Xác định đặc điểm hóa sinh của enzyme cellulase thu nhận từ vi khuẩn bacillus subtilis th vk22

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN MỘC TẤN XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH CỦA ENZYME CELLULASE THU NHẬN TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis TH-VK22 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Tấn Việt Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 27 tháng 07 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: GS.TS Trần Đình Thắng - Chủ tịch Hợi đồng TS Hồ Thiên Hoàng - Phản biện PGS.TS Ngô Đại Nghiệp - Phản biện PGS.TS Võ Thanh Sang - Ủy viên TS Lưu Thảo Nguyên - Thư ký CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM VIỆN TRƯỞNG BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Mộc Tấn MSHV: 19630151 Ngày, tháng, năm sinh: 07/10/1997 Nơi sinh: Trà Vinh Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Xác định đặc điểm hóa sinh enzyme cellulase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis TH-VK22 NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nhiệm vụ: Xác định đặc điểm hóa sinh enzyme cellulase thu nhận từ vi khuẩn B subtilis TH-VK22 Nội dung nghiên cứu luận văn tốt nghiệp: - Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme cellulase vi khuẩn B subtilis TH-VK22 - Tinh enzyme cellulase từ vi khuẩn B subtilis TH-VK22 - Xác định đặc điểm hóa sinh enzyme cellulase thu nhận từ vi khuẩn B subtilis TH-VK22 II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 09/05/2022 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 09/04/2023 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Phạm Tấn Việt Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 … NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM VIỆN TRƯỞNG LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô Viện Công nghệ sinh học Thực phẩm tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức q trình học tập trường; cán bợ Viện Đào tạo Quốc tế Sau đại học tạo điều kiện thuận lợi thủ tục giúp thực luận văn Tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn sâu sắc đến Thầy Phạm Tấn Việt đồng hành, tận tâm bảo truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức chuyên môn q báu cho tơi q trình thực khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Nguyễn Thị Diệu Hạnh Thầy Nguyễn Ngọc Ẩn quan tâm, dạy dỗ hỗ trợ để tơi có nhìn sâu sắc vấn đề nghiên cứu hoàn thành tốt khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn bạn bè thành viên Phòng Thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh với gia đình ln đợng viên, khích lệ tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực để tơi hồn thành khố luận Tơi xin kính chúc quý Thầy Cô dồi sức khỏe gặt hái nhiều thành công nghiệp trồng người cuộc sống Tôi xin chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Cellulase giữ vai trị quan trọng thị trường enzyme tồn cầu tiềm ứng dụng nhiều ngành công nghiệp khác Trong đó, cellulase có nguồn gốc từ chi Bacillus thường chứng minh có nhiều đặc tính sinh học bật Trong nghiên cứu này, chủng B subtilis TH-VK22 thể khả sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao ni cấy 35°C môi trường BHM bổ sung 11,0% maltodextrin, 2,0% peptone, 0,5% rơm pH 5,0 Cellulase từ B subtilis TH-VK22 tinh qua nhiều bước khác trọng lượng phân tử xác định khoảng 33 kDa Nhiệt đợ pH thích hợp cho hoạt đợng cellulase tinh 50°C pH 5,0 Bên cạnh đó, enzyme thể ổn định nhiệt độ lên đến 55°C giữ lại 90% hoạt tính ủ pH 4,0-10,0 khoảng Ngoài ra, ion kim loại Ag+, K+, Na+, Ca2+, Mn2+ ghi nhận làm tăng hoạt tính cellulase, enzyme bị giảm hoạt tính thêm Fe2+ vào hỗn hợp phản ứng Celluase từ B subtilis TH-VK22 thể khả bền với chất hoạt động bề mặt tween 20, tween 80, triton x-100, glycerol…với 80% hoạt tính cịn lưu giữ so với đối chứng Hơn nữa, enzyme thể hoạt tính thủy phân chất cao mơi trường có nồng đợ NaCl 2M Các thơng số động học Km Vmax cellulase với giá trị 3,796 mg/ml 373914 U/mg Nghiên cứu cung cấp thêm liệu điều kiện ni cấy thích hợp đặc điểm hóa sinh cellulase thu nhận từ B subtilis TH-VK22 Từ đó, enzyme khai thác tiềm ứng dụng mợt cách hiệu quy trình công nhiệp khác ii ABSTRACT Because it has the potential to be used in a wide range of sectors, cellulase is a key player in the worldwide enzyme market In which exceptional biological characteristics of cellulases from the genus Bacillus are frequently demonstrated In this experiment, strain B subtilis TH-VK22 showed high cellulase biosynthesis ability when cultivated at 35°C in BHM medium supplemented with 11.0% maltodextrin, 2.0% peptone, 0.5% straw, and pH 5.0 It was discovered that the molecular weight of the cellulase from B subtilis TH-VK22 was around 33 kDa after it had been purified using a number of procedures Purified cellulase activity is optimally exhibited at 50°C and pH 5.0, respectively Additionally, this enzyme demonstrates stability at temperatures as high as 55°C and keeps more than 90% of its activity after an hour of incubation at a pH range of 4.0 to 10.0 Furthermore, it was discovered that adding the metal ions Ag+, K+, Na+, Ca2+, and Mn2+ to the reaction mixture increased the activity of cellulase whereas adding Fe2+ inhibited it Compared to the control, 80% of the activity of the cellulase from B subtilis THVK22 was retained against surfactants such glycerol, triton X-100, tween 20, and tween 80 Moreover, this enzyme displays strong substrate hydrolysis activity in 2M NaCl media Cellulase's Km and Vmax kinetic parameters have values of 3.796 mg/ml and 373914 U/mg, respectively This study provided additional data on the appropriate culture conditions and biochemical characteristics of cellulase obtained from B subtilis TH-VK22 The application potential of this enzyme in many industrial processes can then be more fully used iii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học Thầy Phạm Tấn Việt Các nội dung nghiên cứu, số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Học viên Nguyễn Mộc Tấn iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC BẢNG BIỂU ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu .3 Ý nghĩa thực tiễn đề tài .4 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Cellulose vai trò cellulose sinh giới 1.2 Tổng quan Bacillus subtilis .7 1.2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Đặc điểm sinh học phân bố tự nhiên .9 1.3 Tổng quan enzyme cellulase 11 1.3.1 Khái niệm .11 1.3.2 Phân loại .12 1.3.3 Nguồn thu nhận cellulase .14 1.3.4 Các phương pháp thu nhận tinh cellulase .16 1.3.5 Đặc điểm hóa sinh cellulase 18 1.3.6 Ứng dụng 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 v 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2 Hóa chất .23 2.1.3 Dụng cụ thiết bị .24 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp hoạt hóa giống 25 2.2.2 Phương pháp xác định đường cong tăng trưởng chủng vi khuẩn thí nghiệm 25 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ cellulase (BernFeld) 26 2.2.4 Phương pháp khảo sát điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase.27 2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng protein (Bradford) 30 2.2.6 Phương pháp thu nhận tinh enzyme cellulase 31 2.2.7 Phương pháp xác định đặc điểm hóa sinh enzyme cellulase 34 2.2.8 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 36 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 38 3.1 Điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase chủng B subtilis TH-VK22 38 3.1.1 Khả sinh tổng hợp cellulase ngoại bào chủng B subtilis TH-VK22 môi trường BHM 38 3.1.2 Ảnh hưởng nguồn carbohydrate nồng độ nguồn carbohydrate tốt lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng B subtilis TH-VK22 39 3.1.3 Ảnh hưởng nguồn nitrogen nồng độ nguồn nitrogen tốt lên khả sinh tổng hợp cellulase B subtilis TH-VK22 41 3.1.4 Ảnh hưởng chất nồng độ loại chất tốt lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng B subtilis TH-VK22 43 3.1.5 Ảnh hưởng nhiệt độ pH nuôi cấy lên sản xuất cellulase B subtilis TH-VK22 45 3.2 Tinh cellulase từ B subtilis TH-VK22 48 3.2.1 Thu nhận cellulase từ dịch nuôi cấy B subtilis TH-VK22 48 3.2.2 Tinh cellulase ngoại bào từ dịch cellulase thô .49 vi 3.2.3 Kiểm tra độ tinh xác định trọng lượng phân từ cellulase từ B subtilis TH-VK22 SDS-PAGE 49 3.2.4 Hiệu tinh cellulase từ B subtilis TH-VK22 51 3.3 Đặc điểm hóa sinh cellulase thu nhận từ B subtilis TH-VK22 52 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính cellulase 52 3.3.2 Ảnh hưởng pH phản ứng lên hoạt tính cellulase 53 3.3.3 Khả bền nhiệt cellulase 55 3.3.4 Khả bền pH cellulase 56 3.3.5 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính cellulase 58 3.3.6 Ảnh hưởng chất hoạt đợng bề mặt lên hoạt tính cellulase .59 3.3.7 Thông số động học Vmax, Km cellulase ngoại bào thu từ chủng B subtilis TH-VK22 61 3.3.8 Ảnh hưởng muối NaCl lên hoạt tính cellulase 62 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .64 4.1 Kết luận 64 4.2 Kiến nghị 65 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA HỌC VIÊN 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC 79 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN .102 vii Phụ lục Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính cellulase từ B subtilis TH-VK22 One-Way ANOVA - HOAT TINH by NHIET DO PHAN UNG Dependent variable: HOAT TINH Factor: NHIET DO PHAN UNG Number of observations: 39 Number of levels: 13 ANOVA Table for HOAT TINH by NHIET DO PHAN UNG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.413E11 12 1.1775E10 Within groups 2.47653E8 26 9.52513E6 Total (Corr.) 1.41548E11 38 88 1236.21 0.0000 Multiple Range Tests for HOAT TINH by NHIET DO PHAN UNG Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups 90 0.0 X 85 5448.75 80 24302.6 75 60520.1 70 89030.7 65 115319 30 129551 35 146383 X 60 148227 X 40 155130 X 45 159811 X 55 166241 X 50 167139 X X X X X X X Phụ lục 10 Khả bền nhiệt cellulase từ B subtilis TH-VK22 One-Way ANOVA - HOAT TINH by BEN NHIET Dependent variable: HOAT TINH Factor: BEN NHIET Number of observations: 36 Number of levels: 12 89 ANOVA Table for HOAT TINH by BEN NHIET Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.79847E11 11 1.63497E10 Within groups 4.04594E8 24 1.68581E7 Total (Corr.) 1.80252E11 35 969.85 0.0000 Multiple Range Tests for HOAT TINH by BEN NHIET Method: 95.0 percent LSD BEN NHIET Count Mean Homogeneous Groups 85 0.0 X 80 1040.19 X 75 2836.88 X 70 42033.1 X 65 43215.1 X 60 104586 45 157920 X 55 159574 X 35 162884 XX 40 163783 XX 50 167139 X 30 168794 X X Phụ lục 11 Ảnh hưởng pH phản ứng lên hoạt tính cellulase từ B subtilis TH-VK22 One-Way ANOVA - HOAT TINH by pH PHAN UNG Dependent variable: HOAT TINH 90 Factor: pH PHAN UNG Number of observations: 36 Number of levels: 12 ANOVA Table for HOAT TINH by pH PHAN UNG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.83478E11 11 1.66798E10 Within groups 5.77184E8 24 2.40493E7 Total (Corr.) 1.84055E11 35 693.57 0.0000 Multiple Range Tests for HOAT TINH by pH PHAN UNG Method: 95.0 percent LSD pH PHAN UNG Count Mean Homogeneous Groups Ci 3,0 0.0 X Tr 10,0 1513.0 X Tr 9,0 41465.7 P 8,0 124563 X Tr 8,0 132600 X P 6,0 164161 X P 7,0 170426 XX Ci 4,0 170898 XX Ci 7,0 175508 X Tr 7,0 187447 X Ci 6,0 193593 X Ci 5,0 207423 X X 91 Phụ lục 12 Khả bền pH cellulase từ B subtilis TH-VK22 One-Way ANOVA - HOAT TINH by BEN pH Dependent variable: HOAT TINH Factor: BEN pH Number of observations: 36 Number of levels: 12 ANOVA Table for HOAT TINH by BEN pH Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.04245E11 11 9.47678E9 Within groups 7.24226E8 24 3.01761E7 Total (Corr.) 1.04969E11 35 92 314.05 0.0000 Multiple Range Tests for HOAT TINH by BEN pH Method: 95.0 percent LSD BEN pH Count Mean Homogeneous Groups Ci 3,0 0.0 X Ci 4,0 132364 Tr 10,0 177163 X P 6,0 186383 XX Ci 5,0 188629 XX P 7,0 188865 XX Ci 7,0 189811 XX Tr 9,0 190638 XX Ci 6,0 195130 XX P 8,0 195248 XX Tr 7,0 195485 XX Tr 8,0 195957 X X 93 Phụ lục 13 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính cellulase từ B subtilis THVK22 One-Way ANOVA - HOAT TINH by Ion KIM LOAI Dependent variable: HOAT TINH Factor: Ion KIM LOAI Number of observations: 36 Number of levels: 12 ANOVA Table for HOAT TINH by Ion KIM LOAI Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.83674E11 11 2.57886E10 Within groups 7.27328E8 24 3.03053E7 Total (Corr.) 2.84402E11 35 94 850.96 0.0000 Multiple Range Tests for HOAT TINH by Ion KIM LOAI Method: 95.0 percent LSD Ion KIM LOAI Count Mean Homogeneous Groups Al3+ 0.0 X Fe3+ 0.0 X Fe2+ 105296 EDTA 141229 Mg2+ 160024 X Doi chung 162270 X K+ 177518 X Na+ 178582 X Ag+ 218298 Ca2+ 240757 Ba2+ 262861 Mn2+ 297494 X X X X X X 95 Phụ lục 14 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính cellulase từ B subtilis TH-VK22 One-Way ANOVA - HOAT TINH by CHAT HOAT DONG BE MAT Dependent variable: HOAT TINH Factor: CHAT HOAT DONG BE MAT Number of observations: 18 Number of levels: ANOVA Table for HOAT TINH by CHAT HOAT DONG BE MAT Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.08782E11 2.17564E10 Within groups 2.29952E8 12 1.91626E7 Total (Corr.) 1.09012E11 17 1135.36 0.0000 Multiple Range Tests for HOAT TINH by CHAT HOAT DONG BE MAT Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups SDS 0.0 X Tween 20 189456 Glycerol 198558 X Triton X-100 201040 X Tween 80 204468 X Doi chung 233428 X X 96 Phụ lục 15 Ảnh hưởng nồng độ NaCl lên hoạt tính cellulase từ B subtilis TH-VK22 One-Way ANOVA - HOAT TINH by NONG DO NaCl Dependent variable: HOAT TINH Factor: NONG DO NaCl Number of observations: 27 Number of levels: ANOVA Table for HOAT TINH by NONG DO NaCl Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 4.03052E9 5.03815E8 Within groups 5.55053E8 18 3.08363E7 Total (Corr.) 4.58557E9 26 16.34 Multiple Range Tests for HOAT TINH by NONG DO NaCl Method: 95.0 percent LSD NONG DO NaCl Count Mean Homogeneous Groups 2000 169953 X Doi chung 170662 X 50 188983 X 1500 189456 XX 400 197021 XXX 800 198085 XXX 200 198794 XX 100 200686 X 1000 206478 X 97 P-Value 0.0000 Phụ lục 16 Đường chuẩn glucose Phụ lục 17 Đường chuẩn Albumin 98 Phụ lục 18 Thông số động học cellulase từ B subtilis TH-VK22 99 Phụ lục 19 Kết phân tích Gel SDS-PAGE phần mềm GelAnalyzer 19.1 100 Phụ lục 20 Đường cong tăng trưởng chủng B subtilis TH-VK22 101 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC: Họ tên: Nguyễn Mợc Tấn Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 07/10/1997 Nơi sinh: Trà Vinh Email: nguyenmoctan84@gmail.com Điện thoại: 0817806505 II Q TRÌNH ĐÀO TẠO: 2015-2019: Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 2019-2023: Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh III Q TRÌNH CƠNG TÁC CHUN MƠN: Thời gian Nơi cơng tác Cơng việc đảm nhiệm 10/2019-04/2023 Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh Nghiên cứu viên Tp HCM, ngày tháng Năm 2023 Người khai 102