VIỆN ĐẠI HỌC MỠ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH DÒNG GEN ức CHẺ PROTEASE THU NHẢN TÙ VI SINH VẠT LIÊN KÉT HÀI MIÊN VÙNG BIẾN QUẢNG TRỊ Giáo viên hướng dẫn 1 PGS TS Phạm Việt C.
VIỆN ĐẠI HỌC MỠ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH DỊNG GEN ức CHẺ PROTEASE THU NHẢN TÙ VI SINH VẠT LIÊN KÉT HÀI MIÊN VÙNG BIẾN QUẢNG TRỊ Giáo viên hướng dẫn 1: PGS.TS Phạm Việt Cưòlig Giáo viên hướng dẩn 2: NCS Trần Thị Hồng Sinh viên thực : Đỗ Thị Thương Lớp : 13-01 Hà Nội- 2017 mg Miligram ml Mililitre g Gram úl Microlitre hp Base pair kb Kilobase DNA Deoxyribonucleotit Acid aa Acid amin Agar Agarose E Enzyme Inhibitor E.coli Escherichia coli ETD/ IPTG Isopropylthio- p- D- galactoside LB Luria Bertani PCR Polymerase Chain Reaction PI Protease Inhibitor (chat ức che protease) SDS Sodium Dodecyl sulfate TAE Tris- acetat- ETDA Taq Thermits aquaticus rpm Vòng/ phút TTHĐ Trung lâm hoạt động uv Ultraviolet x-gal 5- brom-4- chloro-3- indolyl- p-D- galactosidase DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh Hải miên DANH MỤC CÁC BÀNG Bảng 3.1: Kết xác định tỷ lệ A260/A2M) nồng độ AND (pg/ml) mầu nghiên cứu .38 MỞ ĐÀU Dặt vấn đề Môi trường biên đa dạng, người ta tính ví khuẩn biển nhiều, đạt mật độ đen 106/ml nước biển, sinh khối biển chất trao đối nhiều Môi trường biển, gồm lớp bề mặt, người la tin chứa khoảng 3,67x1 o30 vi sinh vật với gần 71% bề mặt trái đất 361 triệu km2 bao phủ đại dương, môi trường khu vực rộng lớn tiềm đa dạng vi sinh vật công nghệ sinh học có thê khai thác hay “cơng nghệ sinh học xanh” Trong môi trường biên, vi sinh vật biên phơi nhiêm áp suất, nhiệt độ, độ mặn, dinh dưỡng cực đoan Những enzymes tách chiết từ vi sinh vật nhữnợ mơi tnrịnơ nhir fhê rõ rànp cổ nhữnp rinh chât sinh lý sinh hóa đa in mạnh điêu kiên Như có thê khai thác enzymes vi sinh vật biển tổng họp có hoạt tính xúc tác sinh học khác thường, có khả hoạt động điều kiện cực đoan Rất nhiều hải miên có cộng đồng vi sinh vật đa dạng mô chúng Sự đa dạng có the giải thích phần bớì thay đơi điều kiện ỉý, hóa, sinh hải miên, có thê ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật tiến hóa Vi sinh vật liên đới với hái miên có nội bào ngoại bào Nhừng nghiên cửu vi sinh vật liên đới với hải miên sừ dụng kỳ thuật vi sinh nuôi cẩy truyền thống, kiểm tra mơ hải miên kính hiển vi Những nghiên cứu vi sinh vật liên đới hải miên cho thấy vi sinh vật chiếm đến 50% thể tích hải miên, số lớn 2-3 lần so với lượng vi khuân nước biên, cộng đồng đặc hiệu cho hải miên Rất nhiều sản phẩm hải miên cho thực tế vi khuẩn liên đới sinh ravà nhiều báo cáo chứng minh giả thuyết Việc phân lập, nuôi cấy vi sinh vật điều kiện đặc biệt thường khó khăn, đặc biệt vi sinh vật liên kết với thể khác mối tương tác chúng phức tạp Hơn nữa, khai thác hải miên để tách chiết hoạt chất nguồn nguyên liệu có hạn bị nhanh chóng, khó phục hồi gây húy hoại mơi trường Vì cần phải có phương pháp nhẳm phát thu hợp chất hoạt tính sinh học lượng lớn Phần lớn báo cáo phát tách chiết chất có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế khối u ức chế protease lừ chúng vi sinh vật nuôi cấy Hiện nay, Serine protease inhibitors nhũng thành viên quan trọng chiếm ti lệ nhiều họ protease inhibitors.Chúng hoạt động tác nhân điều hòa (modulator) tham gia vào nhiều trình phân giải protein quan trọng, liên kết hóa trị với protein đích bẩt ho ?ẹ gợi quan tam iuạmi 11IV Liviig IUIIVU mill vụv VI 311111 vại U1V11 la mụt nguồn giàu hợp chất có hoạt tính sinh học Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu Sự đa dạng cúa vi sinh vật liên kết hảì miên biên đặc trưng mơi trường biển góp phần tạo nguồn gen có gen ức chế serine protease Các hợp chất ức che serine protease mã hóa gen có đặc tính có tiềm úng dụng chừa trị bệnh Xuẩt phát từ đó, chúng tơi thực đề tài: ** Tách dòng gen ức chế protease thu nhộn tữ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị Mục tiêu đề tài Tách dòng thành công gen ức chế protease thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị Ý nghĩa cùa dề tài Góp phần tìm kiêm nguồn gen ức che protease gây bệnh phục vụ cho y học Nội dung nghiên cún - Tách chiết DNA vsv liên kết với hài miên - Nhân dịng gen mã hóa protein có hoạt tính ức chế protease từ DNA tách chiết - Gắn gen vào vector tách dịng thích hợp theo Kit - Giải trình tự gen tách dịng thành cơng Trong mơi trường chọn lọc có chửa chẩt kháng sinh nên tế bào có chứa vector tái tố hợp có khả mọc phát triển Ket biến nạp thê hình 3.4 Hình 3.4: Kết biến nạp vector tái tô hợp vào tế bào khả biến E.eơ/Í Top 10F’ rng khuân lạc xanh Lrãiig riêng 1C Nhu vậy, nhùng khuui .ụu xanh la vector PCR®2.1có mangoperon Lac hoạt động bình thường, khơng có đoạn gen chèn vào có chất cảm ứng IPTG tống hợp enzym p- galactosidase, chất chuyên hóa chat X- gal thành hợp chat có màu xanh Cịn nhừng khuấn lạc trắng có đoạn gen DNA ngoại lai xen vào giừa ỉacpromoter gen lac z cấu trúc operon Lac gen bị bất hoạt, enzyme B-galactosidase khơng tổng hợp Vì dù có X-gal môi trường, chat không bị phân hiiy, khơng tạo dẫn xuất indol khuẩn lạc có màu trắng Việc lựa chọn khuẩn lạc trắng để tách plasmid có the loại bó phân lớn trường họp không mong muôn không phái tất khuẩn lạc trắng mang vector plasmid tái tổ họp chứa đoạn DNA cần thiết Đẻ khẳng định cách chắn, thực bước kiểm tra Đó kiểm tra DNA plasmid tách chiếtbăng enzym giới hạn so sánh kích thước đoạn cắt với sàn phẩm phản ứng PCR 3.3.4 Tấch chiết DNA plasmid từ vi khuân E.coli Chúng tiến hành nuôi khuần lạc có khuẩn lạc trắng khuân lạc màu xanh (làm đối chứng) môi trường LB lỏng có chứa Kana (lOOmg/ml), sau tiến hành tách chiết DNA plasmid trình bày mục 2.3.7 phần phương pháp nghiên cứu Các DNA plasmid kiềm tra bàng điện di gel agarose %, Kết thể hình 3.5 1111111 1XCI Ị|ua Idtn piasiiuu Đường chạy X: DNA plasmid tách từ khuẩn lạc màu xanh Đường chạy 1: DNA plasmid tách chiết từ khuẩn lạc màu trắng mang gen HM9-QT (khoảng 667bp) Đối với kết tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp không sử dụng thang DNA chuẩn mà dựa anh điện di đê có thê quan sát nhận định kểt quá.Theo lý thuyết điện di, phân tử DNA có kích thước lớn di chuyển chậm, bàn gel điện di phân tứ DNA có kích thước lớn nẳm vị trí cao so với phân tử DNA có kích thước nhỏ Vector tái tổ hợp có gắn thêm sản phẩm PCR nên kích thước lớn vector đối chứng khơng mang đoạn xen di chuyển chậm vector đối chứng Kết diện di cho có chênh lệch độ cao hai loại vector Kết quà điện di cho thấy DNA plasmid tách chiết sạch, bâng diện di sáng, rõ thành phần khác tế bào bị loại bỏ Mồi đường chạy xuất ba bãng: Băng plasmid dạng siêu xoắn, băng ìà plasmid dạng mạch thãng, băng plasmid dạng tháo xoắn Khi ỡ dạng siêu xoắn plasmid dề dàng di chuyển ma trận gel hai dạng lại nên chạy nhanh Plasmid đường chạy I có kích thước lởn hon plasmid đổi chứng nên có đoạn DNA ngoại lai chèn vào Như plasmid từ dòng khuẩn lạc trang tiếp lục sữ dụng để tiến hành bước chọn lọcdòng mang gene HM9-ỌT 3.3.5 Cat kiêm tra DNA plasmid enzym giói hạn EcoRl Đe kiểm tra sàn phẩm tách plasmid khẳng định lần có mặt đoạn DNA cần quan tâm plasmid tinh sạch, plasmid dược c Ig hình 3.6 Hmh 3.6: Điện di đỏ săn phàm cắt bời enzyme giói hạn Đường chạy 1: DNA plasmid mang gen HM9-QT (~30ữbp) cất bải ScoRI Đường chạy X: Marker lOObp cùa hẫng Fermentas Đường chạy 2: (đoi chứng) Sàn phẩm PCR cắt bờỉ ícoRI Đường chạy 3: DNA plasmid cũa khuân lạc xanh cít bời ícơRI Kết quà điện di sán phắm cắt plasmid mang gen IIM9-QT cũa vi sinh vật liên kết hãi miên cho thấy sau cát enzym giới hạncó văng băng có kích thước sán phẩm PCR 667bp) DNA plasmid cua khuẩn lạc xanh khơng văng hãng có kích thước cùa sàn phẩm PCR khơng có gen ngoại lại- Còn sân phàm PCR cat &