Xác định đặc điểm hóa sinh của enzyme cellulase thu nhận từ vi khuẩn bacillus subtilis th vk22

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Xác định đặc điểm hóa sinh enzyme cellulase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis TH-VK22 Mã số đề tài: 22/1SV SHTP03 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Mộc Tấn Đơn vị thực hiện: Viện Cơng nghệ sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, … LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, q Thầy Cơ Viện Cơng nghệ sinh học Thực phẩm tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức trình học tập trường; cán Phòng Quản lý khoa học Hợp tác quốc tế tạo điều kiện thuận lợi thủ tục giúp thực đề tài Tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn sâu sắc đến Thầy Phạm Tấn Việt đồng hành, tận tâm bảo truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức chuyên môn quý báu cho q trình thực đề tài Bên cạnh đó, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Nguyễn Thị Diệu Hạnh Thầy Nguyễn Ngọc Ẩn quan tâm, dạy dỗ hỗ trợ để tơi có nhìn sâu sắc vấn đề nghiên cứu hồn thành đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn bạn bè thành viên Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin kính chúc q Thầy Cô dồi sức khỏe gặt hái nhiều thành công nghiệp trồng người sống Tôi xin chân thành cảm ơn! PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng qt 1.1 Tên đề tài: Xác định đặc điểm hóa sinh enzyme cellulase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis TH-VK22 1.2 Mã số: 22/1SV SHTP03 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) Đơn vị công tác Vai trò thực đề tài Nguyễn Mộc Tấn Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài Dương Thảo Vi Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thư ký Hứa Huỳnh Minh Thảo Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên Bùi Nhật Tâm Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Dương Thị Thùy Trang Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Mạc Thành Tiến Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Trương Thiện Vĩnh An Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Vũ Duy Từ Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Nguyễn Thị Cẩm Hường Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia 1.4 Đơn vị chủ trì: 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2022 đến tháng năm 2023 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng… năm… 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2022 đến tháng năm 2023 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng có thay đổi so với thuyết minh ban đầu 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 20.000.000 VND (Hai mươi triệu đồng chẵn) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Cellulose nguồn sinh khối phong phú tự nhiên, chúng phân hủy enzyme cellulase cách thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic để tạo thành glucose [1] Hiện nay, enzyme cellulase enzyme nghiên cứu rộng rãi tiềm ứng dụng chúng nhiều lĩnh vực khác bao gồm công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp chất tẩy rửa, bột giấy, thức ăn chăn nuôi, nông nghiệp, y dược… [2] Theo nghiên cứu gần thực Freedonia “Thị trường enzyme cơng nghiệp tồn cầu” nhu cầu enzyme công nghiệp tăng 4,0% năm đạt tỷ la vào năm 2021, có enzyme cellulase [3] Một mối quan tâm hàng đầu thiếu hụt nhiên liệu hóa thạch tác động to lớn mơi trường Vì vậy, để giải vấn đề việc sử dụng enzyme celluase phân hủy vật liệu cellulose để sản xuất nhiên liệu sinh học cần thiết Cellulase sinh tổng hợp chủ yếu vi khuẩn, xạ khuẩn nấm mốc thơng qua q trình sinh trưởng phát triển chúng vật liệu cellulose [4] Phần lớn enzyme cellulase thị trường sản xuất nấm mốc khả sinh tổng hợp cellulase cho hoạt tính cao [5] Tuy nhiên, vi khuẩn với tốc độ tăng trưởng nhanh, khả chống chịu với điều kiện bất lợi từ môi trường chứng minh tiềm việc ứng dụng sản xuất enzyme cellulase [6] Một số loài vi khuẩn báo cáo có khả sản xuất enzyme phân giải cellulose Bacillus, Clostridium, Cellulomonas, Rummminococus, Alteromonas, Acetevibrio,… [4, 7] Trong số đó, lồi thuộc chi Bacillus bao gồm B Brevis [8], B pumilus [9], B amyloliquefaciens [10], B subtilis [11] ghi nhận có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase có hoạt tính cao Hiện nay, cellulase hoạt động ổn định điều kiện khắc nghiệt nhiệt độ cao, pH acid/base, nồng độ muối cao…thường có giá thành cao Một số biện pháp sử dụng khảo sát điều kiện ni cấy thích để tăng khả sản xuất cellulase, xác định cellulase có tính ổn định cao từ lồi vi sinh để giảm giá thành cellulase thị trường thương mại Sự sản xuất cellulase loài vi sinh vật chịu ảnh hưởng trực tiếp điều kiện nuôi cấy nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nitrogen, tốc độ lắc,… [12] Bên cạnh đó, nhiệt độ pH tác động đến sinh tổng hợp cellulase mà liên quan mật thiết đến hoạt động xúc tác cellulase Do vậy, việc tìm kiếm cellulase hoạt động điều kiện nhiệt độ cao, pH rộng thể hoạt tính ổn định có xuất chất hoạt động bề mặt, dung môi hữu cơ,… mang lại nhiều hiệu quy trình cơng nghiệp [13] Vì lý đề tài “Xác định đặc điểm sinh hóa enzyme cellulase thu nhận từ chủng Bacillus subtilis TH-VK22” thực nhằm mục đích cung cấp liệu điều kiện ni cấy thích hợp đặc điểm sinh hóa enzyme Kết nghiên cứu so sánh, đối chiếu với nghiên cứu nước nhằm khai thác tối đa tiềm ứng dụng cellulase từ chủng Bacillus subtilis TH-VK22 Mục tiêu a) Mục tiêu tổng quát Xác định đặc điểm hóa sinh enzyme cellulase thu nhận từ chủng Bacillus subtilis TH-VK22 b) Mục tiêu cụ thể ▪ Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis TH-VK22 ▪ Tinh được cellulase từ Bacillus subtilis TH-VK22 ▪ Xác định đặc điểm hóa sinh của enzyme cellulase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis TH-VK22 Phương pháp nghiên cứu 3.1 Chủng giống Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis TH-VK22 thuộc sưu tập giống Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Cơng nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh 3.2 Phương pháp 3.2.1 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase + Nguồn carbohydrate: tinh bột, glycerol, succrose, manitol, lactose, mantodextrin + Nồng độ carbohydrate: 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0% + Nguồn nitrogen: hữu (cao thịt, peptone, cao trùn quế) vô ((NH4)2SO4, NH4NO3 NH4Cl) + Nồng độ nitrogen: 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0% + Nguồn chất cảm ứng: rơm, xơ dừa, mùn cưa, giấy lọc, bã mía, trấu + Nồng độ chất cảm ứng: 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0% + Nhiệt độ: 25, 30, 35, 40, 45 50°C + pH ban đầu môi trường nuôi cấy: 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 3.2.2 Tinh cellulase từ Bacillus subtilis TH-VK22 + Tủa enzyme muối (NH4)2SO4 + Phương pháp thẩm tách màng dialysis + Tách chiết tinh enzyme phương pháp sắc ký lọc gel + Kiểm tra độ tinh phương pháp SDS-PAGE 3.3.3 Xác định đặc điểm sinh hóa cellulase + Nhiệt độ phản ứng: 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85 90⁰C + pH phản ứng: 3,0-10,0 (pH 3,0-7,0: citrate buffer, pH 6,0-9,0: phosphate buffer, pH 8,0-10,0: tris buffer) + Bền nhiệt: ủ enzyme 30 phút nhiệt độ (30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85°C) + Bền pH: ủ enzyme buffer có pH 3.0-10.0 (pH 3.0-7.0: citrate buffer, pH 6.0-9.0: phosphate buffer, pH 8.0-10.0: tris buffer) + Ion kim loại: phản ức xúc tác thủy phân chất thực điều kiện có mặt ion kim loại Ag+, K+, Na+, Mn2+, Ca2+, Ba2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+, Al3+ nồng độ cuối 10mM + Các chất hoạt động bề mặt: ủ enzyme tritone x-100, tween 20, tween 80, glycerol SDS với nồng độ cuối hỗn hợp phản ứng 1,0% trước thực phản ứng + Động học enzyme cellulase: giữ nguyên nồng độ enzyme thay đổi nồng độ chất + Nồng độ muối NaCl: NaCl với nồng độ 0, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000mM ủ với cellulase trước thực phản ứng enzyme chất Tổng kết kết nghiên cứu Đề tài “Xác định đặc điểm hóa sinh enzyme cellulase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis TH-VK22” đạt số kết sau: + Mơi trường ni cấy thích hợp cho chủng Bacillus subtilis TH-VK22 sinh tổng hợp cellulase bao gồm: 11,0% maltodextrin, 2,0% peptone, 0,5% rơm (w/v), K2HPO4 (1,0), KH2PO4 (1,0), MgSO4 (0,2), FeCl3 (0.05), CaCl2 (0.02) cao nấm men (2,5) (g/L) pH 5,0 35°C Hoạt tính cellulase cao ghi nhận 12966 U/ml, cao 74,2 lần so với môi trường BHM ban đầu (175,8 U/ml) + Cellulase từ Bacillus subtilis TH-VK22 tinh phương pháp tủa phân đoạn muối (NH4)2SO4 trước tinh sắc ký lọc gel Kết điện di cho thấy cellulase từ chủng vi khuẩn B subtilis TH-VK22 tinh enzyme có trọng lượng phân tử khoảng 33 kDa + Đặc điểm hóa sinh cellulase từ Bacillus subtilis TH-VK22: Nhiệt độ phản ứng thích hợp 50°C ổn định lên đến 55°C, pH thích hợp pH 5,0 có khả ổn định cao khoảng pH 5,0-10,0 Cellulase từ B subtilis TH-VK22 bị giảm hoạt tính số ion kim loại như: Al3+ , Fe2+ , Fe3+ tăng hoạt tính có xuất ion Na+, K+, Ag+, Ca2+ Mn2+ Trong đó, Mg2+ khơng ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase xử lý với EDTA cellulase giữ lại 87% hoạt tính Các chất hoạt động bề mặt tween 20, tween 80, triton x-100 glycerol làm khoảng 20% hoạt tính cellulase, enzyme giữ 100% hoạt tính phản ứng nồng độ NaCl lên đến 2000mM Bên cạnh đó, cellulase từ Bacillus subtilis TH-VK22 có giá trị Vmax: 373914 U/mg Km: 3,796 mg/ml + Công bố báo khoa học Tạp chí Khoa học Công nghệ IUH Đánh giá kết đạt kết luận Đề tài đạt kết phù hợp với mục tiêu ban đầu đề Ý nghĩa khoa học: Việc khảo sát điều kiện nuôi cấy, điều kiện phản ứng, tinh xác định đặc điểm sinh hóa enzyme cellulase thu nhận từ chủng Bacillus subtilis TH-VK22 cung cấp thêm sở liệu enzyme Nhằm so sánh đánh giá với nghiên cứu khác hoạt tính, khả bền nhiệt, bền pH, thơng số động học Vmax Km Từ đó, rút ưu nhược điểm enzyme cellulase từ Bacillus subtilis TH-VK22 có biện pháp cải thiện để phục vụ cho việc ứng dụng enzyme sau Ý nghĩa thực tiễn: Cellulase từ Bacillus subtilis TH-VK22 ứng dụng vào quy trình xử lý vật liệu cellulose lĩnh vực cơng nghiệp khác Qua đó, việc sử dụng enzyme góp phần nâng cao hiệu sản xuất, tiết kiệm thời gian, lượng nâng cao chất lượng sản phẩm Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) Tiếng Việt: Cellulase giữ vai trị quan trọng thị trường enzyme tồn cầu tiềm ứng dụng nhiều ngành công nghiệp khác Trong đó, cellulase có nguồn gốc từ chi Bacillus thường chứng minh có nhiều đặc tính sinh học bật Trong nghiên cứu này, chủng Bacillus subtilis TH-VK22 thể khả sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao ni cấy 35°C môi trường BHM bổ sung 11,0% maltodextrin, 2,0% peptone, 0,5% rơm pH 5,0 Cellulase từ B subtilis TH-VK22 tinh qua nhiều bước khác trọng lượng phân tử xác định khoảng 33 kDa Nhiệt độ pH thích hợp cho hoạt động cellulase tinh 50°C pH 5,0 Bên cạnh đó, enzyme thể ổn định nhiệt độ lên đến 55°C giữ lại 90% hoạt tính ủ pH 4,0-10,0 khoảng Ngoài ra, ion kim loại Ag+, K+, Na+, Ca2+, Mn2+ ghi nhận làm tăng hoạt tính cellulase, enzyme bị giảm hoạt tính thêm Fe2+ vào hỗn hợp phản ứng Celluase từ B subtilis TH-VK22 thể khả bền với chất hoạt động bề mặt tween 20, tween 80, triton x-100, glycerol…với 80% hoạt tính cịn lưu giữ so với đối chứng Hơn nữa, enzyme thể hoạt tính thủy phân chất cao mơi trường có nồng độ NaCl 2000mM Các thơng số động học Km Vmax cellulase với giá trị 3,796 mg/ml 373914 U/mg Nghiên cứu cung cấp thêm liệu điều kiện ni cấy thích hợp đặc điểm hóa sinh cellulase thu nhận từ B subtilis TH-VK22 Từ đó, enzyme khai thác tiềm ứng dụng cách hiệu quy trình cơng nhiệp khác Abstract: Because it has the potential to be used in a wide range of sectors, cellulase is a key player in the worldwide enzyme market In which exceptional biological characteristics of cellulases from the genus bacillus are frequently demonstrated In this experiment, strain Bacillus subtilis TH-VK22 showed high cellulase biosynthesis ability when cultivated at 35°C in BHM medium supplemented with 11.0% maltodextrin, 2.0% peptone, 0.5% straw, and pH 5.0 It was discovered that the molecular weight of the cellulase from B subtilis TH-VK22 was around 33 kDa after it had been purified using a number of procedures Purified cellulase activity is optimally exhibited at 50°C and pH 5.0, respectively Additionally, this enzyme demonstrates stability at temperatures as high as 55°C and keeps more than 90% of its activity after an hour of incubation at a ph range of 4.0 to 10.0 furthermore, it was discovered that adding the metal ions Ag+, K+, Na+, Ca2+, and Mn2+ to the reaction mixture increased the activity of cellulase whereas adding Fe2+ inhibited it Compared to the control, 80% of the activity of the cellulase from B subtilis TH-VK22 was retained against surfactants such glycerol, triton x-100, tween 20, and tween 80 Moreover, this enzyme displays strong substrate hydrolysis activity in 2000mM NaCl media cellulase's Km and Vmax kinetic parameters have values of 3.796 mg/ml and 373914 u/mg, respectively This study provided additional data on the appropriate culture conditions and biochemical characteristics of cellulase obtained from B subtilis TH-VK22 the application potential of this enzyme in many industrial processes can then be more fully used [64] A Sharma et al "Cellulases: classification, methods of determination and industrial applications," Applied Biochemistry Biotechnology Vol, 179, pp 1346-1380, 2016 [65] W Schwarz "The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria," Applied microbiology biotechnology advances Vol, 56, pp 634649, 2001 [66] P Saranraj et al "Microbial cellulases and its applictions," International Journal of Biochemistry Biotechnology Science Vol, 1, pp 1-12, 2012 [67] S Panchapakesan and A Naveen "Fungal cellulases: an overview," New future developments in microbial biotechnology bioengineering pp 9-18, 2016 [68] R Cohen et al "Processive endoglucanase active in crystalline cellulose hydrolysis by the brown rot basidiomycete Gloeophyllum trabeum," Applied environmental microbiology Vol, 71, no 5, pp 2412-2417, 2005 [69] Y Li and D B Wilson "Chitin binding by Thermobifida fusca cellulase catalytic domains," Biotechnology bioengineering Vol, 100, no 4, pp 644652, 2008 [70] T T Teeri "Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases," Trends in biotechnology Vol, 15, no 5, pp 160-167, 1997 [71] C C Liu and R H Doi "Properties of exgS, a gene for a major subunit of the Clostridium cellulovorans cellulosome," Gene Vol, 211, no 1, pp 3947, 1998 [72] M M Sánchez et al "Exo‐mode of action of cellobiohydrolase Cel48C from Paenibacillus sp BP‐23: A unique type of cellulase among Bacillales," European Journal of biochemistry Vol, 270, no 13, pp 2913-2919, 2003 [73] S Sangrila and T K Maiti "Cellulase production by bacteria: A review," British Microbiology Research Journal Vol, 3, no 3, pp 235-258, 2013 [74] Z Chen et al "Characterization of a beta-glucosidase from Bacillus licheniformis and its effect on bioflocculant degradation," AMB Express Vol, 7, pp 1-7, 2017 76 [75] G Narasimha et al "Purification and Characterization of β-Glucosidase from Aspergillus niger," International Journal of Food Properties Vol, 19, no 3, pp 652-661, 2016 [76] A K Kumar "UV mutagenesis treatment for improved production of endoglucanase and β-glucosidase from newly isolated thermotolerant actinomycetes, Streptomyces griseoaurantiacus," Bioresources bioprocessing Vol, 2, no 1, pp 1-10, 2015 [77] J K Saini et al "Lignocellulosic agriculture wastes as biomass feedstocks for second-generation bioethanol production: concepts and recent developments," Biotech Vol, 5, pp 337-353, 2015 [78] M J Pocas-Fonseca et al "Diversity among Cellulolytic Fungi," Microbial diversity: current perspectives potential applications IK International Pvt Ltd., New Delhi pp 165-180, 2005 [79] S P Thota et al "Macro-micro fungal cultures synergy for innovative cellulase enzymes production and biomass structural analyses," Renewable Energy Vol, 103, pp 766-773, 2017 [80] G P K Reddy et al "Cellulase production by Aspergillus niger on different natural lignocellulosic substrates," International Journal of Current Microbiology Applied Sciences Vol, 4, no 4, pp 835-845, 2015 [81] N Libardi et al "Domestic wastewater as substrate for cellulase production by Trichoderma harzianum," Process biochemistry Vol, 57, pp 190-199, 2017 [82] S El-Nahrawy et al "Optimization of culture conditions for production of cellulase by Aspergillus tubingensis KY615746 using rice straw waste," Environment, Biodiversity Soil Security Vol, 1, no 2017, pp 177-189, 2017 [83] H N Prasanna et al "Optimization of cellulase production by Penicillium sp," Biotech Vol, 6, pp 1-11, 2016 [84] R R Singhania et al "Solid-state fermentation of lignocellulosic substrates for cellulase production by Trichoderma reesei NRRL 11460," 2006 [85] R Tyagi et al "Culture Conditions for the Production of Cellulase from Novel Fungus Gliomastix indicus," Current Trends in Biotechnology Pharmacy Vol, 5, no 4, pp 1424-1433, 2011 77 [86] H Wei et al "Natural paradigms of plant cell wall degradation," Current Opinion in Biotechnology Vol, 20, no 3, pp 330-338, 2009 [87] E M Obeng et al "Lignocellulases: a review of emerging and developing enzymes, systems, and practices," Bioresources Bioprocessing Vol, 4, no 1, pp 1-22, 2017 [88] A K Ray et al "Optimization of fermentation conditions for cellulase production by Bacillus subtilis CY5 and Bacillus circulans TP3 isolated from fish gut," Acta Ichthyologica et Piscatoria Vol, 37, no 1, pp 47-53, 2007 [89] M Kazeem et al "Cellulase production by co-culture of Bacillus licheniformis and B paralicheniformis over monocultures on microcrystalline cellulose and chicken manure-supplemented rice bran media," BioResources Vol, 16, no 4, p 6850, 2021 [90] Anu et al "Optimization of cellulase production by Bacillus subtilis subsp subtilis JJBS300 and biocatalytic potential in saccharification of alkalinepretreated rice straw," Preparative Biochemistry and Biotechnology Vol, 51, no 7, pp 697-704, 2021 [91] A I Akintola et al "Production and physicochemical properties of thermostable, crude cellulase from Enterobacter cloacae IP8 isolated from plant leaf litters of Lagerstroemia indica Linn," Journal of Microbiology, Biotechnology Food Sciences Vol, 2021, pp 989-994, 2021 [92] M Islam et al "Optimization of fermentation condition for cellulase enzyme production from Bacillus sp," Malaysian Journal of Halal Research Vol, 2, no 2, pp 19-24, 2019 [93] M O Baltaci "Enhancement of cellulase production by co-culture of Streptomyces ambofaciens OZ2 and Cytobacillus oceanisediminis OZ5 isolated from rumen samples," Biocatalysis Biotransformation Vol, 40, no 2, pp 144-152, 2022 [94] L J Yin et al "Purification and characterization of a cellulase from Bacillus subtilis YJ1," Journal of Marine Science Technology Vol, 18, no 3, p 19, 2010 78 [95] J L Tymoczko, J M Berg, and L Stryer Biochemistry: a short course Macmillan, 2011 [96] M Théberge et al "Purification and characterization of an endoglucanase from Streptomyces lividans 66 and DNA sequence of the gene," Applied Environmental Microbiology Vol, 58, no 3, pp 815-820, 1992 [97] F Dehghanikhah et al "Purification and biochemical characterization of alkalophilic cellulase from the symbiotic Bacillus subtilis BC1 of the Leopard Moth, Zeuzera pyrina (L.)(Lepidoptera: Cossidae)," Current Microbiology Vol, 77, pp 1254-1261, 2020 [98] B Tang et al "Fermentation and purification of cellulase from a novel strain Rhizopus stolonifer var reflexus TP-02," Biomass Bioenergy Vol, 36, pp 366-372, 2012 [99] K Zhao et al "Extracellular production of novel halotolerant, thermostable, and alkali-stable carboxymethyl cellulase by marine bacterium Marinimicrobium sp LS-A18," Applied biochemistry biotechnology Vol, 168, pp 550-567, 2012 [100] M Gupta et al "Enhanced production of cellulase from Bacillus licheniformis K‐3 with potential for saccharification of rice straw," Energy Technology Vol, 3, no 3, pp 216-224, 2015 [101] Y H P Zhang et al "Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies," Biotechnology advances Vol, 24, no 5, pp 452-481, 2006 [102] I S Ng et al "A novel endo-glucanase from the thermophilic bacterium Geobacillus sp 70PC53 with high activity and stability over a broad range of temperatures," Extremophiles Vol, 13, pp 425-435, 2009 [103] S P Voutilainen et al "Cloning, expression, and characterization of novel thermostable family cellobiohydrolases," Biotechnology bioengineering Vol, 101, no 3, pp 515-528, 2008 [104] P Heinzelman et al "A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination," Proceedings of the National Academy of Sciences Vol, 106, no 14, pp 5610-5615, 2009 79 [105] J Hong et al "Cloning and functional expression of thermostable βglucosidase gene from Thermoascus aurantiacus," Applied microbiology biotechnology advances Vol, 73, pp 1331-1339, 2007 [106] J Y Kim et al "Purification and characterization of an alkaline cellulase from a newly isolated alkalophilic Bacillus sp HSH-810," Biotechnology letters Vol, 27, pp 313-316, 2005 [107] J Singh et al "Purification and characterisation of alkaline cellulase produced by a novel isolate, Bacillus sphaericus JS1," Journal of Industrial Microbiology Biotechnology Vol, 31, no 2, pp 51-56, 2004 [108] Y Hakamada et al "Thermostable alkaline cellulase from an alkaliphilic isolate, Bacillus sp KSM-S237," Extremophiles Vol, 1, pp 151-156, 1997 [109] L Ma et al "Characterization of an acidic cellulase produced by Bacillus subtilis BY-4 isolated from gastrointestinal tract of Tibetan pig," Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers Vol, 56, pp 67-72, 2015 [110] F Azadian et al "Purification and biochemical properties of a thermostable, haloalkaline cellulase from Bacillus licheniformis AMF-07 and its application for hydrolysis of different cellulosic substrates to bioethanol production," Molecular Biology Research Communications Vol, 5, no 3, p 143, 2016 [111] K Holmberg "Interactions between surfactants and hydrolytic enzymes," Colloids Surfaces B: Biointerfaces Vol, 168, pp 169-177, 2018 [112] A Karnchanatat et al "Purification and biochemical characterization of an extracellular β-glucosidase from the wood-decaying fungus Daldinia eschscholzii (Ehrenb.: Fr.) Rehm," FEMS Microbiology Letters Vol, 270, no 1, pp 162-170, 2007 [113] A Sharma et al "Cellulases: classification, methods of determination and industrial applications," Applied Biochemistry Biotechnology Vol, 179, pp 1346-1380, 2016 [114] D Dienes et al "Treatment of recycled fiber with Trichoderma cellulases," Industrial crops products Vol, 20, no 1, pp 11-21, 2004 [115] R C Kuhad et al "Microbial cellulases and their industrial applications," Enzyme research Vol, 2011, 2011 80 [116] M Karmakar and R R Ray "Current trends in research and application of microbial cellulases," Research Journal of Microbiology Vol, 6, no 1, p 41, 2011 [117] M K Bhat "Cellulases and related enzymes in biotechnology," Biotechnology advances Vol, 18, no 5, pp 355-383, 2000 [118] I Yedidia et al "Effect of Trichoderma harzianum on microelement concentrations and increased growth of cucumber plants," Plant soil Vol, 235, pp 235-242, 2001 [119] S Fontaine et al "Mechanisms of the priming effect in a savannah soil amended with cellulose," Soil Science Society of America Journal Vol, 68, no 1, pp 125-131, 2004 [120] L M J de Carvalho et al "A study of retention of sugars in the process of clarification of pineapple juice (Ananas comosus, L Merril) by micro-and ultra-filtration," Journal of Food Engineering Vol, 87, no 4, pp 447-454, 2008 [121] N N Ẩn et al "Phân lập khảo sát điều kiện sinh tổng hợp cellulase hai chủng vi khuẩn TH-VK22 TH-VK24," Journal of Science and Technology-IUH Vol, 39, no 03, 2019 [122] S Singh et al "Isolation, Identification, and Characterization of a Cellulolytic Bacillus amyloliquefaciens Strain SS35 from Rhinoceros Dung," ISRN Microbiol Vol, 2013, p 728134, 2013 [123] Y S Mostafa et al "Thermostable Cellulase Biosynthesis from Paenibacillus alvei and its Utilization in Lactic Acid Production by Simultaneous Saccharification and Fermentation," Open Life Sci Vol, 15, pp 185-197, 2020 [124] G Banerjee et al "Effect of Culture Parameters on Protease and Cellulase Production by Two Bacterial Strains, Corynebacterium alkanolyticum Ath3 and Bacillus licheniformis Cbh7 Isolated from Fish Gut," Biotropia Vol, 24, no 3, pp 192-201, 2017 [125] B Saraswati et al "Cellulase Production by Bacillus subtilis isolated from Cow Dung," Archives of Applied Science Research Vol, 4, no 1, pp 269279, 2012 81 [126] S K Pramani et al "Fermentation optimization of cellulase production from sugarcane bagasse by Bacillus pseudomycoides and molecular modeling study of cellulase," Curr Res Microb Sci Vol, 2, p 100013, Dec 2021 [127] H Ikram et al "Evaluation, Characterization and Molecular Analysis of Cellulolytic Bacteria from Soil in Peshawar, Pakistan," Microbiology and Biotechnology Letters Vol, 50, no 2, pp 245-254, 2022 [128] M A Abdel-Rahman et al "A Novel Promising Thermotolerant CellulaseProducing Bacillus licheniformis 1-1v Strain Suitable for Composting of Rice Straw," International Journal of Advanced Research Vol, 3, no 12, pp 413-423, 2015 [129] V Goyal et al "Parametric optimization of cultural conditions for carboxymethyl cellulase production using pretreated rice straw by Bacillus sp 313SI under stationary and shaking conditions," Biotechnology research international Vol, 2014, 2014 [130] E A Abada et al "Optimization of Cellulase Production from Bacillus albus (MN755587) and Its Involvement in Bioethanol Production," Polish Journal of Environmental Studies Vol, 30, no 3, pp 2459-2466, 2021 [131] F Li et al "Screening of cellulose degradation bacteria from Min pigs and optimization of its cellulase production," Electronic Journal of Biotechnology Vol, 48, pp 29-35, 2020 [132] H N Prasanna et al "Optimization of cellulase production by Penicillium sp.," Biotech Vol, 6, no 2, p 162, Dec 2016 [133] A L Mokale Kognou et al "Characterization of Cellulose-Degrading Bacteria Isolated from Soil and the Optimization of Their Culture Conditions for Cellulase Production," Appl Biochem Biotechnol Vol, 194, no 11, pp 5060-5082, Nov 2022 [134] Y H Li et al "A novel thermoacidophilic endoglucanase, Ba-EGA, from a new cellulose-degrading bacterium, Bacillus sp AC-1," Applied Microbiology Biotechnology Vol, 70, pp 430-436, 2006 [135] T R Samiullah et al "Isolation, purification and characterization of extracellular β-glucosidase from Bacillus sp," Adv Environ Biol Vol, 3, no 3, pp 269-277, 2009 82 [136] B M Asha et al "Purification and characterization of a thermophilic cellulase from a novel cellulolytic strain, Paenibacillus barcinonensis," Journal of microbiology biotechnology Vol, 22, no 11, pp 1501-1509, 2012 [137] P Saroj and K Nasasimhulu "Biochemical characterization of thermostable carboxymethyl cellulase and β-glucosidase from Aspergillus fumigatus JCM 10253," Applied Biochemistry Biotechnology advances Vol, 194, no 6, pp 2503-2527, 2022 [138] S Karthikeyan et al "Purification and Characterization of Cellulase from Aspergillus niger," Recent Progress in Microbiology Biotechnology advances p 120 [139] A Bettache et al "Purification and characterization of an endoglucanase produced from Streptomyces sp Strain BPNG23," Journal of Microbiology, Biotechnology Food Sciences Vol, 2021, pp 284-288, 2021 [140] M A-M Yassien et al "Production, purification and characterization of cellulase from Streptomyces sp.," African Journal of Microbiology Research Vol, 8, no 4, pp 348-354, 2014 [141] J K Seo et al "Characterization of cellulolytic and xylanolytic enzymes of Bacillus licheniformis JK7 isolated from the rumen of a native Korean goat," Asian-Australasian journal of animal sciences Vol, 26, no 1, p 50, 2013 [142] M Alvarez-Navarrete et al "Purification and Biochemical Characterization of a β-glucosidase from Penicillium commune ITV01," Iranian Journal of Energy Environment Vol, 5, no 3, 2014 [143] S Banerjee et al "Production, purification, and characterization of cellulase from Acinetobacter junii GAC 16.2, a novel cellulolytic gut isolate of Gryllotalpa africana, and its effects on cotton fiber and sawdust," Annals of microbiology Vol, 70, no 1, pp 1-16, 2020 [144] W Saibi and A Gargouri "Purification and biochemical characterization of an atypical β-glucosidase from Stachybotrys microspora," Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic Vol, 72, no 3-4, pp 107-115, 2011 [145] N Balasubramanian et al "Purification and biochemical characterization of a novel thermo-stable carboxymethyl cellulase from Azorean isolate Bacillus 83 mycoides S122C," Applied biochemistry biotechnology Vol, 168, pp 21912204, 2012 84 PHỤ LỤC Phục lục Thành phần môi trường Brusnell Haas Medium (BHM) Lunia Bertani (LB) BHM: MgSO4 0,2 g/L, CaCl2 0,02 g/L, KH2PO4 1,0 g/L, K2HPO4 1,0 g/L, NH4NO3 1,0 g/L, FeCl3 0,05 g/L LB: Peptone 10,0 g/L, Cao nấm men 5,0 g/L, NaCl 10,0 g/L Phụ lục Đường chuẩn glucose Phụ lục Đường chuẩn Albumin 85 Phụ lục Thông số động học cellulase từ Bacillus subtilis TH-VK22 86 Phụ lục Kết phân tích Gel SDS-PAGE phần mềm GelAnalyzer 19.1 87 Phụ lục Các công thức dùng q trình tinh • Protein tổng (mg) = Nồng độ protein (mg/ml) * Tổng thể tích phân đoạn (ml) • Hoạt tính chung (U) = Hoạt tính ml dịch cellulase (U/ml) * Tổng thể tích phân đoạn (ml) • Hoạt tính riêng (U/mg) = Hoạt tính chung (U) / Protein tổng (mg) phân đoạn • Mức độ tinh = Hoạt tính riêng phân đoạn (U/mg) / Hoạt tính riêng dịch enzyme ban đầu (U/mg) • Hiệu suất thu hồi (%) = (Hoạt tính chung phân đoạn (U) / Hoạt tính chung dịch enzyme ban đầu (U)) * 100 Phụ lục Giấy chấp nhận đăng kết nghiên cứu báo 88 89 có sẵn, chủ nhiệm cần photo đính kèm sau nội dung trên, sử dụng lý hợp đồng với phịng kế tốn Khi lý, báo cáo in thành 03 cuốn, đó, 01 đóng bìa mạ vàng, 02 đóng bìa cứng thường) Hợp đồng thực đề tài nghiên cứu khoa học Thuyết minh đề tài phê duyệt Quyết định nghiệm thu Hồ sơ nghiệm thu (biên họp, phiếu đánh giá, bảng tổng hợp điểm, giải trình, phiếu phản biện) Sản phẩm nghiên cứu (bài báo, vẽ, mơ hình .) 90