Chẩn đoán và xác định đặc điểm di truyền học của Sri Lanka mosaic virus gây bệnh khảm lá cây Sắn.pdf

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: CHÁN ĐOÁN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIẾM DI TRUYỀN HỌC CỦA SRI LANKA MOSAIC VIRUS GẦY BỆNH KHẢM LÁ CÂY SẮN Sổ hợp đồng: 2019.01.73/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Nguyền Thanh Việt Đơn vị công tác: Viện Kỳ Thuật Công Nghệ Cao NTT Thời gian thực hiện: 06 tháng (05-12/2019) TP Hồ Chí Minh, ngày 25 thảng 11 năm 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chù trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: CHÂN ĐOÁN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIÊM DI TRUYỀN HỌC CỦA SRI LANKA MOSAIC VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ CÂY SẤN Sổ họp đồng: 2019.01.73/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thanh Việt Đơn vị công tác: Viện Kỳ Thuật Công Nghệ Cao NTT Thời gian thực hiện: 06 tháng (05-12/2019) TP Hồ Chỉ Minh, ngày 25 thảng 11 năm 2019 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Sri Lanka mosaic virus 1.1.1 Lịch sử virus khảm sắn 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Genome 1.1.4 Sự chép Gemini virus .4 1.1.5 Chu trình lây nhiễm 1.1.6 Đặc điếm triệu chứng bệnh khảm virus hại sắn 1.1.6.1 Triệu chứng 1.1.6.2 Trung gian truyền bệnh 1.2 Cây san (cassava) 1.2.1 Đặc điểm 1.2.2 Tình hình nhiễm bệnh khảm virus hại sắn Việt Nam 1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh khảm virus hại sắn 1.3.1 Các nghiên cứu giới 1.3.2 Các nghiên cứu nước 11 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu 12 2.1 Nơi thực 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 12 2.3 Đối tuợng nghiên cứu 12 2.4 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 12 2.4.1 Phuong pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 12 2.4.1.1 Thu mầu 12 2.4.1.2 Tách chiết DNA 12 2.4.1.3 Chuẩn bị mồi tiến hành phản ứng PCR 14 2.4.1.4 PCR genome 15 2.4.2 Giải trình tự 16 2.4.3 Phân tích nucleotide, amino acid, phả hệ 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Thu Mầu 17 3.2 Tách chiết DNA 18 3.3 Phản ứng PCR phát SLCMV mầu bệnh phẩm 18 3.4 Phản ứng PCR với genome hoàn chỉnh SLCMV 19 3.5 Giải trình tự gene xây dựng phát sinh loài .20 3.6 Ket so sánh mức độ tưong đồng 32 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT SLMV: Virus khảm Sri Lanka (Sri Lanka mosaic virus) CMD : Bệnh khảm san (Cassava mosaic disease) SLCMV: Virus khảm san Sri Lanka (Sri Lanka cassava mosaic virus) ACMV: Virus khảm san Châu Phi (Affica cassava mosaic virus) EACMV : Virus khảm san Đông Phi (East Affica cassava mosaic virus) ICMV: Virus khảm san An ĐỘ (India cassava mosaic virus) PCR: Phản ứng khuếch đại gene (The Polymearase chain reaction) ssDNA: Sợi đon DNA (Single strand DNA) dsDNA: Sợi đôi DNA (Double strand DNA) CR: Vùng dùng chung (common region) CP: Protein VỎ (Coat protein) MP: Protein chuyến động (Moverment protein) Rep: Protein khởi động nhân lên (Replication initiation protein) TrAP: Protein hoạt hóa phiên mã (Transcription activator protein) ORF: Khung đọc mở (Open reading frame) REn: Protein kéo dài nhân lên (Replication enancer protein) NSP : Nuclear shuttle protein FAO: To chức Nông Luong Liên hiệp quốc (Food and Agriculture Organization) PLS1: Đệm ly giải thực vật (Plant lysis buffer 1) PLS2: Đệm ly giải thực vật (Plant lysis buffer 2) PBB: Đệm gắn DNA thực vật lên cột (Plant binding buffer) PWB: Đệm rửa giải (Plant wash buffer) EB: Đệm ly trích (Elution buffer) NCBI: Nation center for Biotechnology information DANH MỤC CÁC BẢNG BIÊU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Genome cùa Begomovirus Hình 0.1 Bệnh tích bệnh khảm sắn Hình 0.2 Bemisia tabacỉ Hình 0.3 Cây sắn Hình 0.4 Hình ảnh bệnh tích khảm sắndo SLCMV 17 Hình 0.5 DNA tổng số sản phẩm sau tách chiết 18 Hình 0.6 Sản phẩm PCR phát SLCMVtrong mẫu bệnh phẩm 18 Hình 0.7 Kết PCR full genome A 19 Hình 0.8 Kết PCR full genome B 20 Hình 0.6 Cây phả hệ genome A B 21 Hình 0.7 Cây phả hệ gene AV 23 Hình 0.8 Cây phả hệ gene AV2 24 Hình 0.9 Cây phả hệ gene AC 25 Hình 0.109 Cây phả hệ gene AC2 26 Hình 0.11 Cây phả hệ gene AC3 27 Hình 0.12 Cây phả hệ gene AC4 28 Hình 13 Cây phả hệ gene BV1 29 Hình 0.14 Cây phả hệ gene BC1 30 DANH MỤC CÁC BẢNG BIÊU Trang Bảng 0.1 Các thành phần phản ứng PCR Bảng 0.2 Chu kì nhiệt phản ứng PCR 14 Bảng 0.3 Mồi PCR full genome A 15 Bảng 0.4 Mồi PCR full genome B 15 Bảng 0.1 Ket thu nhận mầu 17 Bảng 0.2 Kích thước sản phẩm PCR full genome A 19 Bảng 0.3 Kích thước sản phẩm PCR full genome B 19 Bảng 0.4 Mức độ tuông đồng nucleotide (amino acid) chủng SLCMVs nghiên cứu chủng tham chiếu 31 TÓM TẮT KÉT QUẢ NGHIÊN cửu Sản phẩm thực đạt Sản phẩn đăng ký thuyết minh > Báo cáo tổng họp kết quà đe tài > Báo cáo tong hợp ket đề tài > Bài báo khoa học gừi đăng tạp chí > Bài báo khoa học đăng tạp chí Khoa học Công nghệ, Đh Nguyền khoa học chuyên ngành Tất Thành (phụ lục) > Đã đào tạo sinh viên Tràn Kiên Cường, Khoa CNSH thực KLTN với nội dung tương đương bảo vệ thành công KLTN Hội đong (phụ lục) Sản phẩm khác: > Bài tóm tắt tham gia Hội Nghị Cơng Nghệ Sinh Học Tồn Quốc Năm 2019 (phụ lục) Thòi gian đăng ký: 06 tháng (05-12/2019) Thòi gian nộp báo cáo: 25/11/2019 > Đào tạo 01 sinh viên chuyên ngành CNSH MỞ ĐẦU Thống kê lương thực chù yếu vùng khí hậu nhiệt đới bao gồm lúa, ngơ, khoai, sắn đậu tương Sản lượng giá trị kinh tế trồng mang lại to lớn sống an ninh lương thực người Cây sắn hay gọi khoai mì thuộc loại lấy củ dề sinh trưởng, trồng trăm nước nguồn thực phẩm cho năm trăm triệu người, đem lại nguồn nhiên liệu quan trọng sản xuất xăng sinh học, chất phụ gia thực phẩm Tuy nhiên, năm gần có nhiều báo cáo nhiều nước khác bệnh sắn hay gọi bệnh khảm san Sri Lanka Mosaic Virus (SLMV), gây qua trung gian truyền bệnh chủ yếu bọ phấn trắng (Betnisia (abaci) có nguy lây lan thành dịch quy mô lớn khiến thiệt hại cho lương thực nói chung cho ngành canh tác sắn nói riêng SLMV gây bệnh tích nhiều loại trồng khác nhau, thiệt hại sè nặng suất chí hư hại hoàn toàn Cuối năm 2017 nước ta đà có tỉnh bao gồm Tây Ninh, Bình Dương, Bà Rịa - Vũng Tàu Đồng Nai báo cáo tình hình nhiễm bệnh khảm sắn với diện tích 29.160 ha, bệnh khảm sắn lan rộng, gây thiệt hại 90 % diện tích trồng sắn Tây Ninh có nguy lan mạnh sang tỉnh lân cận khác Mặc dù có nhiều nước cơng bố tình trạng báo cáo SLCMV, Việt Nam đặc thù khí hậu có phần khác biệt, bệnh lại xuất cách không lâu nên am hiếu nghiên cứu nước cịn ít, chưa có thống kê cụ thể trạng xác việc đoán trước xu hướng phát triển trở thành dịch bệnh quy mơ lớn lây lan khó khăn việc kiểm sốt phịng trừ lây lan thiệt hại Xuất phát từ lý trên, đề xuất thực đề tài: “Chẩn đoán xác định đặc điểm di truyền học Sri Lanka Mosaic Virus gây bệnh khảm sắn.” CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Sri Lanka mosaic virus 1.1.1 Lịch sử virus khảm sắn Virus khảm sắn phân chia thành nhiều chủng khác dựa vào đặc tính biến chủng phân bo theo vùng địa lý gồm có virus khảm sắn Châu Phi (Affica cassava mosaic virus, ACMV), virus khảm san Đông Phi (East Affica cassava mosaic virus, EACMV), virus khảm san An ĐỘ (India cassava mosaic virus, ICMV) Sri Lanka cassava mosaic virus (SLCMV) Báo cáo bệnh khảm sắn bắt nguồn từ Đơng Phi năm 1894, ke từ dịch bệnh xảy khắp lục địa Châu Phi gây thiệt hại kinh tế lớn dẫn đến tình trạng khủng hoảng lương thực nghiêm trọng Năm 1971, dòng sắn có khả kháng virus nghiên cứu thành công sử dụng Viện Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc tế Nigeria đà kiếm soát hiệu dịch bệnh nhiều năm Tuy nhiên, vào cuối kỷ 20 xuất loại virus tái tổ họp chủng EACMV - UG mạnh bùng phát Uganda nhanh chóng lan sang Đơng Trung Phi Năm 1942, virus khảm sắn phát Án Độ, tỷ lệ dịch bệnh bùng phát cao Tamil Nadu Kerala Tùy thuộc vào giống thời gian năm mà tổn thất suất củ thay đổi từ khơng đáng kể lên đến 84 % 1.1.2 Phân loại Sri Lanka Cassava Mosaic Virus (SLCMV) virus thuộc vùng Sri Lanka đảo thuộc An Độ, nằm Gemirividae (được chia làm bốn chi: Mastrevữus, Curtovirus, Topocuvirus Begomovivus) họ virus lón gây bệnh thực vật thuộc chi Begomovữus chứa vật chất di truyền sợi đơn DNA (single strand, ssDNA), nhóm virus có phạm vi vật chủ rộng, thường gây bệnh cho hai mầm [1] 1.1.3 Genome Virus Sri Lanka Cassava Mosaic Virus (SLCMV) có gene vịng đơn DNA khép kín (ssDNA) lường cực chia làm hai phân đoạn DNA - A DNA - B Trong phân đoạn DNA - A chịu trách nhiệm mã hóa proteins liên quan đen nhân lên đóng gói DNA hạt virus tế bào vật chủ chúng xâm nhiễm vào, bên cạnh cịn tham gia vào việc kiếm sốt biểu gene Cịn phân đoạn DNA ... ? ?Chẩn đoán xác định đặc điểm di truyền học Sri Lanka Mosaic Virus gây bệnh khảm sắn.” CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Sri Lanka mosaic virus 1.1.1 Lịch sử virus khảm sắn Virus khảm. .. Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: CHÂN ĐOÁN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIÊM DI TRUYỀN HỌC CỦA SRI LANKA MOSAIC VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ CÂY... SLCMV: Virus khảm san Sri Lanka (Sri Lanka cassava mosaic virus) ACMV: Virus khảm san Châu Phi (Affica cassava mosaic virus) EACMV : Virus khảm san Đông Phi (East Affica cassava mosaic virus)