 2.2.4.1 Xác định Cordycepin 23 2.2.4.2 Xác định Polysaccharide 24 Nghiên cúư tách chiết chất có hoạt tính sinh học từ chúng nấm 25 2.2.5 2.2.5.1 Phương pháp tách chiết Cordyccpin 25 2.2.5.2 Phương pháp tách chiết Polysaccharide 26 3.1 Đặc điểm sinh học chủng nấm ký sinh côn trùng 27 3.2 Lựa chọn mơi trường nhân giống thích hợp 28 3.3 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp 31 3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trường phát triển chúng nấm 32 3.4.1 Anh hướng nhiệt độ 33 3.4.2 Ánh hưởng pH môi trường ban đầu 34 3.4.3 Ánh hướng nong độ 36 3.4.4 Ảnh hường thể tích 38 3.5 Nghiên cứu lên men sinh tống hợp chất có hoạt tính sinh học cùa chúng nấm (trong hệ thống binh lên men lít) 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Nguyễn Thị Thu Hiền iii Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bàng phân loại khoa học Bàng 1.2 Mơ tả hình thái số loài nấm thuộc chi Cordyceps Bảng 3.1 Đặc điêm sinh học cùa chúng nâm ký sinh côn trùng 27 Bảng Hình thái khuẩn lạc chùng nấm c militaris FNA5 môi trường khác theo thời gian nuôi cấy 28 Bảng 3 Khả phát triên chùng c miìitaris FNA5 nhiệt độ khác theo thời gian (đường kính khuẩn lạc, cm) 33 Bảng Lượng sinh khối thu chùng c militaris FNA5 giá trị pH khác theo thời gian 35 Báng Lượng sinh khối thu chúng c militaris FNA5 giá trị nồng độ khác theo thời gian 37 Báng Lượng sinh khối thu chủng c militaris FNA5 giá trị thể tích khác theo thời gian 39 Nguyễn Thị Thu Hiền iv Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm Đơng trùng hạ thào lồi Corđyceps militaris Hình 1.2 Một số hình thái chúng nấm thuộc chi Cordyceps Hình 1.3 Hình thái tự nhiên số lồi nấm :A- c sinensnis; B-C gunnii; C-C barnesii; D- c gracilis; E- c Uangshanensis; F-C militaris Hình 1.4 Cấu trúc hóa học cùa Cordycepin Adenosine Hình 3.1 Hình ánh bề mặt khuấn lạc chúng FNA5 đĩa thạch sau 15 ngày nuôi cấy 28 Hình 3.2 Hình thái túi bào tử lúc nẩy mầm bào tử trưởng thành chùng FNA5 sau 10 ngày nuôi cấy (SEM, X 3.500 7.500 lần) 29 Hình 3 Hình thái khuẩn lạc chủng c militaris FNA5 môi trường rắn theo thời gian nuôi cấy 29 Hình Biếu đồ đường kính khuẩn lạc chúng c militaris FNA5 mơi trường khác theo thời gian (đường kính khuẩn lạc, cm) 31 Hình 3.5 Biểu đồ ánh hưởng cúa môi trường khác tới phát triển chúng c militaris FNA5 theo thời gian ni cấy 31 Hình 3.6 Biếu đồ ánh hướng cùa môi trường khác tới sinh EPS chủng c militaris FNA5 theo thời gian ni cấy 31 Hình 3.7 Hoạt tính đối kháng chùng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa CNLM dịch sau lên men chùng c militaris FNA5 môi trường MPA theo thời gian nuôi cấy 32 Hình 3.8 Ảnh hưởng cúa nhiệt độ tới phát triến chúng nấm FNA5 đĩa petri sau ngày 33 Hình Khá sinh trưởng phát triến cùa nấm c militaris FNA5 giá trị pH khác .35 Hình 10 Hàm lượng EPS thu chủng c militaris FNA5 giá trị pH khác theo thời gian 36 Nguyễn Thị Thu Hiền Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Hình 11 Khà sinh trướng phát triển cùa nấm c mỉlỉtaris FNA5 tý lệ giống 37 Hình 12 Hàm lượng EPS thu chững c militaris FNA5 giá trị nồng độ khác theo thời gian 38 Hình 13 Khả sinh trưởng phát triến nấm c militaris FNA5 thể tích khác 38 Hình 14 Hàm lượng EPS thu chủng c militaris FNA5 giá trị tích khác theo thời gian 39 Hình 15 Chu kỳ sinh trướng cùa chúng c miỉitaris FNA5 thời gian 18.5 ngày 40 Hình 16 Kết đo phố xác định hàm lượng cordycepin dịch lên men chúng nấm c militaris FNA5 41 Nguyễn Thị Thu Hiền vi Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH-1302 DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung EPS Exopolysaccharide (Extracellular polysaccharide) Polysaccharide ngoại bào rpm Tốc độ lắc vịng/phút w/v Khối lượng/thể tích w/w Khối lượng/ khối lượng HPLC High Performance Liquid Chromatography Nguyễn Thị Thu Hiền vii Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 MỞ ĐÀU Đặt vấn đề Nấm Đông trùng hạ thảo loại nấm ký sinh côn trùng, không nhà khoa học nghiên cứu, mà xã hội quan tâm đến, nấm loại dược liệu quý, tốt cho sức khỏe người, phù hợp với lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thiếu niên, người già Theo tài liệu ghi chép đông dược cố, Đông trùng hạ tháo vị thuốc bồi bồ q giá, có tác dụng tích cực bệnh rối loạn tình dục, thận hư, liệt dương, đau lưng, mói gối, ho hen, có tác dụng tốt trẻ em còi xương chậm lớn Một số nghiên cứu gần chi nấm Đơng trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cường công cúa tuyến thượng thận, thiện chức thận, nâng cao lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư chất phóng xạ Trên giới, nấm Đơng trùng hạ thào nhà khoa học nghiên cứu thu nhiều thành tựu có giá trị Với cơng nghệ sinh học tiên tiến, nhiều nước thành công việc nuôi cấy nhân tạo chủng nấm thuộc chi Cordyceps thương mại hóa sản phàm cùa chúng.Hiện nay, với phương pháp lên men sử dụng chủ đạo, sản phẩm thương mại sinh khối nấm ký sinh sán xuất thành công Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ Các chất chiết xuất sau trình lên men chứa đầy đú hợp chất có hoạt tính sinh học tương tự nấm ký sinh nguồn gốc tự nhiên Ớ Việt Nam việc nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thào vần cịn gặp nhiều khó khăn cá sở vật chất kiến thức Chúng ta sử dụng yếu dựa khai thác tự nhiên hay nhập từ Trung Quốc, nguồn gốc chất lượng không rõ ràng, giá cá đắt đỏ không đáp ứng nhu cầu cho xã hội Nguyễn Thị Thu Hiền Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Đế góp phần vào nghiên cứu phát triển nâng cao thị trường sán xuất nấm dược liệu Đông trùng hạ thảo Việt Nam, thực đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men thu hồi số hoạt chất sinh học chùng nấm Cordyceps militaris FNA5 Với mục đích tìm điều kiện ni cấy phù hợp nhằm tạo hợp chất có hoạt tính sinh học chủng nấm Cordyceps militarisFNNS Đồng thời đóng góp phần nhỏ bé việc xây dựng công nghiệp dược nước Mục tiêu nghiên cứu cua đề tài Xác định số điều kiện lên men nấm Cordyceps miỉitaris FNA5 điều kiện thu hồi số dược chất polysaccaridc, cordyccpin từ sinh khối dịch lên men nấm nhằm ứng dụng sản xuất thực phấm chức Đối tượng nội dung nghiên cửu đề tài a Đối tượng nghiên cứu - Chúng nấm Cordyceps militaris FNA5phân lập Việt Nam, nhận từ sưu tập giống cúa phịng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam b Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu số điều kiện lên men (môi trường, tỷ lệ tiếp giống, sục khí, pH ) chủng nấm Cordyceps militaris FNA5 quy mơ lít/mẻ để sinh tổng hợp cordycepin, polysaccharide - Nghiên cứu điều kiện tách chiết thu hồi chất có hoạt tính sinh học cordycepin, polysaccharide Nguyễn Thị Thu Hiền Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 CHƯƠNG I TĨNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giói thiệu chủng nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1 So’ lược lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Hàng ngàn năm nay, Đông trùng hạ tháo (Cordyceps) coi thần dược y học cổ truyền Việt Nam Trung Quốc.Trong y học cổ truyền Trung Quốc, “Đông Trùng, Hạ Tháo” dùng đế chừa bệnh phối hô hấp, thận, gan, tim mạch; trị bệnh yếu sinh lý cao huyết áp; trị rối loạn miền dịch chống ung thư (Zhou et al., 1998a,b).Tại viện Nghiên cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc), nấm Đông trùng hạ thào dùng để chừa liệt dương có hiệu tốt Vì vậy, nấm đơng trùng hạ tháo người Trung Quốc xem loại dược tào quý, chi dùng cho vua chúa người giàu Nấm Cordyceps giống nấm túi, nhà khoa học Trung Quốc phát lần vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu quý thực chất ấu trùng loài bướm thuộc chi Thitarodes Hepialus bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc ký sinh (Bàng 1.1.) Bảng 1.1 Băng phân loại khoa học Giói (Regnum) Fungi Ngành (phylum) Ascomycota Lớp (Class) Ascomycetes Bộ (Ordo) Hypocreales Họ (Familia) Clavicipataceae Chi (Genus) Cordyceps Loài (Species) c miìitaris Đơng trùng hạ thảo cịn có tên gọi khác Trùng thảo hay Hạ thào đông trùng Chi nấm Cordycepsgồm khoảng 400 loài miêu tả, riêng Trung Quốc tìm thấy 60 lồi (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006) Nguyễn Thị Thu Hiền Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Kết quà cho thấy, 25°c nhiệt độ tối ưu cho phát triến cùa sợi nấm Ở nhiệt độ cao 30°C, 37°c ức chế phát triển chủng nấm FNA5, nhiệt độ thấp 15°c 20°C chùng sinh trường phát triền chậm (Hình 3.8 Bảng 3.3) Theo Sung cộng (1999, 2002), Gao cộng (2000) trinh giảm mạnh tăng nhiệt độ 25°c, kết quà thu gần tương đương với kết nghiên cứu trước 3.4.2 Ảnh hưởng pH mơi trường ban đầu Trong nhiều nghiên cứu, giá trị pH đầu ảnh hưởng khơng nhị đến sinh trưởng sinh tổng hợp chủng giống Trong đó, pH mơi trường đầu tác dụng đến sinh trương cùa chúng giống phát triến sinh hoạt chất quý polysaccharide, cordycepin, adenosine Do đó, chúng tơi sử dụng mơi trường thích hợp thay đồi giá trị pH môi trường nuôi cấy ban đầu, kết trình bày Báng 3.4 Hình 3.9- 3.10 Hình Khá sinh trường phát triến cùa nấm c militaris FNA5 giá trị pH khác Nguyễn Thị Thu Hiền 34 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Hình 10 Hàm lượng EPS thu chúng c militaris FNA5 giá trị pH khác theo thời gian Bảng Lượng sinh khối thu chủng c militaris FNA5 giá trị pH khác theo thời gian Thời gian Sinh khối khô dịch lên men thay đổi giá tri pH ban đầu (g/1) 5,5 ngày 25 30 ngày 15 25 25 ngày 20 40 45 ngày 25 30 40 ngày 20 25 ngày 20 15 6,5 35 10 20 20 25 10 45 30 25 45 35 25 35 35 25 20 20 25 15 15 Các nghiên cứu trước chi pH mơi trường có ý nghĩa định, có tác động sâu sắc tới trình trao đổi chất vi sinh vật Giới hạn hoạt động cùa chúng nấm c militaris FNA5 khoáng pH 5,5-6,5, với khoảng pH phù hợp với hoạt động củ nhiều loại enzyme có thể nấm Việc xác định pH thích hợp ban đầu cho q trình ni cấy việc tri pH can thiết suốt thời gian sinh trưởng cúa tế bào, giúp cho trình sinh trưởng sinh sinh hợp chất sinh học tốt nhất, Nguyễn Thị Thu Hiền 35 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 nghiên cứu cho thấy pH thích hợp khống 5,5- 6,5 cho lượng sinh khối hàm lượng EPS thu cao Kháo sát sát với nghiên cứu cùa Sung cộng (2006) kết thu pH khoáng 6,0-6,5 3.4.3 Ảnh hưởng nồng độ Tỳ lệ giống gốc cấy vào môi trường dịch thể yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng giống, tới mật độ kích thước cùa khuấn lạc cầu Trong nghiên cứu giống trung gian nấm c militarìs FNA5 tý lệ giống cấy tính theo tý lệ với mơi trường ni cấy Các mức độ giống cấy cho môi trường bao gồm: %; 2%, 3%, 4%, 5% giống so với môi trường ni cấy Hình 11 Khả sinh trường phát triển cứa nấm c miỉitaris FNA5 tý lệ giống khác Nguyễn Thị Thu Hiền 36 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Hình 12 Hàm lượng EPS thu chủng c militaris FNA5 giá trị nồng độ khác theo thời gian Bảng Lượng sinh khối thu chủng c miỉitaris FNA5 giá trị nồng độ khác theo thời gian Sinh khối khơ thu đưọc có thay đổi tỷ lệ tiếp giống (g/1) Thòi gian 1% 2% 3% 4% 5% ngày 10 10 15 10 10 ngày 10 20 15 20 15 ngày 20 20 15 15 15 ngày 25 25 20 20 10 ngày 30 20 20 25 20 ngày 20 15 10 25 Sự lưu thông dịng chảy cúa mơi trường lóng bị ảnh hướng mạnh sinh khối sợi nấm (Hwang et al., 2004), cấy mật độ lớn dẫn đến gia tăng lớn độ nhớt mơi trường q trình lên men, gây khó khăn cho việc hấp thụ dinh dưỡng trao đôi oxy Đối với trạng thái hỉnh dạng sợi nấm tồn môi trường ni cấy, nấm phát triển dạng viên có xu hướng nhớt hon so với dạng phát triền dạng sợi phân tán (Gibbs et al., 2000) Các nghiên cứu cúa tác giá trước phù hợp với kết Nguyễn Thị Thu Hiền 37 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 nghiên cứu này, cấy lượng giống lớn so với môi trường, dịch thường có dạng huyền phù cao, khó khăn cho lưu thông cùa dịch Ket cho thấy, cấy mật độ 1% giống cho sinh khối sợi cao (30 g/1.000 ml) thu hàm lượng EPS cao 1.598 mg/l, khuấn lạc cầu đồng đều, dịch không bị kết vón cấy mật độ 4% 5% dịch ni cấy có xu hướng chuyến dạng huyền phù, khí lưu thơng khó khăn, khuẩn lạc cầu thường kết vón với nhau, sinh khối sợi khơng tăng mà có xu hướng giảm, chủng sinh trướng phát triển chậm, cấy mật độ 2% 3% thi lượng sinh khối sinh (Hình 3.11- 3.12 Báng 3.5) 3.4.4 Ảnh hưỏng thể tích Tốc độ thơng khí thời hạn định ảnh hướng tới phát triển chúng nấm, làm tăng khả phát triển thể rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao sinh khối Cung cấp khí tạo chất chuyển hóa thứ cấp đồng nghĩa với thúc chuyển hóa chất, tạo sán phấm hịa tan oxy Chúng nghiên cứu ảnh hưởng thơng khí tới sinh trướng phát triến cùa chúng c militaris FNA5 Kết quà khối lượng sinh khối tính thể Hình 3.13-3.14 Bàng 3.6 Hình 13 Khá sinh trưởng phát triến cúa nấm c militaris FNA5 thổ tích khác Nguyễn Thị Thu Hiền 38 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Hình 14 Hàm lượng EPS thu chúng c militaris FNA5 giá trị thể tích khác theo thời gian Bảng Lượng sinh khối thu chủng c militaris FNA5 giá trị thể tích khác theo thời gian Sinh khối khơ thu có thay đổi thể tích bình (g/I) Thời gian 100ml 150ml 200ml 250ml ngày 10 10 15 10 ngày 15 15 15 20 ngày 25 15 30 30 ngày 20 25 20 25 ngày 20 35 10 20 ngày 10 50 10 10 Độ thơng khí môi trường tạo điều kiện sinh trưởng phát triển chủng đồng nghĩa với việc thúc chuyến hóa chất Tùy thuộc vào chủng mà yêu cầu độ thơng khí khác Ở thí nghiệm cho thấy chúng c.militaris FNA5 cho hàm lượng EPS đạt giá trị cao 1565 mg/1 lượng sinh khối đạt 50g/l độ thơng khí tương đương 150ml dịch/binh 500ml Nguyễn Thị Thu Hiền 39 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 3.5 Nghiên cứu lên men sinh tổng họp chất có hoạt tính sinh học chủng nấm (trong hệ thống bình lên men lít) Chu kỳ sinh trướng cùa giống nấm trái qua giai đoạn: Giai đoạn tiềm tàng, giai đoạn tăng trướng (pha tăng tốc: mật độ tế bào bắt đầu tăng; pha tăng trưởng cực đại; pha tăng trưởng chậm), giai đoạn ổn định giai đoạn suy tàn Giống dịch có tốc độ sinh trường nhanh, việc xác định thời gian sợi nấm đạt đến giai đoạn hoạt lực khóe nhất, sinh khối cao quan trọng Trong thí nghiệm này,chúng tơi định kỳ lấy giống nấm giai đoạn tuổi giống khác (12 lần) đồ quan sát Kct thu Hình 3.15 Hình 15 Chu kỳ sinh trưởng chủng c nùlitaris FNA5 thời gian 18,5 ngày Kết (Hình 3.15) nhận thấy hệ sợi nấm thời gian 8-9 ngày có sức sống khỏe nhất, khuẩn lạc cầu có thời gian mọc sợi nhanh Càng sau sợi hình cầu có biếu giảm liên kết bám hết vào thành bình Từ kết ta thấy hàm lượng EPS thu nhiều 1593 mg/1 với lượng sinh khối khô thu 30g/l pH Nguyễn Thị Thu Hiền 40 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Chúng tơi dùng phương pháp HPLC đê xác định hàm lượng Cordycepins có dịch lên men kết (Hình 3.16) cho thấy hàm lượng Cordycepin tăng dần theo thời gian tới ngày thứ 20 đạt giá trị cao với hàm lượng đạt 0,82 pg/ml Hình 16 Kết đo phố xác định hàm lượng cordycepin dịch lên men chúng nấm c militaris FNA5 So sánh với nghiên cứu cùa Biochim cộng năm 1960 cho thấy, kết nghiên cứu cùa nhóm chủng thuộc lồi c militaris có hàm lượng cordyccpin từ 25- 100 mg mồi lít mơi trường Sán lượng cordycepin đế tống hợp tốt đòi hỏi khoảng 20 ngày sau thu hoạch Trong mẫu chủng nấm c miỉitaris FNA5 đạt hàm lượng cordycepin dịch lên men 0,82pg/ml Như vậy, có the thấy hàm lượng cordycepin có dịch lên men sinh khối tươi chủng c militarỉs FNA5 sau 20 ngày lên men chưa cao nghiên cứu công bố Tuy nhiên, kết quan nghiên cứu lên men chìm chủng nấm Đông trùng hạ thào phân lập Việt Nam cho định hướng thu hồi chất có hoạt tính dược học cordycepin Nguyễn Thị Thu Hiền 41 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 CHƯƠNG IV KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KÉT LUẬN I Đã chọn môi trường thích họp cho nhân giống mơi trường MT3 mơi trường lên men thích hợp (g/1): glucose 10; peptone 6; KH2PO4 1; K2HPO4 1; MgSO40,5 Đã lựa chọn điều kiện cho lên men nấm c miỉitaris FNA5: nhiệt độ 25°C; pH ban đầu 5,5- 6,5; tý lệ giống 1%; tý lệ dịch lên men/thế tích bình 150/500 (v/v) Đã khảo sát động thái lên men chúng c militaris FNA5 bình lên men lít Thời gian thích họp để thu nhận polysaccharide dịch lên men cao 1593 mg/1 sinh khối khô 30 g/1 sau ngày lên men KIẾN NGHỊ Tiếp tục tiến hành nghiên cứu thu hồi hoạt chất sinh học khác có chủng nấm c militaris FNA5 Ket quă nghiên cứu đạt tiền đề, sở cho việc nghiên cứu chúng nam khác thuộc chi Cordyceps Nguyễn Thị Thu Hiền 42 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đái Duy Ban Lưu Tham Mưu Nhà xuất bàn y học (2009) Đông trùng hạ thào, dược liệu hồ trợ điều trị bệnh virus, ung thư, HIV/AIDS, đái tháo đường, suy giám tinh dục nghiên cứu phát loài đông trùng hạ thào Việt Nam Nguyễn Lân Dũng, Nguyền Liên Hoa, Lê Hoàng Yến, Nguyền Văn Băc (2006) Chương trình vi sinh vật học- Nấm sợi Trịnh Tam Kiệt tác giá (2001) Danh mục loài thực vật Việt Nam (phần Nấm) Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, Nguyền Mạnh Hà (2012) Nghiên cứu đặc điếm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết chủng nam Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr) Link Pham Quang Thu (2009) Điều tra phát nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps nutans Pat Phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Từ, Sơn Động, Bắc Giang Tạp chi NN&PTNT4: 91-94 Phạm Quang Thu (2009) Phát nấm ký sinh côn trùng vườn quốc gia Tam Đáo tinh Vĩnh Phúc Tạp chí NN&PTNT 6: 96-99 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân (2009) Nghiên cứu đặc điềm hình thái sinh trưởng hệ sợi nuôi cấy khiết số lồi nấm ký sinh trùng Tạp chí NN&PTNT 11: 97-102 Tiếng Anh Ahn YJ, Park SJ, Lee SG, Shin se, Choi DH (2000) Cordyccpin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp J Agric Food Chern 48:2744-2748 Berkeley, M.J 1843 On some entomogenous Sphaeriac.Hooker’s London Journal of Botany 2:205-211 Cha SH, Lim JS, Yoon cs, Koh JH, Chang HI, Kim sw (2007) Production of mycclia and exo-biopolymcr from molasses by Nguyễn Thị Thu Hiền 43 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Cordyceps sinensis 16 in submerged culture Bioresour Techno! 98: 165-168 Chen L.T., Cao H.F & Huang W.F, 2005 Components, pharmacological activities and application of Cordyceps militaris, Modern Food Science 21 (3) 192-195 Kim H, Yun JW (2005) A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures Journal ofApplied Microbiology 99: 728-738 Kim sw, Hwang HJ, Park JP, Cho YJ, Song CH, Yun JW (2002) Mycelial growth and exo-polymer production by submerged culture of various edible mushroom under different media Lett Appl Microbiol 34:56-61 Klaunig JE, Kamendulis LM (2004) The role of oxidative stress in carcinogenesis Annu Rev Pharmacol 44: 239-267 Cui JD, Zhang BZ (2010) Comparison of culture methods on exopolysaccharide production in the submerged culture of Cordyceps militaris and process optimization Letters in Applied Microbiology 52: 123-128 Shashihara MG, Giridharc p, Udaya SK, Manohar BI (2013) Bioactivc principles from Cordyceps sinensis' A potent food supplement - A review Journal offunctionalfoods 910-8507 10 Shin KH, Lim ss, Lee s, Lee YS, Jung SH, Cho SY (2003) Antitumour and immuno-stimulating activities of the fruiting bodies of Paecilomyces japonica, a new type of Cordyceps spp Phytother Res 17:830- 11 Shrestha B, Zhang w, Zhang Y, Liu X (2010) What is the Chinese caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis (f)phiocordycipitaceae\ Mycology 1:228-36 12 Song JF, Liu CQ, Li DJ, Jin BQ (2007) Chern Technol Biotechnol 82 Nguyễn Thị Thu Hiền 44 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 13 Sun Y, Zhang X, Lei p (2003) Study on character for separation and extraction of polysaccharide from hyphae of Cordyceps sinersis Acta Chinese Medicine and Pharmacology, 2,3 14 Wang YJ, Li DW, Kwang YC, Zheng TT (2005) Acta Bot Borca.Occident Sin 25 15 Won SY, Park EH (2005) Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris J Ethnopharmacol 96: 555- 561 16 Xiao JH, Chen DX, liu JW, Liu LZ, Wan WH, Fang N, Xiao Y, Qi Y, Liang ZQ (2004) Optimization of submerged culture requirements for the production of mycelial growth and exopolysaccharide by Cordyceps jiangxiensis JXPJ 0109 Journal of Applied Microbiology 96: 1106-1116 !7 Xuanwei z, Gonga Zhenghua, Sua Ying, Linb Juan, Tang K (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and development products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61(3): 279-291 18 Yang FC, Ke YF, Kuo ss (2000) Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures Enzyme Microh Technol 27: 295-301 19 Yang JK, Wang WQ, Ma HL, Wu JY (2013) Sulfation and enhanced antioxidant capacity of an exopolysaccharide produced by the medicinal fungus Cordyceps sinensis Molecules 18: 167-177 20 Zhoua X, Gonga z, Sua Y, linb J, Tang K (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61(3): 279-291 2LKamble V.R and Agre D.G., 2012 Reinvestigation of insect parasite fungus Cordyceps militaris from Maharashtra Bionano Frontier 5(2):224-225 22 Park JP, Kim sw, Hwang HJ, Choi YJ, Yun JW (2002) Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris Enzyme Microh Technol 31: 250-255 Nguyễn Thị Thu Hiền 45 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 23 Liu YS, Wu JY (2012) Effects of Tween 80 and pH on mycelial pellets and cxopolysaccharidc production in liquid culture of a medicinal fungus Journal of industrial microbiology & biotechnology 39 (4): 623-628 24 Che ZM (2003) Assessment on edible safety of artificially cultivated Cordyceps militaris fruiting bodies Edible Fungi 25(3): 45^16 25 Das SK, Masuda M, Mikio s (2010) Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects Fitoterapia 81:961968 26 Hardeep ST, Sardul s, Sharma AK (2014) Pharmacological and therapeutic potential of Cordyceps with special reference to cordycepin Biotech 4(1): 1-12 27 Huang NL, Lin ZB, Chen G.L (2010) Medicinal and edible fungi Shanghai Scientific and Technological Literature, Shanghai 28TIui LJ, Hao BH, Chu c, Ọin L, Ping L (2011) Morphological and microscopic identification studies of Cordyceps and its counterfeits Acta Pharmaceutica Sinica B 3: 189-195 29 Kobayasi Y (1982) Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella 30 Kim H, Yun JW (2005) A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures Journal of Applied Microbiology 99: 728-738 3LKlaunig JE, Kamendulis LM (2004) The role of oxidative stress in carcinogenesis Annu Rev Pharmacol 44, 239-267 32 Mao XL (2000) The macrofungi in China Henam Technical and Science Publication House 33 Mina M, Eriko Ư, Akihiko Si, Mikio s (2005) Production of cordyccps by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris Chemistry and Biotechnology Japan 910-8507 34 Lo HC, Chienyan H, Fang YL and Hsu TH (2013) A systermatic review of the mysterious catcrpillcr fungus OphioCordyceps sinensis in DongChongXiaXao and Related Bioactive incredients Journal of Traditional and Complementary medicine 3(1): 16-32 Nguyễn Thị Thu Hiền 46 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 35 Gao X.H., Wu w., Qian G.C., 2000 Study on influences of abiotic factors on fruitbody differentiation of Cordyceps militaris Acta Agriculture Shanghai 16: 93-98 36 Lu LX, Xu Q, Liu ZH, Sun Y, Djing z, Li YQ (2012) Optimization for Production of Intracellular Polysaccharide from Cordyceps ophioglossoides L2 in Submerged Culture and Its Antioxidant Activities invitro Chinese Journal of Chemical Engineering 20(2): 294-301 37 John H, Matt c, Aloha M Inc, Santa Cruz, California,U.S.A 2005 Cordyccps Wasser SP Institute of Evolution, University of Haifa, Mt.Carmel, Haifa, Israel 38 John H, Malt c (2008) Medicinal value of the caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) International Journal Medicinal Mushroom 10(3): 219-234 39 Park IP, Kim sw, Hwang HJ, Yun JW (2001) Optimization of submerged culture conditions for the mycelialgrowth and exo­ biopolymer production by Cordyceps militaris Letters in Applied Microbiology 33: 76-81 40 Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329-364 Herbal, New York 41 Shashidhara MG., Giridhare p., Udaya SK., Manohar B., India (2013) Bioactive principles from Cordyceps sinensis: Apotent food supplcmcnt-A review Journal offunctionalfoods 1013-1030 42 Shih I.L., Tsai K.L., Hsieh C.Y., 2007 Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactivc metabolite production in submerged culture of Cordyccps militaris Biochemical Engineering Journal 33, 193-201 43 Scok KJ., Lee JS., Shin CW., Lee KE., and Hong EK Korea (2009) Optimization of Culture Condition and Medium Components for the Production of Mycelial Biomass and Exo-polysaccharide with Cordyceps militaris in Liquid Culture Biotechnolgy and Bioprocess Engineering 14: 756-762 44 Shrestha B, Zhang w, Zhang Y, Liu X (2010) What is the Chinese caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis (Ophiocordycipitaceae) Mycology 1:228-36 Nguyễn Thị Thu Hiền 47 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 45 Sung J.M., Choi Y.S., Lee H.K., 1999 Production of fruiting body using cultures of entomopathogenic fungal species Korean Journal of Mycology 27:15-19 46 Sung J.M., Choi Y.S., Shrestha B., Park Y.J., 2002 Investigation on artificial fruiting of Cordyceps militaris Korean Journal of Mycology 30: 6-10 47 Sung J.M., Park Y.J., Han S.K., 2006 Selection of superior strains of Cordyccps militaris with enhanced fruiting body productivity Mycobiology 34:131-137 48 Wang G.D., 1995 Ecology, cultivation and application of Cordyceps and Cordyceps sinensis Scientific and Technical Documents, Beijing 49 Wang J.F., Yang C.Q., 2006 Research survey on artificial cultivation and product development of Cordyceps miUtaris Lishizhen Medicine And Material Medical Research 17:268-269 50 Zheng p., Xia Y.L., Xiao Ch.H., 2011 Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine Genome Biologv 23; 12 51 Zhoua X, Gonga z, Sua Y, linb J, Tang K (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61 (3): 279-291 52 Zhu, J.S., G.M Halpern, and K Jones 1998a The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordycepssinensis Part I J Ahern Complement Med 4(3): 289-303 53 Zhu, J.S., G.M Halpern, and K Jones 1998b The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordycepssinensis Part II J Ahern Complement Med 4(4): 429-457 54 Xiao JH, Chen DX, liu JW, Liu LZ, Wan WH, Fang N, Xiao Y, Qi Y, Liang ZQ (2004) Optimization of submerged culture requirements for the production of mycelial growth and exopolysaccharide by Cordyceps jiangxiensis JXPJ 0109 Journal ofApplied Microbiology 96: 1106-1116 55 Xuanwei Zhoua, Zhenghua Gonga, Ying Sua, Juan Linb, and Kexuan Tang (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61(3): 27- 91 5Ố Yang JK, Wang WQ, Ma HL, Wu JY (2013) Sulfation and enhanced antioxidant capacity of an exopolysaccharide produced by the medicinal fungus Cordyceps sinensis Molecules 18: 167-177 Nguyễn Thị Thu Hiền 48 ... vào nghiên cứu phát triển nâng cao thị trường sán xuất nấm dược liệu Đông trùng hạ thảo Việt Nam, thực đề tài ? ?Nghiên cứu điều kiện lên men thu hồi số hoạt chất sinh học chùng nấm Cordyceps militaris. .. nước Mục tiêu nghiên cứu cua đề tài Xác định số điều kiện lên men nấm Cordyceps miỉitaris FNA5 điều kiện thu hồi số dược chất polysaccaridc, cordyccpin từ sinh khối dịch lên men nấm nhằm ứng dụng... dung nghiên cứu - Nghiên cứu số điều kiện lên men (mơi trường, tỷ lệ tiếp giống, sục khí, pH ) chủng nấm Cordyceps militaris FNA5 quy mơ lít/mẻ để sinh tổng hợp cordycepin, polysaccharide - Nghiên