Nghiên cứu thủy phân triglyceride trong dầu dừa để thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có hoạt tính sinh học p2

Microsoft Word LA 07 06 docx 23 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Vật liệu nghiên cứu 2 1 1 Dầu dừa Dầu dừa VCO được sản xuất và tài trợ bởi công ty TNHH chế biến dừa Lương Quới (tỉnh Bến Tre, Việt Nam) 2 1 2 Chế phẩm enzyme lipase 2 1 2 1 Lypozyme TL 100L Lypozyme TL 100L, được cung cấp bởi hãng Novozymes (Đan Mạch), đại diện bởi công ty Brenntag (Việt Nam) Lypozyme TL 100L là chế phẩm enzyme công nghiệp, dạng lỏng, màu vàng nâu, được trích ly từ nấm Thermomyces lanuginosus, đặc h.

CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Dầu dừa Dầu dừa VCO sản xuất tài trợ công ty TNHH chế biến dừa Lương Quới (tỉnh Bến Tre, Việt Nam) 2.1.2 Chế phẩm enzyme lipase 2.1.2.1 Lypozyme TL 100L Lypozyme TL 100L, cung cấp hãng Novozymes (Đan Mạch), đại diện công ty Brenntag (Việt Nam) Lypozyme TL 100L chế phẩm enzyme công nghiệp, dạng lỏng, màu vàng nâu, trích ly từ nấm Thermomyces lanuginosus, đặc hiệu vị trí xúc tác sn – 1,3 mạch triglyceride Theo khuyến cáo nhà sản xuất, Lypozyme TL 100L hoạt động tối ưu khoảng pH 7,0 – 10 nhiệt độ 20 – 50oC Hoạt tính Lypozyme TL 100L 100 KLU/g enzyme, 1LU lượng chế phẩm cần thiết để thủy phân glycerol tributyrate tạo thành µmol acid butyric với tốc độ µmol acid butyric/phút điều kiện tiêu chuẩn [43] 2.1.2.2 Lypozyme TL IM Lypozyme TL IM, cung cấp hãng Novozymes (Đan Mạch), đại diện công ty Brenntag (Việt Nam) Lypozyme TL IM chế phẩm enzyme cố định, dạng bột, màu trắng, trích ly từ nấm Thermomyces lanuginosus, đặc hiệu vị trí xúc tác sn – 1,3 mạch triglyceride Theo khuyến cáo nhà sản xuất, Lypozyme TL IM hoạt động tối ưu khoảng pH – nhiệt độ 50 – 75oC Hoạt tính Lypozyme TL IM 250 IUN/g enzyme, IUN lượng chế phẩm cần thiết để thủy phân glycerol tributyrate tạo thành µmol acid butyric với tốc độ µmol acid butyric/phút điều kiện tiêu chuẩn [43] 2.1.2.3 Candida rugosa lipase (CRL) Candida rugosa lipase (CRL), ký hiệu L1754, Type VII, cung cấp hãng Sigma – Aldrich (Mỹ) CRL chế phẩm enzyme tự do, màu trắng, dạng bột, có nguồn 23 gốc từ nấm Candida rugosa, không đặc hiệu vị trí xúc tác mạch triglyceride Hoạt tính CRL ≥ 700 U/mg enzyme, 1U lượng chế phẩm cần thiết để thủy phân triglyceride tạo thành acid béo tự với tốc độ 1µmol acid béo/giờ pH 7,2 37oC [44] 2.1.2.4 Porcine pancreas lipase (PPL) Porcine pancreas lipase (PPL), ký hiệu L3126, Type II, cung cấp hãng Sigma – Aldrich (Mỹ) PPL chế phẩm enzyme tự do, màu trắng, dạng bột, có nguồn gốc từ tuyến tụy lợn, đặc hiệu vị trí xúc tác sn – 1,3 mạch triglyceride Hoạt tính PPL 100-500 U/mg protein, hàm lượng protein chiếm ≥ 20%, 1U lượng chế phẩm cần thiết để thủy phân triacetin tạo thành acid béo tự với tốc độ 1µmol acid béo/giờ pH 7,4 37oC [44] 2.1.3 Chủng vi khuẩn môi trường nuôi cấy 2.1.3.1 Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn dùng để thử nghiệm khả kháng khuẩn tổ hợp acid béo tự Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) Salmonella enteritidis (ATCC 13076) Tất cung cấp Microbiologics, Inc (St Cloud, Minnesota, USA) 2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy Môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth (NB) (Biolife – Italy), Mueller Hinton Agar (MHA) (HiMedia Laboratories Pvt Ltd – Ấn Độ) Mueller Hinton Borth (MHB) (HiMedia Laboratories Pvt Ltd – Ấn Độ) 2.1.3.3 Đối chứng dương Đĩa giấy tẩm kháng sinh Gentamicine 10µg dùng làm đối chứng dương đĩa giấy trắng với đường kính tiêu chuẩn 6mm, dùng để tẩm chất thử Tất sản xuất cung cấp Công ty TNHH Nam Khoa, TpHCM 24 2.1.4 Chuột thí nghiệm 2.1.4.1 Chuột Chuột đực giống Wistar tuần tuổi, trọng lượng trung bình khoảng 30 gam/con, cung cấp viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh 2.1.4.2 Thức ăn sở Thức ăn sở cho chuột hiệu Hamster food, sản xuất công ty Jolly (Đài Loan) chứa thành phần: ngũ cốc (40%), đậu Hà Lan (15%), chất dẫn xuất từ thịt động vật (4%), trái (táo 4%), dầu cá hồi (1%), hạt lanh (2%), fructooligosaccharides (0,3%) Ngồi ra, cịn có dẫn xuất có nguồn gốc từ thực vật, khoáng chất, nấm men, trứng dẫn xuất từ trứng Trong đó, hàm lượng protein tổng chiếm 16%, chất xơ 7,5%, béo 9,0%, khoáng 4% độ ẩm 12% 2.1.4.3 Thức ăn giàu béo – high fat diet (HFD) Thức ăn với hàm lượng béo cao (HFD) thực phịng thí nghiệm trường Đại Học Công Nghiệp TpHCM theo phương pháp Subramani (2017) bao gồm: 90% thức ăn sở kết hợp với 2% cholesterol từ Merck Millipore (USA) có độ tinh khiết ≥ 99%, thêm 8% dầu đậu phộng từ công ty Quy Nguyên 0,1% Calcium (Novartis Pharma Limited Petaro Road, Jamshoro, Pakistan) [45] Các thành phần nghiền mịn, phối trộn đồng nhất, tạo hình sấy đến độ ẩm 12% 2.1.4.4 Đối chứng dương Silymarin 70mg sử dụng để làm đối chứng dương Silymarin sản xuất công ty cổ phần dược phẩm Đồng Nai Silymarin chiết xuất thảo dược trích ly từ Cúc Gai (Silybum marianum) có tác dụng bảo vệ gan hỗ trợ chức gan điều trị viêm gan Hoạt chất có tác dụng bảo vệ gan xác định silymarin Silymarin hợp chất thuộc loại flavonoid chiết từ hạt từ Theo tài liệu dược lý silymarin tác giả Fraschini cộng (2002), silymarin giúp bảo vệ gan hỗ trợ chức gan điều trị bệnh viêm gan có tác dụng chứng minh sau [46] 1) Silymarin chất chống oxy hóa vơ hiệu hóa gốc tự gây hại Silymarin có 25 chất flavonoid nên vơ hiệu hóa gốc tự (như lipoperoxid) chất sinh nhiều gan bị viêm bị tổn thương 2) Silymarin giúp ổn định màng tế bào gan ngăn chặn chất độc từ nhiễm vào tế bào gan 3) Silymarin tăng cường tổng hợp RNA ribosom (ribosomal RNA synthesis), giúp tổng hợp protein nhằm thúc đẩy phục hồi tế bào gan bị tổn thương kích thích phát triển tế bào gan 4) Silymarin ức chế biến đổi gan thành tổ chức xơ, giảm hình thành sợi collagen đưa đến xơ gan 2.1.5 Hóa chất Hóa chất sử dụng nghiên cứu có xuất xứ từ Merck (Đức) Sigma chemical (Hoa Kỳ), độ tinh khiết ≥ 99,7% gồm Acid clohydric (HCl), Acid boric (H3BO3), Disodium tetraborat decahydrate (Na2B4O7.10H2O), Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4.2H2O), Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O), Ethanol absolute (C2H5OH), Isooctane (C8H18), Sodium phosphate anhydrous (Na2SO4), Phenolphthalein (C20H14O4) n-hexane cung cấp cơng ty hóa chất Hóa Nam (Việt Nam) 2.1.6 Thiết bị 2.1.6.1 Thiết bị nghiên cứu trình thủy phân dầu VCO Hỗn hợp dầu đệm với tỉ lệ khảo sát khuấy tạo nhũ máy đồng hóa IKA (Đức) Q trình thủy phân dầu thực thiết bị lắc Yihder (Đài Loan), có điều chỉnh nhiệt độ tốc độ lắc 2.1.6.2 Thiết bị nghiên cứu trình thu nhận tổ hợp acid béo tự Hỗn hợp acid béo thu nhận sau loại bỏ dung môi n – hexan máy cô quay RE 300RC (Đức) Các phân đoạn acid béo thu nhận phương pháp chưng cất chân khơng có điều chỉnh nhiệt độ áp suất phù hợp với phân đoạn cần thu nhận, chưng cất phân đoạn Fischer (Mỹ) nối với bơm chân không Trivac (Mỹ) 26 2.1.6.3 Thiết bị nghiên cứu hoạt tính sinh học tổ hợp acid béo tự a) Thiết bị sử dụng nghiên cứu khả kháng khuẩn Môi trường nuôi cấy vi sinh vật vô trùng nồi hấp tiệt trùng BK75 (Nga) Vi khuẩn thử nghiệm cấy tủ cấy vi sinh vật MV12 (Việt Nam) ủ tủ ấm INB 500 (Đức) Mật độ vi sinh vật đo máy đo quang phổ Genesys 20 (Mỹ) b) Thiết bị nghiên cứu ảnh hưởng đến hàm lượng cholesterol máu Mẫu máu thu nhận cho vào ống chứa heparin, sau huyết tương thu nhận máy ly tâm Hettich EBA 20S (Đức), số ALT AST phân tích thiết bị Beckman Synchron LX20 (Mỹ) Các số triglyceride, cholesterol tổng, LDL cholesterol HDL cholesterol phân tích thiết bị Hitachi 704 (Mỹ) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu dầu VCO loại enzyme lipase - Xác định A, X, I, P - Xác định thành phần acid béo - Xác định hoạt tính Nghiên cứu thủy phân VCO - Khảo sát tỉ lệ dầu/đệm - Khảo sát tỉ lệ enzyme/cơ chất - Kháo sát nhiệt độ - Khảo sát pH - Khảo sát thời gian thủy phân - Khảo sát động học enzyme Nghiên cứu thu nhận sản phẩm sau thủy phân Nghiên cứu thu nhận phân đoạn acid béo Khảo sát giảm Cholesterol trọng lượng chuột Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 27 Nội dung nghiên cứu luận án chia làm phần: Phần Nghiên cứu trình thủy phân dầu VCO bốn loại enzyme lipase khác Phần Nghiên cứu thu nhận sản phẩm sau thủy phân gồm phân đoạn acid béo tự mạch trung bình, acid lauric acid béo mạch dài Phần Khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo đến khả kháng loại vi khuẩn thường gây bệnh thực phẩm Đồng thời, khảo sát tác động chúng đến hàm lượng cholesterol máu 2.2.1 Khảo sát trình thủy phân dầu VCO bốn loại enzyme lipase khác Mục đích phần nghiên cứu tìm điều kiện thủy phân phù hợp loại enzyme lipase xúc tác trình thủy phân dầu VCO, từ xác định qui luật xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO loại enzyme lipase 2.2.1.1 Khảo sát nguyên liệu dầu VCO hoạt tính enzyme lipase Xác định số ban đầu dầu nguyên liệu số acid béo theo TCVN 6127: 2010, số peroxide theo TCVN 6121: 2010, số xà phòng theo TCVN 6126: 2007 số iod theo TCVN 6122: 2010 Đồng thời, xác định thành phần hàm lượng acid béo dầu theo phương pháp sắc ký khí với đầu dị ion hóa lửa (GC – FID) Hoạt tính loại enzyme lipase xác định theo phương pháp nhà sản xuất chuyển đơn vị đo (U/g) 2.2.1.2 Khảo sát yếu tố tác động lên trình thủy phân dầu VCO bốn loại enzyme lipase Xác định qui luật ảnh hưởng tỷ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, nhiệt độ pH đến mức độ thủy phân dầu VCO loại enzyme lipase 2.2.1.3 Động học enzyme lipase Xác định số Michaelis Menten Km vận tốc phản ứng cực đại Vmax đặc trưng cho enzyme, từ nhận định lực liên kết loại enzyme với chất dầu VCO Xác định qui luật xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO loại enzyme lipase 28 2.2.1.4 Khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO xúc tác loại enzyme lipase theo thời gian Với điều kiện thủy phân phù hợp enzyme xác định trên, tìm qui luật ảnh hưởng thời gian đến mức độ thủy phân dầu VCO loại enzyme lipase 2.2.2 Thu nhận phân đoạn acid béo tự Mục đích phần nghiên cứu thu nhận phân đoạn acid béo tự có chiều dài mạch cacbon mong muốn 2.2.2.1 Thu nhận sản phẩm sau thủy phân Sản phẩn sau thủy phân acid béo tự (FFA) dầu VCO lại sau thủy phân (HVCO) Xác định thành phần hàm lượng FFA phương pháp sắc ký khí ion hóa lửa (GC – FID) Trên sở này, lựa chọn loại enzyme lipase phù hợp với hàm mục tiêu để xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO nhằm thu nhận FFA phục vụ nghiên cứu 2.2.2.2 Thu nhận phân đoạn acid béo tự Chưng cất phân đoạn, giữ cố định áp suất 7,5mmHg, thay đổi nhiệt độ để thu nhận phân đoạn acid béo có chiều dài mạch cacbon mong muốn Trong đó, tổ hợp acid béo FFA1 chứa chủ yếu acid béo tự mạch trung bình (C6 – C10), FFA2 chứa chủ yếu acid lauric (C12) FFA3 chứa chủ yếu acid béo tự mạch dài (C14 – C18) Đánh giá tỷ lệ khối lượng phân đoạn 2.2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo tự Mục đích phần nghiên cứu xác định hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 FFA3 Xác định qui luật kháng khuẩn qui luật tác động đến hàm lượng cholesterol máu phân đoạn acid béo tự từ dầu VCO 2.2.3.1 Khả kháng khuẩn FFA, HVCO VCO Khảo sát khả kháng bốn loại vi khuẩn gây bệnh thực phẩm acid béo tự (FFA), HVCO lại sau thủy phân gồm hỗn hợp di- , mono-glyceride dầu VCO nguyên trạng 2.2.3.2 Khả kháng khuẩn phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 FFA3 Xác định qui luật kháng bốn loại vi khuẩn gây bệnh thực phẩm phân đoạn acid béo tự do, có chiều dài mạch cacbon khác 29 2.2.3.3 Tác động phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 FFA3 đến hàm lượng cholesterol máu Đánh giá tác động đến hàm lượng cholesterol máu chuột cho ăn chế độ ăn giàu béo (HFD) phân đoạn acid béo tự 2.3 Bố trí thí nghiệm 2.3.1 Thí nghiệm khảo sát q trình thủy phân dầu VCO 2.3.1.1 Thí nghiệm khảo sát nguyên liệu dầu VCO hoạt tính enzyme lipase a) Xác định số ban đầu dầu VCO Bảng 2.1 Phương pháp xác định số dầu VCO Chỉ tiêu xác định Tiêu chuẩn áp dụng TCVN 6127 : 2010 Chỉ số acid (ISO 660 : 2009) TCVN 6121 : 2010 Chỉ số peroxide (ISO 3960 : 2007) TCVN 6126 : 2007 Chỉ số xà phòng (ISO 3657 : 2002) TCVN 6122 : 2010 Chỉ số Iod (ISO 3961 : 2009) AOAC 996.06 Thành phần acid béo (GC – FID) b) Xác định hoạt tính bốn loại enzyme lipase Hoạt tính bốn loại enzyme lipase khảo sát luận án xác định theo hướng dẫn nhà sản xuất trình bày phụ lục 1.1 Bốn loại enzyme có đơn vị đo hoạt tính khác Do đó, chúng chuyển đổi đơn vị U/g, số đơn vị hoạt độ U có 1g chế phẩm enzyme, với 1U lượng chế phẩm cần thiết để xúc tác thủy phân liên kết carbocyl-ester tạo thành acid béo tự với tốc độ 1µmol acid béo/phút điều kiện tiêu chuẩn 30 2.3.1.2 Thí nghiệm khảo sát q trình thủy phân dầu VCO Dầu VCO thủy phân loại enzyme lipase nhằm thu nhận acid béo tự (FFA) Điều kiện xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO enzyme khác Bốn yếu tố ảnh hưởng đến mức độ thủy phân dầu VCO tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, pH nhiệt độ enzyme khảo sát Quá trình thủy phân thực theo phương pháp tác giả Sharma cộng (2013) Hỗn hợp ban đầu bao gồm 100g dầu VCO đệm (w/w) cho vào becher 1000mL, với tỉ lệ khảo sát Hỗn hợp tạo nhũ thiết bị khuấy tốc độ 10000 vòng/phút vịng 15 phút Sau lượng enzyme với tỉ lệ khác thêm vào hỗn hợp, enzyme hòa tan thiết bị khuấy tốc độ 350 vòng/phút vòng phút pH dung dịch mức pH khảo sát điều chỉnh dung dịch đệm Hỗn hợp tiến hành thủy phân thiết bị có tốc độ lắc 150 vịng/phút điều chỉnh nhiệt độ mức khảo sát [36] Sau phản ứng, dừng trình thủy phân cách bất hoạt enzyme 1mL ethanol 99,5% Mức độ thủy phân dầu VCO tính theo cơng thức Zenevicz (2016) [41] 𝐷𝐻   = 𝑉!"#  ×  𝑀!"# ×𝑀!" x  100                            (2.1) 1000×  𝑚 Trong đó: DH: Mức độ thủy phân dầu VCO (%) 𝑉!"# : Thể tích KOH cần dùng để chuẩn độ (mL) 𝑚: Khối lượng dầu phản ứng (g) 𝑀!"# :  Nồng độ mol dung dịch KOH (mol/L) 𝑀!" : Khối lượng phân tử trung bình acid béo có dầu VCO, 𝑀!" tính sau: 𝑀!" = ! ! M! ! !  x !"" Trong đó, xi tỷ lệ phần trăm theo khối lượng acid thành phần thứ i Mi khối lượng phân tử thành phần acid béo thứ i (phụ lục 2) n số acid béo có mặt dầu VCO 31 a) Thủy phân dầu VCO enzyme Lypozyme TL 100L Dung dịch đệm Tris – HCl sử dụng để giữ ổn định độ pH dung dịch thủy phân, thay đổi yếu tố cố định yếu tố lại để khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến mức độ thủy phân dầu VCO Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, pH nhiệt độ đến mức độ thủy phân dầu VCO xúc tác enzyme Lypozyme TL 100L TN1 1.1 1.2 Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định • pH dung dịch thủy phân: 7,0 Tỉ lệ dầu/ đệm (w/w) • Nhiệt độ thủy phân: 50oC 1/1 – 1/2 – 1/3 – 1/4 – 1/5 • Tỉ lệ enzyme/cơ chất: 387 U/gVCO • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN1.1 Tỉ lệ enzyme/cơ chất (U/gVCO) 344 – 387 – 430 – 473 – 516 • Nhiệt độ thủy phân: 50oC • pH dung dịch thủy phân: 7,0 • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN1.1 13 pH thủy phân • 6,0 – 7,0 – 8,0 – 9,0 – 10,0 Tỉ lệ enzyme/cơ chất: chọn từ kết TN1.2 • Nhiệt độ thủy phân: 50oC • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN1.1 1.4 • Nhiệt độ thủy phân (oC) Tỉ lệ enzyme/cơ chất: chọn từ kết TN1.2 35 – 40 – 45 – 50 – 55 • pH thủy phân: chọn từ kết TN1.3 • 32 Thời gian thủy phân: 120 phút b) Thủy phân dầu VCO enzyme Lypozyme TL IM Dung dịch đệm Tris – HCl sử dụng để giữ ổn định độ pH dung dịch thủy phân, thay đổi yếu tố cố định yếu tố lại để khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến mức độ thủy phân dầu VCO Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, pH nhiệt độ đến mức độ thủy phân dầu VCO xúc tác enzyme Lypozyme TL IM TN2 2.1 2.2 2.3 2.4 Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định • pH dung dịch thủy phân: 8,0 Tỉ lệ dầu/ đệm (w/w) • Nhiệt độ thủy phân: 60oC 1/1 – 1/2 – 1/3 – 1/4 – 1/5 • Tỉ lệ enzyme/cơ chất: 1,1 U/gVCO • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN2.1 Tỉ lệ enzyme/cơ chất (U/gVCO) • Nhiệt độ thủy phân: 60oC – 1,1 – 1,2 – 1,3 – 1,4 • pH dung dịch thủy phân: 8,0 • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN2.1 • Tỉ lệ enzyme/cơ chất: chọn từ kết pH thủy phân TN2.2 6,0 – 7,0 – 8,0 – 9,0 Nhiệt độ thủy phân (oC) • Nhiệt độ thủy phân: 60oC • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN2.1 • Tỉ lệ enzyme/cơ chất: chọn từ kết TN2.2 50 – 55 – 60 – 65 – 70 – 75 • pH thủy phân: chọn từ kết TN2.3 • Thời gian thủy phân: 120 phút c) Thủy phân dầu VCO enzyme CRL Dung dịch đệm phosphate sử dụng để giữ ổn định độ pH dung dịch thủy phân, thay đổi yếu tố cố định yếu tố lại để khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến mức độ thủy phân dầu VCO 33 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, pH nhiệt độ đến mức độ thủy phân dầu VCO xúc tác enzyme CRL TN3 3.1 3.2 3.3 3.4 Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định • pH dung dịch thủy phân: 7,0 Tỉ lệ dầu/ đệm (w/w) • Nhiệt độ thủy phân: 40oC 1/1 – 1/2 – 1/3 – 1/4 – 1/5 – 1/6 • Tỉ lệ enzyme/cơ chất: 3540 U/gVCO • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN3.1 Tỉ lệ enzyme/cơ chất (U/gVCO) • Nhiệt độ thủy phân: 40oC 1770 – 3540 – 5310 – 7080 – 8850 • pH dung dịch thủy phân: 7,0 • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN3.1 • Tỉ lệ enzyme/cơ chất: chọn từ kết pH thủy phân TN3.2 6,0 – 6,5 – 7,0 – 7,5 – 8,0 Nhiệt độ thủy phân (oC) • Nhiệt độ thủy phân: 40oC • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN3.1 • Tỉ lệ enzyme/cơ chất: chọn từ kết TN3.2 30 – 35 – 40 – 45 – 50 • pH thủy phân: chọn từ kết TN3.3 • Thời gian thủy phân: 120 phút d) Thủy phân dầu VCO enzyme PPL Dung dịch đệm borat sử dụng để giữ ổn định độ pH dung dịch thủy phân, thay đổi yếu tố cố định yếu tố lại để khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến mức độ thủy phân dầu VCO 34 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, pH nhiệt độ đến mức độ thủy phân dầu VCO xúc tác enzyme PPL TN4 4.1 4.2 4.3 4.4 Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định • pH dung dịch thủy phân: 8,0 Tỉ lệ dầu/ đệm (w/w) • Nhiệt độ thủy phân: 40oC 1/1 – 1/2 – 1/3 – 1/4 – 1/5 – 1/6 • Tỉ lệ enzyme/cơ chất: 681 U/gVCO • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN4.1 Tỉ lệ enzyme/cơ chất (U/gVCO) • Nhiệt độ thủy phân: 40oC 227 – 454 – 681 – 908 – 1135 • pH dung dịch thủy phân: 8,0 • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN4.1 • Tỉ lệ enzyme/cơ chất: chọn từ kết pH thủy phân TN4.2 7,0 – 7,5 – 8,0 – 8,5 – 9,0 Nhiệt độ thủy phân (oC) • Nhiệt độ thủy phân: 40oC • Thời gian thủy phân: 120 phút • Tỉ lệ dầu/đệm: chọn từ kết TN4.1 • Tỉ lệ enzyme/cơ chất: chọn từ kết TN4.2 30 – 35 – 40 – 45 – 50 • pH thủy phân: chọn từ kết TN4.3 • Thời gian thủy phân: 120 phút 2.3.1.3 Thí nghiệm khảo sát động học enzyme lipase Sau xác định điều kiện thủy phân phù hợp loại enzyme ứng với chất dầu VCO phần 2.3.1.2, mức độ thủy phân xác định định kỳ phút/ lần 10 phút đầu phản ứng với khối lượng dầu ban đầu thay đổi sau: 100g, 50g, 12,5g 3g Giai đoạn bắt đầu phản ứng, lượng chất dần đồng thời với sản phẩm tạo thành gây thay đổi đột ngột với thời gian, nhiên, thời gian tăng dần tỉ lệ giảm đi, đạt tới khơng tất lượng chất chuyển thành sản phẩm tác dụng enzyme lipase Khoảng thời gian mơ hình hóa thơng qua phương trình động học bậc sau: 35 𝑆 =   [𝑆! ]𝑒 !!"                      (2.2) Trong đó: [S]: Nồng độ chất lại thời điểm t (mmol FFA liên kết/mL) [𝑆! ]:  Nồng  độ  cơ  chất  ban  đầu (mmol FFA liên kết/mL) k: Hằng số tỷ lệ giả bậc phản ứng Vận tốc phản ứng (2.2) xác định sau: 𝑣=− 𝑑𝑆 𝑑𝑃 =   =   −𝑘 𝑆!   𝑒 !!"                          (2.3) 𝑑𝑡 𝑑𝑡 Cơ sở lựa chọn mơ hình để nghiên cứu động học loại enzyme lipase xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO dựa loại enzyme đơn chất xúc tác trình phản ứng Theo mơ hình đưa Michaelis-Menten, vận tốc phản ứng thủy phân phụ thuộc vào lực liên kết enzyme với chất         V= !!"# ∗  [!] (2.4) !! !  [!] Trong đó: V: Vận tốc phản ứng (mmol FFA tự giải phóng/mL∗h) Vmax: Vận tốc phản ứng cực đại (mmol FFA tự giải phóng/mL∗h) Km: Hằng số Michaelis –Menten (mmol FFA tự giải phóng/mL) [S]: Nồng độ chất (mmol FFA liên kết/mL) Các thông số động học phản ứng thủy phân (Km Vmax) xác định cách viết lại công thức (2.4) dạng nghịch đảo, đưa Lineweaver – Burk ! !!    =  ! ! !"# ! *[!] + ! ! !"# 36 (2.5) 2.3.1.4 Thí nghiệm khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO theo thời gian Điều kiện thủy phân phù hợp loại enzyme lipase xác định phần 2.3.1.2 Trên sở đó, mức độ thủy phân (DH) dầu VCO enzyme lipase theo thời gian khảo sát xác định theo công thức (2.1) 2.3.2 Thí nghiệm thu nhận phân đoạn acid béo tự 2.3.2.1 Thí nghiệm thu nhận sản phẩm thủy phân FFA HVCO Khi trình thủy phân dầu VCO xúc tác loại enzyme lipase đạt mức độ thủy phân cao nhất, kết thúc phản ứng thủy phân Sản phẩm thủy phân gồm acid béo tự (FFA) dầu lại sau thủy phân (HVCO) thu nhận theo sơ đồ hình 2.2 Hỗn hợp sau thủy phân Ethanol 99.5% Vô hoạt enzyme KOH 0.5N vừa đủ Tạo muối FFA N-hexane Muối FFA, HVCO, H2O Muối FFA (phần phễu chiết) HCl 4M Acid hóa đến pH 1÷2 N-hexane dư Tách chiết Na2SO4 khan Thu phần Tách chiết HVCO (phần phễu chiết) Bay dung môi HVCO tinh Nước Bay dung mơi FFA tinh Hình 2.2 Quy trình thu nhận FFA [47] 37 Việc thu nhận FFA HVCO dựa theo phương pháp tác giả Shimada cộng (1998) Quá trình tách hỗn hợp sau thủy phân thực phễu chiết Hỗn hợp sau thủy phân vô hoạt enzyme ethanol 99,5% với tỉ lệ 1/1 (w/v), trung hòa lượng FFA sinh KOH 0,5N, sau cho vào phễu chiết, n-hexane thêm vào để tách phần dầu chưa thủy phân (HVCO) khỏi hỗn hợp Lớp chứa HVCO n-hexane tách khỏi hỗn hợp, sau thu nhận HVCO cách sử dụng thiết bị cô quay 70oC nhằm thu hồi dung môi n-hexane Lớp chứa muối hỗn hợp FFA acid hóa dung dịch HCl 4N dư để chuyển muối acid béo dạng acid béo tự Tiếp tục dùng phễu chiết để thu nhận FFA cách sử dụng dung mơi n-hexane để hịa tan acid béo tự Lúc này, lớp bao gồm FFA nhexane tách khỏi hỗn hợp Na2SO4 khan thêm vào để loại bỏ nước dư Dùng thiết bị cô quay chân không để thu hồi n-hexane thu nhận hỗn hợp FFA tự [47] 2.3.2.2 Thí nghiệm thu nhận phân đoạn acid béo tự FFA1, FFA2 FFA3 a) Thu nhận phân đoạn acid béo tự FFA1, FFA2 FFA3 Hỗn hợp FFA tự chứa hàm lượng acid béo bão hòa đến 94,92%, acid béo bão hòa có chiều dài mạch cacbon từ C6 đến C18 (phụ lục), chưng cất chân không phân đoạn nhằm thu nhận phân đoạn acid béo có chiều dài mạch cacbon mong muốn sau: • Phân đoạn (FFA1): chứa chủ yếu acid béo mạch trung bình, từ C6 đến C10 • Phân đoạn (FFA2): chứa chủ yếu acid lauric • Phân đoạn (FFA3): chứa chủ yếu acid béo mạch dài, từ C14 đến C18 Quá trình chưng cất thực theo phương pháp tác giả Nandi cộng (2005) có hiệu chỉnh 100g FFA chưng cất chưng cất chân không, làm việc áp suất 7,5 mmHg Hỗn hợp FFA ban đầu gia nhiệt đến nhiệt độ 145150oC để thu acid béo phân đoạn (FFA1) Tiếp tục nâng nhiệt độ lên 160165oC để thu phân đoạn chủ yếu acid lauric C12 (FFA2) Phần cịn lại bình cầu hỗn hợp acid béo phân đoạn có độ dài mạch từ C14 đến C18 (FFA3) [42] 38 Tỷ lệ phần trăm khối lượng phân đoạn tính sau: !!" H = !  𝑥  100 !đ Trong đó: H: Tỉ lệ phần trăm theo khối lượng phân đoạn chưng cất (%) 𝑚!" : Khối lượng sản phẩm chưng cất (g) 𝑚!đ : Khối lượng hỗn hợp FFA ban đầu đem chưng cất (g) b) Phân tích thành phần acid béo tự Thành phần hàm lượng acid béo sản phẩm sau thủy phân FFA phân đoạn FFA1, FFA2 FFA3 phân tích trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TpHCM – Case thiết bị phân tích sắc kí khí với đầu dị ion hóa lửa (GC-FID) hiệu Shimadzu 2010 Plus (Nhật Bản), theo phương pháp tác giả Nyam cộng (2009) Đầu tiên FFA chuyển về dạng metyl ester (FAME) Methanolic BF3 trước tiêm mẫu 2µl mẫu đưa vào phận tiêm mẫu sử dụng chế độ tiêm mẫu chia dòng (split mode tỉ lệ 1:25) theo dịng khí mang He với tốc độ dịng 12 psi đưa vào cột sắc kí Cột sắc kí mao quản DB-FFAP có kích thước sau: đường kính 0,25 mm, chiều dài 30m độ dày 0,25 µm Nhiệt độ đầu dị ion hóa lửa FID nhiệt độ tiêm mẫu trì 250oC suốt q trình phân tích Chương trình nhiệt 100oC sau tăng lên 7oC/ phút đạt 250oC trì nhiệt độ q trình phân tích kết thúc Những peak thu nhận tính tốn so sánh với chất chuẩn [48] 2.3.3 Thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo tự 2.3.3.1 Thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn Khả kháng khuẩn VCO sản phẩm sau thủy phân gồm có acid béo tự (FFA) mạch triglyceride chưa thủy phân hoàn toàn (HVCO) thực theo TCVN 4884:2001 (2001) [49] Các phân đoạn acid béo tự FFA1, FFA2 FFA3 khảo sát khả kháng khuẩn theo tiêu chuẩn CLSI (2012) [50] 39 Chuẩn bị dịch khuẩn Cấy ria tạo khuẩn lạc môi trường thạch Nutrient Broth (có bổ sung agar), vi khuẩn tồn trữ ống thạch nghiêng bảo quản lạnh 4oC Từ ống tồn trữ, chọn 2-3 khuẩn lạc đưa vào erlen chứa mơi trường Nutrient Broth để thực q trình tăng sinh thiết bị tủ ấm lắc 37oC với tốc độ 100 rpm 18- 24 [50] Mật độ vi khuẩn sau tăng sinh pha loãng nước muối sinh lý 0,9% chuyển độ đục chuẩn McFarland (108 CFU/mL) [50] Sau đó, huyền dịch tiếp tục pha loãng để đạt mật độ vi khuẩn 106 CFU/mL [49] Tiến hành thử kháng khuẩn Dùng micropipet hút ml huyền dịch vi khuẩn loại (mật độ tế bào 106 CFU/ml) cho vào đĩa petri với mơi trường MHA sau chờ khơ bề mặt [49] Hoặc dùng que trải dịch khuẩn với độ đục 1,5x108 CFU/ml bề mặt đĩa thạch chứa môi trường MHA, đợi 3-5 phút bề mặt thạch khơ hồn tồn [50] Dùng đĩa giấy mm vô trùng chứa 0,023g dịch kháng khuẩn đặt lên mặt thạch khô, đè nhẹ để đĩa giấy cố định mặt thạch Ổn định đĩa thạch nhiệt độ phịng vịng 30 phút sau đưa vào tủ ấm 37oC, sau 18-24 ghi nhận kết cách đo đường kính khu vực suốt xung quanh đĩa giấy [50] 2.3.3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính phân đoạn acid béo ảnh hưởng đến hàm lượng cholesterol trọng lượng chuột Thí nghiệm thực phịng thí nghiệm Sinh Học Động Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm, trường Đại Học Công Nghiệp TpHCM 40 chuột đực, giống Wistar chia thành nhóm (mỗi nhóm con) ổn định tuần trước đưa vào thí nghiệm Chuột cảm ứng béo phì theo phương pháp Subramani (2017) cách cho ăn chế độ giàu béo với thức ăn bán tổng hợp theo cơng thức trình bày mục 2.1.4.3 Các lơ thí nghiệm chia theo bảng 2.6, chuột cho ăn chế độ giàu béo (HFD) uống chất thử khác với hàm lượng 3,7mL/kg/ngày theo phương pháp tác giả Harini cộng (2009) [11] Riêng nhóm 6, lơ ăn HFD kết hợp uống Silymarin với hàm lượng 60mg/kg/ngàytheo 40 phương pháp tác giả Guo cộng (2016) [51] Sau 28 ngày cảm ứng bệnh điều trị, mẫu máu nhóm thu nhận để phân tích hàm lượng cholesterol tổng, LDL cholesterol, HDL cholesterol, triglyceride, ALT, AST nhuộm HE mơ gan [11] Các mẫu phân tích đọc kết Bệnh viện 175, TpHCM Bảng 2.6 Phân nhóm chuột chế độ ăn nhóm (đợt 1) Nhóm Chế độ ăn Chất thử HFD FFA tổng HFD FFA HFD FFA HFD FFA HFD VCO HFD Silymarin HFD Không Thức ăn sở (đối chứng) Không Bảng 2.7 Phân nhóm chuột chế độ ăn nhóm (đợt 2) Nhóm Chế độ ăn Chất thử Thức ăn sở FFA1 HFD FFA HFD Không Thức ăn sở (đối chứng) Không i) Cân trọng lượng thể, trọng lượng gan trọng lượng gan tương đối Theo phương pháp Buu cộng (2018), vào ngày bắt đầu (ngày 1) ngày kết thúc thí nghiệm (ngày 28), tất động vật thí nghiệm nhịn ăn qua đêm để giảm khác biệt trọng lượng thức ăn gây nên Trọng lượng thể cân trực tiếp cân điện tử Khi kết thúc thí nghiệm, chúng gây mê cách sử dụng diethyl eter Mẫu máu thu thập cho vào ống có chứa heparin để chống 41 đơng, nhằm phân tích tiêu sinh hóa Sau đó, mẫu gan thu gom, rửa dung dịch nước muối lạnh (nhiệt độ ≤ 4oC) cân cân điện tử Trọng lượng gan tương đối tính theo cơng thức (trọng lượng gan tương đối (g/100g) = trọng lượng gan / trọng lượng thể x 100) Sau đó, gan bảo quản dung dịch formalin 10% để tiến hành đánh giá mô học phương pháp nhuộm Hematoxylin Eosin [52] ii) Xác định số sinh hóa máu men gan Mẫu máu thu nhận cho vào ống heparin, sau huyết tương thu nhận máy ly tâm [52] Các số sinh hóa máu phân tích bệnh viện 175 TpHCM bao gồm triglycerides (TG), cholesterol toàn phần (TC), cholesterol lipoprotein mật độ cao (HDL-cholesterol), cholesterol lipoprotein mật độ thấp (LDLcholesterol), số men gan ALT AST a) Nguyên tắc xác định Cholesterol tổng Cholesterol đo enzyme huyết huyết tương phản ứng kết hợp thủy phân ester cholesteryl oxy hóa nhóm 3-OH cholesterol Một sản phẩm phụ phản ứng H2O2 định lượng phản ứng oxi hóa peroxide enzyme peroxidase tạo sản phẩm màu Độ hấp thụ đo bước sóng 500 nm Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ cholesterol, phản ứng xảy sau [53] Cholesteryl esterhydrolase Ester Cholesteryl + H2O -> cholesterol + acid béo tự Cholesterol oxidase Cholesterol + O2 > cholest-4-en-3-one + H2O2 Peroxidase 2H2O2+4-aminophenazone + phenol -> 4-(p-benzoquinone- monoimino)-phenazone + H2O b) Nguyên tắc xác định Triglyceride Triglyceride huyết huyết tương đo phương pháp enzyme cách sử dụng loạt phản ứng, triglyceride thủy phân giải phóng glycerol Glycerol sau oxy hóa enzyme glycerol oxidase H2O2 số sản phẩm phụ phản ứng H2O2 định lượng phản ứng oxi 42 hóa peroxide enzyme peroxidase tạo sản phẩm màu Độ hấp thụ đo bước sóng 500 nm Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ triglyceride, phản ứng xảy sau [53] lipase Triglyceride + 3H2O > glycerol + acid béo tự glycerokinase Glycerol + ATP > glycerol-3-phosphate + ADP glycerophosphate oxidase Glycerol-3-phosphate + O2 -> C3H7O6P+ H2O2 peroxidase H2O2 + 4C13H17N3O + 4ClC6H4OH -> 4-(p-benzoquinone-monoimino)- phenazone + 2H2O + HCl c) Nguyên tắc xác định HDL – Cholesterol HDL đo trực tiếp huyết dựa nguyên tắc: ApoB chứa lipoprotein mẫu thử phản ứng với thuốc thử chặn khiến chúng không phản ứng với thuốc thử cholesterol điều kiện xét nghiệm Do đó, ApoB chứa lipoprotein loại trừ khỏi xét nghiệm HDL-cholesterol phát điều kiện khảo nghiệm, phản ứng xảy sau [53] (1) ApoB + α-cyclodextrin + Mg+2 + dextran SO4 >Phức hợp không phản ứng với lipoprotein chứa ApoB PEG-cholesteryl esterase (2) Ester HDL-cholesteryl > HDL-cholesterol không ester hóa + acid béo tự cholesterol oxidase (3) Cholesterol khơng ester hóa + O2 PEG ->C27H44O + H2O2 peroxidase + (4) H2O2 + 5C13H17N3O + N-CH2-CH2-N-(3-C6H5CH2)-N_ NH2CH2CH2NH2+ H2O + H -> thuốc nhuộm qunoneimine + H2O d) Nguyên tắc xác định LDL – Cholesterol Chỉ tiêu LDL – Cholesterol xác định dựa phương pháp kết tủa truyền thống acid polyvinyl sulfonic (PVS) polyethylene-glycol ether (PEGME) điều chỉnh để tăng cường tỉ lệ tối ưu PVS/ PEGME với chất hoạt động bề mặt có chọn lọc LDL, VLDL chylomicron (CM) phản ứng với PVS PEGME Kết 43 phản ứng enzyme cholesterol oxidase (CHOD) cholesterol esterase (CHER) tiếp cận với LDL, VLDL CM, HDL phản ứng với enzyme Bổ sung R2 chứa chất hoạt động bề mặt đặc hiệu giải phóng LDL từ phức hợp PVS/ PEGME LDL giải phóng phản ứng với enzyme tạo H2O2 H2O2 định lượng phản ứng Trinder [54] e) Nguyên tắc xác định hoạt độ ALT Sử dụng phương pháp đo tỷ lệ chuyển hóa để xác định hoạt độ ALT huyết huyết tương ALT xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển hóa L-alanine αketoglutarate thành pyruvate L-glutamate Các pyruvate sau khử thành lactate có mặt enzyme chuyển hóa hydro (LDH), đồng thời với q trình NADH bị oxy hóa chuyển thành NAD Độ hấp thụ đo bước sóng 340 nm Độ hấp thụ thay đổi tỷ lệ thuận với hoạt độ ALT mẫu [55] f) Nguyên tắc xác định hoạt độ AST Sử dụng phương pháp enzyme để đo hoạt độ AST huyết huyết tương AST xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển hóa L-aspartate α-ketoglutarate thành oxaloacetate L-glutamate Các oxaloacetate sau khử thành malate nhờ enzyme malate dehydrogenase xúc tác, đồng thời với q trình NADH bị oxy hóa chuyển thành NAD Độ hấp thụ đo bước sóng 340 nm Độ hấp thụ thay đổi tỷ lệ thuận với hoạt độ AST mẫu [56] iii) Phân tích mô học Mẫu gan lưu giữ 10% formalin xử lý để nghiên cứu mô học phương pháp nhuộm Hematoxylin Eosin Mẫu phân tích bệnh viện 175 TpHCM theo phương pháp Buu cộng (2018) Các mẫu gan khử nước alcohol, làm xylol, sau nhúng vào parafin, cắt thành lát mỏng có độ dày từ 4-6 µm nhuộm với Hematoxylin Eosin Các tiêu sau kiểm tra kính hiển vi để đánh giá mức độ tổn thương gan [52] 44 iv) Thu nhận, phân tích cholesterol thành phần acid béo gan chuột Mẫu gan chuột xử lý để phân tích hàm lượng cholesterol theo phương pháp Arika cộng (2001) 200 mg mẫu gan chuột xay nhuyễn cho vào phễu chiết có chứa 30 ml hỗn hợp dung môi chloroform/methanol tỉ lệ 2:1 (v/v), thêm vào ml H2SO4 0,05% để nhận thấy rõ phân lớp pha dung dịch Pha bên hỗn hợp chứa cholesterol lipid Tinh hỗn hợp chứa cholesterol lipid thiết bị li tâm 20 phút với tốc độ 2400 rpm (mỗi 10 ml hỗn hợp pha thêm vào khoảng 2ml H2SO4 0,05% sau cho vào ống falcon đưa vào máy ly tâm thực trình ly tâm) Sau trình ly tâm, dùng pippet để loại bỏ lớp thu nhận lớp có chứa lipid cholesterol gan chuột tinh [57] Hàm lượng lipid cholesterol gan chuột phân tích sắc kí khí với đầu dị ion hóa lửa trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Case theo phương pháp tác giả Nyam cộng (2009) [48] 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Tất thí nghiệm lặp lại lần, phân tích thống kê thực phần mềm R version 3.1.3 (cập nhật ngày 03-09-2015) Dữ liệu trình bày dạng độ lệch chuẩn ± trung bình Riêng thí nghiệm động vật, khác biệt nhóm phân tích cách sử dụng phương pháp phân tích phương sai (Nested ANOVA) trước sử dụng Duncan, giá trị có ý nghĩa thống kê p