Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh của enzyme amylase chịu nhiệt thu nhân từ xạ khuẩn chịu nhiệt

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƯƠNG THỊ THÙY TRANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH CỦA ENZYME AMYLASE CHỊU NHIỆT THU NHẬN TỪ XẠ KHUẨN CHỊU NHIỆT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Ngọc Ẩn Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 27 tháng 07 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS Trịnh Ngọc Nam - Chủ tịch Hội đồng TS Bùi Hồng Quân - Phản biện PGS TS Quách Ngô Diễm Phương - Phản biện TS Nguyễn Hoàng Dũng - Ủy viên TS Nguyễn Thị Lan Hương - Thư ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM VIỆN TRƯỞNG BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Dương Thị Thùy Trang MSHV: 19630131 Ngày, tháng, năm sinh: 17/02/1996 Nơi sinh: Tiền Giang Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh enzyme amylase chịu nhiệt thu nhận từ xạ khuẩn chịu nhiệt NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nhiệm vụ: Thu nhận xác dịnh đặc điểm hóa sinh enzyme amylase chịu nhiệt thu nhận từ xạ khuẩn Nội dung nghiên cứu luận văn tốt nghiệp: - Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase chịu nhiệt - Tinh enzyme amylase chịu nhiệt từ xạ khuẩn - Xác định đặc điểm hóa sinh enzyme amylase chịu nhiệt từ xạ khuẩn II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 30/11/2022 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/05/2023 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Ngọc Ẩn Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 … NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM VIỆN TRƯỞNG LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô Viện Công nghệ sinh học Thực phẩm tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức q trình học tập trường; cán bợ Viện Đào tạo Quốc tế Sau đại học tạo điều kiện thuận lợi thủ tục giúp thực luận văn Tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Nguyễn Ngọc Ẩn đồng hành, tận tâm bảo truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức chuyên môn q báu cho tơi q trình thực khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Nguyễn Thị Diệu Hạnh Thầy Phạm Tấn Việt quan tâm, dạy dỗ hỗ trợ để tơi có nhìn sâu sắc vấn đề nghiên cứu hoàn thành tốt khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn bạn bè thành viên Phòng Thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh với gia đình ln đợng viên, khích lệ tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực để tơi hồn thành khố luận Tơi xin kính chúc quý Thầy Cô dồi sức khỏe gặt hái nhiều thành công nghiệp trồng người cuộc sống Tôi xin chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Các amylase chịu nhiệt có nguồn gốc từ xạ khuẩn thường chứng minh có nhiều đặc tính sinh học bật Trong nghiên cứu này, 19/30 chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase ngoại bào Trong đó, chủng CNXK66 thể khả sản xuất amylase nhiệt độ 50°C Đồng thời, dịch amylase thô thu nhận sau ngày ni cấy chủng CNXK66 có khả hoạt động điều kiện nhiệt độ từ 50°C – 95°C, hoạt động tốt nhất 70°C Đặc điểm đại thể, vi thể trình tự vùng gen mã hóa cho 16S rRNA cho thấy CNXK66 có mối quan hệ gần gũi với loài Streptomyces gancidicus (ASD KT852565.1) (97%) Khi nuôi cấy Streptomyces sp CNXK66 môi trường M1 biến đổi có bổ sung 1,0% bợt bắp, 1,0% peptone, 0,05% CaCl2, 0,1% KH2PO4, 0,05% MgSO4 (w/v) điều kiện lắc 150 vịng/phút 50°C, pH mơi trường ban đầu 7,0 dịch amylase thơ thể hoạt tính thủy phân tinh bột tan cao nhất (4596 U/ml), cao môi trường M1 ban đầu gấp lần (2445 U/ml) Amylase Sreptomyces sp CNXK66 tinh cách xử lý 70°C 30 phút tủa phân đoạn với muối ammonium sulfate Kết tinh kiểm chứng kỹ thuật SDS-PAGE xuất band protein nhất với trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa Amylase tinh thể hoạt tính riêng 609656 U/mg, đồng thời thể hoạt tính cao nhất 70°C, có khả hoạt đợng khoảng pH 5,0-8,0, đạt giá trị cao nhất đệm Trisbase giá trị pH 7,0 Amylase từ Streptomyces sp CNXK66 cần có cofactor ion cho hoạt đợng xúc tác nó, ion Cl-, OH-, PO43-, CO32- (5mM) giúp hoạt tính amylase tăng cao, nhóm ion Fe2+, Zn2+, Mg2+, Cu2+, Al3+, Mn2+ (5mM) gây ức chế, hoạt tính amylase giảm thấp Khi phân tích số Michaelis- Menten hai thông số động học Km = 0,8589 mg/ml Vmax = 48896 U/mg sử dụng tinh bột tan làm chất Amylase sinh tổng hợp từ Streptomyces sp CNXK66 có khả bền 80°C với 70% hoạt tính cịn lưu giữ 100°C hoạt tính cịn lại 30%, có khả bền từ pH 5,0-8,0 với hoạt tính cịn lại 60% sau xử lý ii ABSTRACT Many exceptional biological characteristics of heat-resistant amylases generated from actinomycetes have frequently been demonstrated In this investigation, 19/30 actinomycetes were able to produce extracellular amylase The strain CNXK66 shown the ability to generate amylase at 50°C The CNXK66 strain, which could function at temperatures ranging from 50 to 95°C but operated best at 70°C, was also used to produce crude amylase solution after days of cultivation Streptomyces gancidicus (ASD KT852565.1) and CNXK66 are very related, according to sequencing, macroscopic, and microscopic properties of the 16S rRNA gene area (97% similarity) When cultivating Streptomyces sp CNXK66 on modified M1 medium with 1,0% cornstarch, 1,0% peptone, 0,1% KH2PO4, and 0,05% MgSO4 (w/v) added as supplements under shaking condition at 150 rpm The crude amylase solution had the maximum soluble starch hydrolysis activity (4596 U/ml) at 50°C and initial medium pH of 7.0, which was two times more than the initial M1 medium (2445 U/ml) Treatment at 70°C for 30 and fractional precipitation with ammonium sulfate salt were used to purify the amylase Sreptomyces sp CNXK66 SDS-PAGE procedure is used to confirm the findings of purification when there is just one protein band with a molecular weight of about 30 kDa Amylase that had been purified displayed a specific activity of 609656 U/mg, peaking at 70°C, active in the pH range of 5.0 to 8.0, and peaking at pH 7.0 in Trisbase buffer Cl-, OH-, PO43- and CO32- (5mM) ions aid boost amylase activity while Fe2+, Zn2+, Mg2+, Cu2+, Al3+, and Mn2+ (5mM) ions induce inhibition and poor amylase activity Amylases from Streptomyces sp CNXK66 require a metal ion cofactor for their catalytic activity When utilizing soluble starch as a substrate, two kinetic parameters Km = 0.8589 mg/ml and Vmax = 48896 U/mg are used to get the Michaelis-Menten constant Amylase produced by Streptomyces sp CNXK66 is stable at 80°C for hour with 70% remaining activity and at 100°C for hour with 30% remaining activity It is also stable between pH 5.0 and 8.0 with over 60% remaining activity iii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học Thầy Nguyễn Ngọc Ẩn Các nội dung nghiên cứu, số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố bất cơng trình khác Học viên Dương Thị Thùy Trang iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH ẢNH ix DANH MỤC BẢNG BIỂU xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu nghiên cứu 3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu .3 Ý nghĩa thực tiễn đề tài .5 CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU .6 1.1 Enzyme amylase chịu nhiệt 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại enzyme amylase .6 1.1.3 Ứng dụng enzyme amylase .8 1.2 Xạ khuẩn 10 1.2.1 Đặc điểm sinh lý, hóa sinh phân loại xạ khuẩn 11 1.2.2 Vai trò ứng dụng xạ khuẩn .13 1.2.3 Tình hình nghiên cứu amylase chịu nhiệt từ xạ khuẩn 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 Vật liệu nghiên cứu .18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Hóa chất .18 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 20 v 2.2 Phương pháp hoạt hóa giống xạ khuẩn .21 2.3 Phương pháp xác định nhanh khả sinh amylase xạ khuẩn 21 2.4 Phương pháp tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase chịu nhiệt .21 2.5 Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái định danh xạ khuẩn .22 2.5.1 Quan sát đặc điểm đại thể vi thể xạ khuẩn .22 2.5.2 Định danh xạ khuẩn sinh học phân tử 23 2.6 Phương pháp cấy tăng sinh giữ giống xạ khuẩn .23 2.7 Xác định hoạt tính amylase theo phương pháp BernFeld [63] 23 2.8 Phương pháp khảo sát nhiệt độ phản ứng từ dịch nuôi cấy xạ khuẩn 25 2.9 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp amylase chịu nhiệt xạ khuẩn 25 2.9.1 Xác định môi trường nuôi cấy 26 2.9.2 Ảnh hưởng nguồn chất nồng độ chất .26 2.9.3 Ảnh hưởng nguồn nitrogen nồng độ nitrogen 26 2.9.4 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy .27 2.10 Tinh enzyme amylase thu nhận từ xạ khuẩn 27 2.10.1 Xử lý dịch nuôi cấy với nhiệt độ 27 2.10.2 Tủa phân đoạn với (NH4)2SO4 kiểm tra hoạt tính protease chịu nhiệt phân đoạn tủa[29] 27 2.10.3 Phương pháp sắc ký lọc gel 28 2.10.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford [65] 29 2.10.5 Kiểm tra độ tinh xác định trọng lượng phân tử amylase phương pháp điện di SDS-PAGE[10] 30 2.11 Xác định đặc điểm hóa sinh amylase thu nhận từ xạ khuẩn chịu nhiệt .32 2.11.1 Xác định điều kiện phản ứng thích hợp .32 2.11.2 Xác định ảnh hưởng ion [10] .33 2.11.3 Động học enzyme [65] 33 2.11.4 Khả bền nhiệt, bền pH 34 2.12 Phương pháp xử lý số liệu 34 vi CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1 Sàng lọc, tuyển chọn, định danh chủng xạ khuẩn ưa nhiệt sinh amylase chịu nhiệt .35 3.1.1 Sàng lọc, tuyển chọn chủng xạ khuẩn chịu nhiệt sinh amylase 35 3.1.2 Định danh chủng xạ khuẩn ưa nhiệt sinh amylase chịu nhiệt .37 3.2 Nhiệt độ phản ứng thích hợp dịch enzyme amylase chịu nhiệt thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK66 .40 3.3 Điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chịu nhiệt thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK66 .40 3.3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy .41 3.3.2 Nguồn chất cảm ứng amylase 42 3.3.3 Nồng độ chất cảm ứng amylase 44 3.3.4 Nguồn nitrogen 45 3.3.5 Nồng độ nitrogen 47 3.3.6 pH môi trường .48 3.4 Tinh amylase chịu nhiệt thu nhận từ xạ khuẩn 50 3.4.1 Tinh amylase nhiệt độ tủa với muối ammonium sulfate .50 3.4.2 Đánh giá độ tinh xác định trọng lượng phân tử amylase chịu nhiệt điện di SDS-PAGE 50 3.4.3 Đánh giá hiệu tinh amylase chịu nhiệt 53 3.5 Đặc điểm hóa sinh amylase chịu nhiệt thu nhận từ xạ khuẩn .54 3.5.1 Nhiệt độ phản ứng .54 3.5.2 pH phản ứng thích hợp 56 3.5.3 Ảnh hưởng ion kim loại 57 3.5.4 Động học amylase chịu nhiệt 58 3.5.5 Khả bền nhiệt 59 3.5.6 Khả bền pH 60 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .62 4.1 Kết luận .62 4.2 Kiến nghị .62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 vii ANOVA Table for Hoat tinh by Thoi gian Source Sum of Df Squares Between Mean F-Ratio P-Value Square 5.55894E7 9.2649E6 27.48 4.012E7 119 337143 0.0000 groups Within groups Total (Corr.) 9.57094E7 125 Multiple Range Tests for Hoat tinh by Thoi gian Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups Ngay 18 97.6543 X Ngay 18 239.862 X Ngay 18 918.679 X Ngay 18 1257.17 X Ngay 18 1647.44 X Ngay 18 1775.2 X Ngay 18 1828.83 X 76 Phụ lục Ảnh hưởng nguồn nitrogen lên khả sinh tổng hợp amylase Streptomyces sp CNXK66 One-Way ANOVA - Hoat tinh by Nguon nitrogen Dependent variable: Hoat tinh Factor: Nguon nitrogen Number of observations: 126 Number of levels: ANOVA Table for Hoat tinh by Nguon nitrogen Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value Squares Between groups 9.96752E6 1.9935E6 Within groups 1.21153E8 120 1.00961E6 Total (Corr.) 1.31121E8 125 77 1.97 0.0872 Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nguon nitrogen Method: 95.0 percent LSD Nguon nitrogen Count Mean Homogeneous Groups NaNO3 21 900.73 X KNO3 21 1084.14 X NH4NO3 21 1122.27 X YEST EXTRACT 21 1272.59 XX TRYP 21 1436.34 XX PEP 21 1774.36 X ANOVA Table for Hoat tinh by Thoi gian Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value Squares Between groups 8.8063E7 Within groups 1.46772E7 4.30575E7 11 361828 Total (Corr.) 1.31121E8 12 78 40.56 0.0000 Multiple Range Tests for Hoat tinh by Thoi gian Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups Ngay 18 104.367 X Ngay 18 244.346 X Ngay 18 672.344 X Ngay 18 1613.5 X Ngay 18 1877.33 XX Ngay 18 2096.52 X Ngay 18 2247.1 X Phụ lục Ảnh hưởng nồng độ nguồn nitrogen lên khả sinh tổng hợp amylase Streptomyces sp CNXK66 One-Way ANOVA - Hoat tinh by Nong nguon nitrogen Dependent variable: Hoat tinh Factor: Nong nguon nitrogen Number of observations: 126 Number of levels: 79 ANOVA Table for Hoat tinh by Nong nguon nitrogen Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3.70429E7 7.40858E6 Within groups 1.94868E8 120 1.6239E6 Total (Corr.) 2.31911E8 125 4.56 0.0008 Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nong nguon nitrogen Method: 95.0 percent LSD Nong nguon Count Mean Homogeneous Groups nitrogen 0.2 21 971.69 X 21 1825.62 X 0.5 21 1842.33 X 1.5 21 2258.4 XX 21 2408.48 XX 21 2646.53 X 80 Phụ lục Ảnh hưởng pH môi trường lên khả sinh tổng hợp amylase Streptomyces sp CNXK66 One-Way ANOVA - Hoat tinh by pH moi truong Dependent variable: Hoat tinh Factor: pH moi truong Number of observations: 105 Number of levels: ANOVA Table for Hoat tinh by pH Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 6.16518E7 1.54129E7 Within groups 8.71575E7 100 871575 Total (Corr.) 1.48809E8 104 17.68 0.0000 Multiple Range Tests for Hoat tinh by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups 10 21 337.286 X 21 412.429 X 21 631.571 X 21 1669.52 X 21 2259.62 X 81 Phụ lục Đường chuẩn glucose Phụ lục Thông số động học amylase từ Streptomyces sp CNXK66 82 Phụ lục Kết phân tích Gel SDS-PAGE phần mềm GelAnalyzer 19.1 Phụ lục 10 Nhiệt độ phản ứng thích hợp amylase từ chủng Streptomyces sp CNXK66 One-Way ANOVA - Hoat tinh by Nhiet Dependent variable: Hoat tinh Factor: Nhiet Number of observations: 30 Number of levels: 10 83 ANOVA Table for Hoat tinh by Nhiet Source Sum of Df Mean Squares Between F-Ratio P-Value 106.76 0.0000 Square 2.26053E6 251171 47051.9 20 2352.6 groups Within groups Total (Corr.) 2.30759E6 29 Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nhiet Method: 95.0 percent LSD Nhiet Count Mean Homogeneous Groups 50 137.778 X 55 146.666 X 100 315.555 X 90 328.889 X 60 648.889 X 85 662.222 X 80 706.667 X 65 800.0 X 75 844.444 XX 70 897.778 X 84 Phụ lục 11 Khả bền nhiệt amylase từ chủng Streptomyces sp CNXK66 One-Way ANOVA - Hoat tinh by Nhiet Dependent variable: Hoat tinh Factor: Nhiet Source Sum of Df Mean Squares Between 2.97703E6 11 270639 52511.1 24 2187.96 groups Total (Corr.) 3.02954E6 P-Value 123.69 0.0000 Square groups Within F-Ratio 35 85 Multiple Range Tests for C Hoat tinh by Nhiet Method: 95.0 percent LSD Nhiet Count Mean Homogeneous Groups 120°C-60 51.1111 X a 120°C-30 134.444 X b 110°C-60 207.778 XX bc 110°C-30 216.667 X c 100°C-30 266.667 XX cd 100°C-60 315.556 XX de 90°C-60 342.222 XX de 90°C-30 368.889 X e 80°C-60 635.556 X f 80°C-30 746.667 X g 70°C-60 888.889 X h 70°C-30 942.222 X h 86 Phụ lục 11 Hiệu tinh amylase thu nhận từ Streptomyces sp CNXK 66 Dịch nuôi cấy Phân đoạn tủa với 20% (NH4)2SO4 Phân đoạn tủa với 30% (NH4)2SO4 Phân đoạn tủa với 40% (NH4)2SO4 Phân đoạn tủa với 50% (NH4)2SO4 Phân đoạn tủa với 60% (NH4)2SO4 Sephadex G - 75 Hiệu Protein Hoạt tính Hoạt tính tổng chung riêng (mg) (U/ml) (U/mg) 28,5 20,4×105 71400 100 0,22 0,04×105 2028 0,1 0,02 0,26 0,05×105 2050 0,2 0.02 17,7 0,5×105 2874 2,45 0,04 0.06 0,04x105 2529 0,1 0,03 0.06 0,04×105 2426 0.29 0,03 0.34 2,1×105 609656 10,2 8,5 87 suất Mức độ thu hồi tinh (%) Phụ lục 12 Kết α-Amylase sau tinh Sephacryl S-200 SDSPAGE đoạn A4 chủng Trichoderma pseudokoningii có khối lượng phân tử tương tự Streptomyces sp CNXK66 đoạn F11 đến F17 30 kDa 88 Phụ lục 13 Quy trình thí nghiệm 89 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC: Họ tên: Dương Thị Thùy Trang Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 17/2/1996 Nơi sinh: Tiền Giang Email: duongthithuytrangtg@gmail.com Điện thoại: 0963071759 II Q TRÌNH ĐÀO TẠO: 2015-2019: Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 2019-2023: Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh III Q TRÌNH CƠNG TÁC CHUN MƠN: Thời gian 10/2019-04/2023 Nơi cơng tác Cơng việc đảm nhiệm Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh Nghiên cứu viên Tp HCM, ngày tháng Năm 2023 Người khai 90