Chẩn đoán và xác định đặc điểm di truyền học của Sri Lanka mosaic virus gây bệnh khảm lá sắn.pdf

ĐẠI HOC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỰC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP CHẤN ĐỐN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIẺM DI TRUYỀN HỌC CỦA SRI LANKA MOSAIC VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ CÂY SẮN Sinh viên thực : Trần Kiên Cường MSSV : 1511542549 GVHD : TS Thân Văn Thái Tp.HCM, 2019 ĐẠI HOC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỰC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP CHẤN ĐỐN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIẺM DI TRUYỀN HỌC CỦA SRI LANKA MOSAIC VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ CÂY SẮN Sinh viên thực : Trần Kiên Cường Mà số sinh viên : 1511542549 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Thân Văn Thái Tp.HCM, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYÊN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CỘNG HÒA XẰ HÒI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc oOo NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Họ tên: Trần Kiên Cường MSSV: 1511542549 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 15DSH1B Đầu đề luận văn: Chần đoán xác định đặc điểm di truyền học Sri Lanka mosaic virus gây bệnh khảm sắn Mục tiêu - Chấn đoán Sri Lanka mosaic virus (SLCMV) mẫu sắn bệnh - Giải trình tự gen SLCMV xác định đặc tính di truyền học Nội dung: - Thu thập mầu bệnh phẩm bệnh khảm sắn SLCMV gây số tỉnh thành Việt Nam công bố dịch - Tách chiết DNA SLCMV từ mẫu sắn bệnh - PCR với cặp mồi đặc hiệu SLCMV - Giải trình tự tồn gene SLCMV - Phân tích trình tự phần mềm tin-sinh học Thời gian thực hiện: tháng 02/2019 đến tháng 8/2019 Người hướng dần chính: TS Thân Văn Thái Nội dung u cầu khóa luận tốt nghiệp Bộ mơn thông qua TP HCM, ngày tháng năm 2019 Bộ MÔN (Ký ghi rõ họ tên) CÁN Bộ HƯỚNG DẢN (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Từ lúc học tập giảng đường Đại học đến nay, nhận nhiều giúp đỡ, quan tâm q thầy cơ, gia đình bạn bè Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu trường Đại học Nguyễn Tất Thành với quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học hồ trợ, tạo điều kiện cho tơi có môi trường học tập tốt hiệu Với biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Thân Văn Thái giành thời gian, công sức tận tâm dạy bảo, hướng dẫn nhiệt tình, giúp đờ góp ý cho tơi lời khuyên, kiến thức chuyên môn suốt khoảng thời gian nghiên cứu hồn thành khóa luận Con xin chân thành cảm ơn bố mẹ, người sinh nuôi dạy trưởng thành, cho điều kiện tốt sống đường tương lai Luôn bên cạnh an ủi, động viên tiếp bước suốt trinh tụ thực ước mơ cho đời Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè lớp bên cạnh động viên, chia sẻ hồ trợ tơi q trình học tập khoảng thời gian thực khóa luận Trần Kiên Cường Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyền Tất Thành MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii TÓM TẮT V SUMMARY vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIẾU ix DANH MỤC CHŨ VIẾT TẤT X ĐẶT VẤN ĐỀ xi CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Sri Lanka mosaic virus 1.1.1 Lịch sử virus khảm sắn 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Genome 1.1.4 Sự chép Gemini virus 1.1.5 Chu trình lây nhiễm 1.1.6 Đặc điếm triệu chứng bệnh khảm virus hại sắn 1.2 Cây san (cassava) 1.2.1 Đặc điếm 1.2.2 Tình hình nhiễm bệnh khảm virus hại sắn Việt Nam 1.3 Phương pháp PCR 1.3.1 Lịch sử hình thành 1.3.2 Thành phần phản ứng ii 1.3.3 Điện di 11 1.4 Kỳ thuật giải trình tự gen 12 1.5 Xây dựng phát sinh loài 13 1.6 Tình hình nghiên cứu bệnh khảm virus hại sắn 13 1.6.1 Các nghiên cứu giới 13 1.6.2 Các nghiên cứu nước 15 CHƯƠNG NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 16 2.1 Noi thực .16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Đối tượng nghiên cứu 16 2.4 Vật liệu nghiên cứu 16 2.4.1 Thiết bị, dụng cụ 16 2.4.2 Hóa chất thuốc thử 17 2.5 Phương pháp nghiêncứu 17 2.5.1 Thu mầu 17 2.5.2 Tách chiết DNA 18 2.5.3 Chẩn đoán tác nhân SLCMV phương pháp PCR 19 2.5.4 Phương pháp điện di 20 2.5.5 Chuẩn bị gel agarose nồng độ 1% 20 2.5.6 Bơm mẫu vào giếng chạy điện di 21 2.5.7 PCR genome 21 2.5.8 Giải trình tự 22 2.5.9 Phương pháp tìm kiếm dừ liệu tài liệu 23 2.5.10 Phương pháp tìm kiếm dừ liệu trình tự 23 iii 2.5.11 Phân tích nucleotide, amino acid, phả hệ 23 CHƯƠNG KẾT QƯẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Thu Mầu 24 3.2 Tách chiết DNA 25 3.3 PCR phát 25 3.4 Kết PCR full genome 26 3.4.1 Kết PCR full Genome A 26 3.4.2 Kết PCR full genome B 27 3.5 Phân tích kết giải trình tự 28 3.6 Ket xây dựng phát sinh loài 33 3.6.1 Cây phả hệ full genome 33 3.6.2 Cây phả hệ phân đoạn gene 37 3.7 Ket so sánh mức độ tương đồng 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 53 IV TÓM TẮT Bệnh khảm sắn (Cassava mosaic disease, CMD), mười bệnh virus nghiêm trọng gây thiệt hại kinh tế giới, báo cáo Đông Nam Á từ vùng canh tác Campuchia vào năm 2015 tìm thấy Việt Nam vào năm 2017 Tây Ninh Nghiên cứu tập trung đến việc phát xác định đặc tính di truyền virus khảm san Sri Lanka (Sri Lanka cassava mosaic virus, SLCMV) Việt Nam ba khu vực Tây Ninh, Ninh Thuận, Củ Chi (Tp.Hồ Chí Minh) Sử dụng phương pháp chẩn đốn dựa PCR phương pháp PCR tồn hệ gene virus, xác định chủng ba tỉnh nghi ngờ bị nhiễm bệnh với mức độ tương đồng DNA-A DNA-B so với Campuchia 99,8 % 99,7 % Các mầu biểu triệu chứng nhiễm bệnh cho thấy SLCMV lây truyền qua vật liệu bị nhiềm bệnh qua Bemisia tabaci loại ruồi trắng biết đến vectơ trung gian truyền bệnh khảm Dừ liệu sở giám sát tạo thảo luận dựa lựa chọn giải pháp tương lai với mong muốn kiểm soát quản lý bệnh khảm sắn Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: Thu nhận tách chiết DNA mầu khảm sắn Tây Ninh, Ninh Thuận Củ Chi Thực PCR phát PCR cho full - genome SLCMV mầu bệnh phẩm với cặp mồi đặc hiệu Phân tích so sánh trình tự nucleotide (nt) amino acid (aa) chủng SLCMV phân lập với với chủng tham chiếu dừ liệu Genbank NCBI Xây dựng phát sinh loài gen DNA - A, DNA - B gene cấu thành bao gồm AVI, AV2, AC1, AC2, AC3, AC4, BV1, BC1 V SUMMARY Cassava mosaic disease (CMD), one of the ten most economically important crop viral diseases in the world, was first reported in Southeast Asia from a single plantation in Cambodia in 2015 and was found in Viet Nam in last 2017 at Tay Ninh The study about detection and determine genetic characterization of Sri Lanka cassava mosaic virus (SLCMV) infecting cassava in Vietnam at three area are Tay Ninh, Ninh Thuan, Cu Chi (Ho Chi Minh city) Using PCR - based diagnostics and PCR full genome method, we identified specie at three province are infected CMD similar when compared sample with Cambodia with identity of DNA-A and DNA-B respectively 99,8 % and 99,7 % Symptom expression patterns in infected plants suggested that SLCMV may have been transmitted both through infected planting materials, and by Bemisia tabaci, the known whitefly vector of SLCMV The surveillance baseline data generated is discussed in light of future options to control and manage cassava mosaic disease Results achieved after months of research: Collected and extracted the SLCMV DNA from the infected SLCMV leafs from Tay Ninh, Ninh Thuan, and Cu Chi PCR for SLCMV detection and full-genome of the SLCMV in the samples using the specific primer pairs Analysis and comparision the genome sequences (nucleotide, nt; and amino acid, aa) of the isolated SLCMV strains to each others and reference SLCMV strains collected in Genbank NCBI database Phylogenetic analysis of the genes of DNA - A, DNA - B, and other related genes, including AVI, AV2, AC1, AC2, AC3, AC4, BV1, and BC1 VI DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Genome Begotnovirus Hình 1.2 Bệnh tích bệnh khảm sắn Hình 1.3 Bemisia tabacỉ Hình 1.4 Cây sắn Hình 3.1 Ket thu nhận mẫu 24 Hình 3.2 Kiểm tra DNA tổng số 25 Hình 3.3 Kết PCR phát 25 Hình 3.4 Kết PCR full genome A 27 Hình 3.5 Kết PCR full genome B 28 Hình 3.6 Kết giải trình tự tốt 28 Hình 3.7 Ket giải trình tự khơng tốt 29 Hình 3.8 Hiệu chỉnh gene seqman 30 Hình 3.9 Kết BLAST NCBI 30 Hình 3.10 Ket so sánh hai trình tự 31 Hình 3.11 Kết tìm khung đọc mở ORF 32 Hình 3.12 Cây phả hệ full genome A 34 Hình 3.13 Cây phả hệ full genome B 36 Hình 3.14 Sai khác Nu chủng Ninh Thuận 37 Hình 3.15 Cây phả hệ gene AVI 38 Hình 3.16 Cây phả hệ gene AV2 39 Hình 3.17 Cây phả hệ gene AC1 40 Hình 3.18 Điểm sai khác Nu gene AC1 41 Hình 3.19 Điểm sai khác gene AC2 42 vii ... nghệ sinh học Lớp: 15DSH1B Đầu đề luận văn: Chần đoán xác định đặc điểm di truyền học Sri Lanka mosaic virus gây bệnh khảm sắn Mục tiêu - Chấn đoán Sri Lanka mosaic virus (SLCMV) mẫu sắn bệnh -... VIÉT TẮT SLMV: Virus khảm Sri Lanka (Sri Lanka mosaic virus) CMD : Bệnh khảm san (Cassava mosaic disease) SLCMV: Virus khảm san Sri Lanka (Sri Lanka cassava mosaic virus) ACMV : Virus khảm san Châu... ? ?Chẩn đoán xác định đặc điểm di truyền học cũa Sri Lanka mosaic virus gây bệnh khảm sắn.” Mục tiêu đề tài: Chấn đoán SLCMV từ mầu sắn nhiễm bệnh phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu XI Xác định