Xác định đặc điểm hóa sinh của protease được thu nhận từ xạ khuẩn streptomyces sp cnxk72

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƯƠNG THẢO VI XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH CỦA PROTEASE ĐƯỢC THU NHẬN TỪ XẠ KHUẨN Streptomyces sp CNXK72 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Tấn Việt Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 27 tháng 07 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: GS.TS Trần Đình Thắng – Chủ tịch Hợi đồng TS Hồ Thiên Hoàng – Phản biện PGS.TS Ngô Đại Nghiệp – Phản biện PGS.TS Võ Thanh Sang - Ủy viên TS Lưu Thảo Nguyên – Thư ký CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM VIỆN TRƯỞNG GS TS Trần Đình Thắng PGS.TS Nguyễn Bá Thanh BỘ CƠNG THƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Dương Thảo Vi MSHV: 19630601 Ngày, tháng, năm sinh: 14/07/1996 Nơi sinh: Tiền Giang Ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 8420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Xác định đặc điểm hóa sinh protease thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nhiệm vụ: Xác định đặc điểm hóa sinh protease thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 Nội dung: Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp protease Tinh protease từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 Xác định đặc điểm hóa sinh enzyme protease II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 09/05/2022 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 09/04/2023 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Phạm Tấn Việt Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2023 NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM VIỆN TRƯỞNG LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn tốt nghiệp “Xác định đặc điểm hóa sinh protease thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72”, xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Viện Công nghệ sinh học Thực phẩm hỗ trợ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập nghiên cứu Đặc biệt tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Thầy Phạm Tấn Việt, Cô Nguyễn Thị Diệu Hạnh Thầy Nguyễn Ngọc Ẩn tận tâm giảng dạy, hướng dẫn, động viên cho lời khuyên vơ hữu ích để tơi vững tâm đường học tập nghiên cứu khoa học Tơi cảm ơn bạn phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh hỗ trợ, giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Tơi xin chân thành cám ơn! i TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Các protease có nguồn gốc từ xạ khuẩn thường chứng minh có nhiều đặc tính sinh học bật Trong nghiên cứu này, chủng xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 thể khả sản xuất protease với đợ lớn vịng phân giải casein 30,5±2,0 mm Đặc điểm đại thể, vi thể trình tự vùng gen mã hóa cho 16S rRNA cho thấy chủng có mối quan hệ gần gũi với Streptomyces odorifer (99,65%) Mơi trường ni cấy thích hợp cho CNXK72 sinh tổng hợp protease hoạt tính cao mơi trường Gause I cải tiến+0,5% maltose+0,3% cao trùn, lắc 150 vòng/phút 30℃, pH 7,0 Protease từ Streptomyces sp CNXK72 tinh quy trình gồm hai bước tủa phân đoạn với muối ammonium sulfate chạy sắc ký lọc gel cột Sephadex G-75 Mức độ tinh protease 182 lần với hiệu suất thu hồi khoảng 50% so với dịch chiết thô Trọng lượng phân tử protease ước tính 46 kDa dựa kết SDS-PAGE Protease thu nhận từ CNXK72 có khả hoạt đợng khoảng 30°C-80°C, pH 4,0-10,0, hoạt tính tốt 55°C pH 7,0 đệm Tris-base Trong số ion kim loại kiểm tra ion Na+ , K+ , Mg2+ Ca2+ giúp tăng khả xúc tác chất protease Trong ion Mn2+ Fe2+ gây ức chế mạnh mẽ hoạt động protease Đối với ion lại Zn2+, Cu2+ Al3+ gần ức chế hồn tồn hoạt đợng protease từ Streptomyces sp CNXK72 Khi xử lý với EDTA, hoạt tính cịn lại protease 25% Hai thống số động học quan trọng KM Vmax protease từ CNXK72 ghi nhận 2,725 mg/ml 2463 U/mg Ngồi ra, protease cịn thể khả bền nhiệt lên đến 60ºC bền pH 4,0-10,0 Khả thủy phân chất tốt nhiệt độ cao hoạt động khoảng pH rộng cho thấy tiềm ứng dụng ngành công nghiệp chất tẩy rửa công nghiệp thuộc da protease ii ABSTRACT Proteases derived from actinomycetes have often been shown to possess many remarkable biological properties In this study, CNXK72 was able to produce proteases with the resulting diameter of hydrolysis zone of casein being 30.5±2.0 mm The macroscopic and microscopic features and sequence of their 16S rRNA gene regions show that this strain was closely related to Streptomyces odorifer (99.65%) The suitable culture medium for CNXK72 to biosynthesize highly active protease was modified Gause I medium + 0.5% maltose + 0.3% earthworm extract, shaken 150 rpm at 30℃, pH 7.0 A protease from Streptomyces sp CNXK72 was purified by a two-step procedure using ammonium sulfate and gel filtration on a Sephadex G-75 column The purification factor was more than 182-fold with a yield of about 50% from the crude extract The molecular mass of the protease was estimated to be 46 kDa based on SDS-PAGE Streptomyces sp CNXK 72-derived protease was active between 30°C-80°C, pH range of 4.0-10.0, with maximum activity at 55°C and pH 7.0 in Tris-base buffer Among the metal ions examined, Na+, K+, Mg2+, and Ca2+ ions increased the protease's substrate catalysis ability Meanwhile, Mn2+ and Fe2+ cause strong inhibition of protease activity For the remaining ions, Zn2+, Cu2+, and Al3+, they almost completely inhibited the protease activity of Streptomyces sp CNXK72 When treated with EDTA, the residual protease activity was 25% Two important kinetic parameters KM and Vmax of protease from CNXK72 were recorded as 2.725 mg/ml and 2463 U/mg, respectively In addition, this protease also exhibits temperature stability up to 60ºC and is stable at pH 4.0-10.0 The good substrate hydrolysis at high temperatures and wide pH ranges indicates potential applications in detergent and tanning industries of this protease iii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các kết nghiên cứu kết luận luận văn trung thực, không chép từ một nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu (nếu có) thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Học viên Dương Thảo Vi iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu .3 Ý nghĩa thực tiễn đề tài .4 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Protease 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Ứng dụng .10 1.2 Xạ khuẩn 11 1.2.1 Đặc điểm xạ khuẩn 11 1.2.2 Vai trò ứng dụng xạ khuẩn .14 1.2.3 Đặc điểm protease từ xạ khuẩn 15 1.3 Kỹ thuật tinh enzyme 17 1.3.1 Kết tủa 18 1.3.2 Sắc ký lọc gel .19 1.3.3 Sắc ký trao đổi ion .20 1.3.4 Sắc ký lực .20 1.3.5 Sắc ký lỏng cao áp .20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất .22 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 23 2.1.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu .24 2.2 Phương pháp nghiên cứu .25 2.2.1 Nuôi cấy bảo quản giống xạ khuẩn .25 v Xác định đặc điểm đại thể, vi thể xạ khuẩn 25 Xác định sơ bộ khả sinh protease .25 Định danh xạ khuẩn phương pháp giải trình tự 26 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford 26 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến 27 Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh tổng hợp protease .30 2.2.8 Tinh enzyme protease từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 32 2.2.9 Xác định đặc điểm hóa sinh protease tinh 36 2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 39 3.1 Khả sinh protease Streptomyces sp CNXK72 .39 3.2 Đặc điểm hình thái định danh xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 .39 3.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp protease từ Streptomyces sp CNXK72 41 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn Carbohydrate nồng độ Carbohydrate 41 3.3.2 Ảnh hưởng nguồn Nitrogen nồng độ Nitrogen 44 3.3.3 Ảnh hưởng pH môi trường nhiệt độ nuôi cấy 47 3.4 Protease tinh từ Streptomyces sp CNXK72 49 3.5 Đặc điểm hóa sinh protease từ Streptomyces sp CNXK72 52 3.5.1 Nhiệt độ phản ứng .52 3.5.2 pH phản ứng 53 3.5.3 Khả bền nhiệt 54 3.5.4 Khả bền pH 56 3.5.5 Ảnh hưởng ion kim loại 57 3.5.6 Động học protease 58 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .60 4.1 Kết luận 60 4.2 Kiến nghị .60 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA HỌC VIÊN 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 68 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 83 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Mơ hình protease thủy phân phân tử protein .5 Hình 1.2 Sơ đồ phân loại enzyme protease Hình 1.3 Phân loại protease dựa vị trí phân cắt liên kết peptide Hình 1.4 Sơ đồ biểu diễn vòng đời xạ khuẩn .12 Hình 1.5 Các loại chuỗi bào tử khác xạ khuẩn 13 Hình 1.6 Ứng dụng loại enzyme ngoại bào khác sản xuất từ xạ khuẩn Streptomyces sp 15 Hình 2.1 Đợng học Michaelis–Menten .37 Hình 3.1 Vịng phân giải casein Streptomyces sp CNXK72 .39 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái Streptomyces sp .40 Hình 3.3 Cây phát sinh lồi dựa đoạn gene mã hóa 16S rRNA Streptomyces sp CNXK72 41 Hình 3.4 Ảnh hưởng nguồn carbohydrate lên khả sinh tổng hợp protease từ Streptomyces sp CNXK72 42 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng đợ maltose lên khả sinh tổng hợp protease từ Streptomyces sp CNXK72 43 Hình 3.6 Ảnh hưởng nguồn nitrogen lên khả sinh tổng hợp protease từ Streptomyces sp CNXK72 45 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng đợ cao trùn lên khả sinh tổng hợp protease từ Streptomyces sp CNXK72 46 Hình 3.8 Ảnh hưởng pH mơi trường lên khả sinh tổng hợp protease từ Streptomyces sp CNXK72 47 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt đợ ni cấy lên khả sinh tổng hợp protease từ Streptomyces sp CNXK72 48 Hình 3.10 Hoạt tính protease phân đoạn sắc ký lọc gel .50 Hình 3.11 Kết SDS-PAGE 50 Hình 3.12 Nhiệt đợ phản ứng protease từ Streptomyces sp CNXK72 52 Hình 3.13 pH phản ứng protease từ Streptomyces sp CNXK72 .54 Hình 3.14 Khả bền nhiệt protease từ Streptomyces sp CNXK72 .55 Hình 3.15 Khả bền pH protease từ Streptomyces sp CNXK72 56 Hình 3.16 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt động protease từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 58 Hình 3.17 Đợng học protease từ Streptomyces sp CNXK72 59 vii Các tín hiệu nucleotide vùng trình tự gene mã hóa cho 16S rRNA khuếch đại với mồi 1540R 5’-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3’ Trình tự vùng gene mã hóa cho 16S rRNA với 1444 nucletides sử dụng để giống trình tự gene tương đồng ngân hàng liệu NCBI phần mềm SeaView xây dựng phát sinh loài phần mềm Mega 5,0 5’CTTACCATGCAAGTCGAACGATGAACCGCTTTCGGGCGGGGATTAGTG GCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAA GCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACTGTCCATCGCATGGTG GATGGTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCT TGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGA GAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAG CGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGC AGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAAC TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAA TTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAA GCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTT CGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATAT CAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACG CTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGT CCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGC AAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAG CATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACA TACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAG GTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAGCGCAACCCCTTGTCCCGTGNTGCCAGCAGGCCCTTGTGG TGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGG GGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGC TACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCT CAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGA AGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGT TCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACAC 69 CCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGG GACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGG-3’ Phụ lục 3: Ảnh hưởng nguồn carbohydrate khác đến khả sinh tổng hợp protease Streptomyces sp, CNXK72 Analysis of Variance for Hoat tinh - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Nguon C 108938, 27234,5 35,38 0,0000 B:Thoi gian 110528, 27632,1 35,90 0,0000 RESIDUAL 50800,9 66 769,711 TOTAL (CORRECTED) 270267, 74 MAIN EFFECTS Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nguon carbohydrate Method: 95,0 percent LSD Nguon C Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups Starch 15 38,1666 7,16338 X Glucose 15 48,3611 7,16338 XX Arabinose 15 62,9999 7,16338 X Lactose 15 123,25 7,16338 X Maltose 15 128,5 7,16338 X 70 Phục lục 4: Ảnh hưởng nồng độ maltose đến khả sinh tổng hợp protease Streptomyces sp, CNXK72 Analysis of Variance for Hoat tinh - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Nong C 535081, 107016, 24,60 0,0000 B:Thoi gian 257701, 64425,3 14,81 0,0000 RESIDUAL 347965, 80 4349,57 TOTAL (CORRECTED) 1,14075E6 89 MAIN EFFECTS Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nong maltose Method: 95,0 percent LSD Nong C Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 15 5,33333 17,0285 X 15 6,7778 17,0285 X 15 10,0278 17,0285 X 15 154,389 17,0285 X 0,25 15 158,528 17,0285 X 0,5 15 170,833 17,0285 X 71 Phụ lục 5: Ảnh hưởng nguồn nitrogen khác đến khả sinh tổng hợp protease Streptomyces sp, CNXK72 Analysis of Variance for Hoat tinh - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Nguon N 190060, 31676,6 22,08 0,0000 B:Thoi gian 1,18124E6 295310, 205,83 0,0000 RESIDUAL 134863, 94 1434,71 TOTAL (CORRECTED) 1,50616E6 104 MAIN EFFECTS Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nguon nitrogen Method: 95,0 percent LSD Nguon N Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups NH4Cl 15 116,611 9,77994 X NH4NO3 15 130,5 9,77994 X (NH4)2SO4 15 136,778 9,77994 X KNO3 15 195,944 9,77994 X Cao thit 15 196,889 9,77994 X Peptone 15 199,417 9,77994 X Cao trun 15 240,694 9,77994 X 72 Phụ lục 6: Ảnh hưởng nồng độ cao trùn đến khả sinh tổng hợp protease Streptomyces sp, CNXK72 Analysis of Variance for Hoat tinh - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Nong N 30973,1 7743,28 19,51 0,0000 B:Thoi gian 3,00962E6 334402, 842,65 0,0000 RESIDUAL 53971,1 136 396,846 TOTAL (CORRECTED) 3,09456E6 149 MAIN EFFECTS Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nong cao trun Method: 95,0 percent LSD Nong N Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 0,5 30 165,639 3,63706 X 0,1 30 177,833 3,63706 X 0,4 30 187,444 3,63706 XX 0,2 30 192,507 3,63706 X 0,3 30 208,528 3,63706 X 73 Phụ lục 7: Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp protease Streptomyces sp, CNXK72 Analysis of Variance for Hoat tinh - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:pH 137676, 34418,9 47,36 0,0000 B:Thoi gian 5,28973E6 587748, 808,74 0,0000 RESIDUAL 98837,2 136 726,744 TOTAL (CORRECTED) 5,52624E6 149 MAIN EFFECTS Multiple Range Tests for Hoat tinh by pH Method: 95,0 percent LSD pH Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 9,0 30 197,611 4,92187 X 8,0 30 227,889 4,92187 X 5,0 30 258,528 4,92187 X 6,0 30 269,84 4,92187 XX 7,0 30 280,618 4,92187 X 74 Phục lục 8: Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp protease Streptomyces sp, CNXK72 Analysis of Variance for Hoat tinh - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Nhiet 4,11375E6 1,02844E6 32,18 0,0000 B:Thoi gian 4,04358E6 449287, 14,06 0,0000 RESIDUAL 4,34621E6 136 31957,4 TOTAL (CORRECTED) 1,25035E7 149 MAIN EFFECTS Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nhiet nuoi cay Method: 95,0 percent LSD Nhiet Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 45 30 8,05557 32,6381 X 40 30 76,373 32,6381 X 35 30 274,195 32,6381 X 25 30 364,958 32,6381 XX 30 30 440,083 32,6381 X Phụ lục 9: Nhiệt độ phản ứng protease ngoại bào thu nhận từ Streptomyces sp, CNXK72 One-Way ANOVA – Hoat tinh (U/mg) by Nhiet phan ung Dependent variable: Hoat tinh (U/mg) Factor: Nhiet phan ung Number of observations: 33 Number of levels: 11 75 ANOVA Table for Hoat tinh (U/mg) by Nhiet phan ung Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0000 Between groups 608419, 10 60841,9 Within groups 1174,22 22 53,3738 Total (Corr,) 609593, 32 1139,92 Multiple Range Tests for Hoat tinh (U/mg) by Nhiet phan ung Method: 95,0 percent LSD Col_1 Count Mean Homogeneous Groups 80 513,75 X 30 748,792 X 75 807,321 X 70 872,352 X 35 899,294 X 40 931,345 X 65 933,668 X 45 962,003 X 60 966,648 X 50 972,687 X 55 1013,1 X Phụ lục 10: pH phản ứng protease ngoại bào thu nhận từ Streptomyces sp, CNXK72 One-Way ANOVA - Hoat tinh (U/mg) by pH phan ung Dependent variable: Hoat tinh (U/mg) Factor: pH Number of observations: 30 76 Number of levels: 10 ANOVA Table for Hoat tinh (U/mg) by pH phan ung Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 479608, 53289,8 Within groups 4582,97 20 229,149 Total (Corr,) 484191, 29 232,56 0,0000 Multiple Range Tests for Hoat tinh (U/mg) by pH phan ung Method: 95,0 percent LSD Col_1 Count Mean Homogeneous Groups 10-Tris 802,676 X 9-Tris 866,778 X 8-Phosphate 903,939 X 8-Tris 1015,42 X 6-Citrate 1097,18 X 6-Phosphate 1114,83 X 4-Citrate 1117,61 X 5-Citrate 1144,56 X 7-Tris 1151,99 X 7-Phosphate 1166,85 X Phụ lục 11: Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính protease ngoại bào thu nhận từ Streptomyces sp, CNXK72 One-Way ANOVA - Hoat tinh (U/mg) by Ion kim loai (4 mM) Dependent variable: Hoat tinh rieng (U/mg) Factor: Ion kim loai (4 mM) Number of observations: 33 77 Number of levels: 11 ANOVA Table for Hoạt tính (U/mg) by Ion kim loại (4 mM) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1,18019E7 10 1,18019E6 Within groups 14629,3 22 664,966 Total (Corr,) 1,18165E7 32 1774,81 0,0000 Multiple Range Tests for Hoạt tính (U/mg) by Ion kim loại (4 mM) Method: 95,0 percent LSD Ion kim loai Count Mean Homogeneous Groups Al3+ 18.5805 X Zn2+ 63.1735 X Cu2+ 67.8187 X EDTA 261.984 X Fe3+ 434.783 X Mn2+ 521.182 X DC 1042.36 X K+ 1227.24 X Na+ 1233.74 X Ca2+ 1608.14 X Mg2+ 1638.8 X Phụ lục 12: Khả bền nhiệt protease ngoại bào thu nhận từ Streptomyces sp, CNXK72 Dependent variable: Hoat tinh Factors: Nhiet Covariates: Thoi gian Number of complete cases: 72 78 Analysis of Variance for Hoat tinh - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 1584,16 1584,16 47,54 0,0000 A:Nhiet 120337, 11 10939,7 328,32 0,0000 RESIDUAL 1965,91 59 33,3205 TOTAL (CORRECTED) 123887, 71 COVARIATES Thoi gian MAIN EFFECTS Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nhiet Method: 95,0 percent LSD Nhiet Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 100 0,0 2,35657 X 90 0,0 2,35657 X 80 0,0 2,35657 X 70 19,9242 2,35657 X 60 47,7273 2,35657 X 50 84,1667 2,35657 X 30 91,5909 2,35657 X 93,1061 2,35657 X 40 93,3081 2,35657 XX 94,3182 2,35657 XX 79 Analysis of Variance for Hoat tinh - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value COVARIATES Nhiet 75050,6 75050,6 109,59 0,0000 A:Thoi gian 1584,16 1584,16 2,31 0,1328 RESIDUAL 47252,0 69 684,812 TOTAL (CORRECTED) 123887, 71 MAIN EFFECTS Multiple Range Tests for Hoat tinh by Thoi gian Method: 95,0 percent LSD Thoi gian Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 60 36 54,9116 4,36149 X 30 36 64,2929 4,36149 X Contrast Sig, Difference +/- Limits 30 - 60 * 9,38131 0,247763 * denotes a statistically significant difference, Phụ lục 13: Khả bền pH protease ngoại bào thu nhận từ Streptomyces sp, CNXK72 One-Way ANOVA - Hoat tinh by pH Dependent variable: Hoat tinh Factor: pH Number of observations: 33 Number of levels: 11 80 ANOVA Table for Hoat tinh by pH Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2,62549E6 10 262549, Within groups 6341,67 22 288,258 Total (Corr,) 2,63183E6 32 Multiple Range Tests for Hoat tinh by pH Method: 95,0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups 3-Citrate 259,167 X 10-Tris 564,167 X 9-Tris 605,833 X 4-Citrate 828,333 X 5-Citrate 933,333 X 6-Citrate 1034,17 X 8-Phosphate 1061,67 XX 6-Phosphate 1064,17 X 7-Phosphate 1076,67 X 8-Tris 1152,5 X 7-Tris 1206,67 X 81 910,81 0,0000 Phụ lục 14: Động học protease ngoại bào thu nhận từ Streptomyces sp, CNXK72 Phụ lục 15: Kết phân tích SDS-PAGE phần mềm GelAnalyzer 19,1 82 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN I, LÝ LỊCH SƠ LƯỢC: Họ tên: Dương Thảo Vi Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 14/07/1996 Nơi sinh: Tiền Giang Email: duongthaovi96@gmail.com Điện thoại: 0376838493 II, QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO: 2014-2018: Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 2019-2023: Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh III, Q TRÌNH CƠNG TÁC CHUN MƠN: Thời gian 11/2018-10/2019 Nơi cơng tác Tập đồn Kangaroo Cơng việc đảm nhiệm Nhân viên R&D Tp, HCM, ngày ,,,,,,,,, tháng ,,,,,,,,,, Năm 2023 Người khai (Ký tên) 83