Nghiên cứu thủy phân triglyceride trong dầu dừa để thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có hoạt tình sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ ÁI VÂN NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN TRIGLYCERIDE TRONG DẦU DỪA ĐỂ THU NHẬN CÁC PHÂN ĐOẠN ACID BÉO TỰ DO CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ KĨ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ ÁI VÂN NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN TRIGLYCERIDE TRONG DẦU DỪA ĐỂ THU NHẬN CÁC PHÂN ĐOẠN ACID BÉO TỰ DO CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số chuyên ngành: 62540101 Phản biện độc lập 1: Phản biện độc lập 2: Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Phan Ngọc Hịa TS Trần Bích Lam LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tác giả Các kết nghiên cứu kết luận luận án trung thực, không chép từ nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo theo quy định Tác giả luận án Nguyễn Thị Ái Vân i TÓM TẮT LUẬN ÁN Phản ứng thủy phân dầu dừa (VCO) với bốn loại enzyme lipase khác để thu nhận acid béo tự nghiên cứu Các thông số kỹ thuật khảo sát tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/ chất, pH, nhiệt độ động học enzyme Kết khảo sát cho thấy, với bốn loại enzyme lipase có nguồn gốc trích ly tính đặc hiệu khác nhau, thể khả xúc tác phản ứng khác chất dầu dừa VCO Trong đó, enzyme lipase Candida rugosa (CRL) có nguồn gốc từ nấm men Candida rugosa xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO để thu nhận acid béo tự (FFA) phù hợp Hỗn hợp FFA thu nhận sau phản ứng thủy phân tiếp tục trải qua q trình chưng cất chân khơng để thu nhận phân đoạn FFA1, FFA2 FFA3 có hàm lượng acid béo mạch trung bình (C6 – C10), acid lauric (C12) acid béo mạch dài (C14 – C18) 12,6%, 38,4% 49% Hoạt tính sinh học ba phân đoạn acid béo thể qua khả kháng khuẩn tác động đến hàm lượng cholesterol máu chuột giống Wistar với chế độ ăn giàu béo (HFD) Các phân đoạn acid béo tự đánh giá khả kháng số loại vi khuẩn thường gây bệnh thực phẩm Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) Salmonella enteritidis (ATCC 13076) Trong đó, FFA1 thể khả ức chế bốn loại vi khuẩn mạnh nhất, FFA2, cịn lại FFA3 khơng thể khả kháng bốn loại vi khuẩn kể Thử nghiệm chuột giống Wistar với chế độ ăn HFD, kết cho thấy rằng, với chế độ điều trị FFA3 làm tăng trọng lượng, tăng số men gan ALT, AST mà gây viêm gan Trong đó, FFA1 giúp giảm số men gan ALT, AST; giảm hàm lượng cholesterol tổng triglyceride, đồng thời giúp giảm trọng lượng so với chuột ăn chế độ HFD Riêng FFA2 giúp chuột ăn chế độ HFD giảm số men gan ALT, AST; giảm trọng lượng tăng số cholesterol “tốt” HDL Như vậy, acid béo tự mạch trung bình (MCFA) acid lauric thu nhận từ dầu VCO góp phần tăng hiệu việc giảm số sinh hóa máu dẫn đến làm lành tổn thương gan chế độ ăn giàu béo chuột giống Wistar ii ABSTRACT In this study, to obtain free fatty acids (FFAs), virgin coconut oil (VCO) was hydrolyzed by four types of lipase derived from differently original extraction and having catalytic specificity for triglyceride In particular, the lipase extracted from Candida rugosa was most suitable for the hydrolysis of VCO to acquire FFAs After vacuum distillation, the initial FFAs composition was categorized into three groups that have different carbon chain lengths and are enriched in the content of each FFA fraction They include FFA1, FFA2, and FFA3 containing 97,31% of C6 - C12, 76,49% of C12, and 85,86% of C14 – C18, respectively Then, the antibacterial properties of FFAs were tested against four food pathogenic bacteria, including Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) and Salmonella enteritidis (ATCC 13076) In which, two fractions FFA1 and FFA2 exhibited significant resistance The group FFA1 inhibit the growths of all foodborne pathogens, followed by group FFA2 FFA3, however, was not as effective as an antibacterial agent In terms of the effect of groups FFA1, FFA2 and FFA3 on the cholesterol level in mice fed an HFD diet The results showed that group FFA3 not only increased ALT as well as AST level but also caused hepatitis With FFA1 treatment, the levels of ALT, AST, cholesterol and triglyceride were reduced in comparison with HFD-fed mice Particularly, FFA2 showed better results in reducing ALT, AST than other groups and increasing HDL cholesterol levels while remaining the normal status of liver tissue via histologically liver analysis Additionally, medium chain fatty acid (MCFA) and lauric acid (C12) present in VCO content contributed to increasing the efficiency of reducing some blood biochemical values, resulting in the healing of liver damage caused by high-fat diet (HFD) in Wistar mice iii LỜI CÁM ƠN Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến, PGS TS Phan Ngọc Hịa, người kính mến dẫn đường nghiên cứu khoa học xuyên suốt cho luận án TS Trần Bích Lam, giáo tận tụy dành nhiều thời gian tâm huyết để hướng dẫn khoa học cho nghiên cứu GS.TS Lê Văn Việt Mẫn, người thầy đáng kính cho tơi lời khun bổ ích suốt trình học tập – nghiên cứu Tập thể giảng viên môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM chân thành góp ý tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Bên cạnh đó, tập thể nghiên cứu vơ cám ơn quý công ty TNHH Chế Biến Dừa Lương Quới (tỉnh Bến Tre) tài trợ toàn dầu dừa VCO, nguyên liệu để thực nghiên cứu Đồng thời, xin gửi lời cám ơn đến quý công ty Novozymes, đại diện công ty Brenntag Việt Nam tài trợ hai loại enzyme công nghiệp để phục vụ nghiên cứu Có giai đoạn khó khăn, ơng xã người ln bên động viên, tơi vượt qua trở ngại để hồn thành luận án Con xin cám ơn ba mẹ anh chị em hai bên gia đình ln hỗ trợ nguồn cảm hứng cho học tập, nghiên cứu iv MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH x DANH MỤC CÁC BẢNG xii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xiii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Dầu dừa hợp chất có hoạt tính sinh học 1.1.1 Định nghĩa dầu dừa 1.1.2 Phân loại .5 1.1.2.1 Dầu dừa tinh luyện 1.1.2.2 Dầu dừa tinh khiết 1.1.3 Đặc tính dầu dừa VCO 1.1.4 Các chất có hoạt tính sinh học dầu dừa VCO 1.1.5 Triglyceride acid béo no mạch trung bình dầu dừa .9 1.1.6 Sự chuyển hóa MCT thể 10 1.1.6.1 Q trình tiêu hóa, hấp thụ MCT 10 1.1.6.2 Quá trình chuyển hóa Acid lauric 12 1.1.7 Các nghiên cứu liên quan đến hoạt tính sinh học MCFA dầu dừa 14 1.2 Các phương pháp thủy phân dầu VCO 16 1.3 Enzyme lipase 17 1.3.1 Tính chất enzyme lipase 17 1.3.2 Cơ chế xúc tác chế phẩm enzyme lipase 18 1.3.3 Phân loại lipase chế phẩm .19 1.3.3 Các nghiên cứu liên quan đến thủy phân chất béo enzyme lipase 19 1.4 Phương pháp tách phân đoạn 21 1.5 Mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu 21 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.1.1 Dầu dừa 23 v 2.1.2 Chế phẩm enzyme lipase .23 2.1.2.1 Lypozyme TL 100L 23 2.1.2.2 Lypozyme TL IM 23 2.1.2.3 Candida rugosa lipase (CRL) 23 2.1.2.4 Porcine pancreas lipase (PPL) 24 2.1.3 Chủng vi khuẩn môi trường nuôi cấy 24 2.1.3.1 Chủng vi khuẩn 24 2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy 24 2.1.3.3 Đối chứng dương 24 2.1.4 Chuột thí nghiệm .25 2.1.4.1 Chuột 25 2.1.4.2 Thức ăn sở 25 2.1.4.3 Thức ăn giàu béo – high fat diet (HFD) 25 2.1.4.4 Đối chứng dương 25 2.1.5 Hóa chất 26 2.1.6 Thiết bị 26 2.1.6.1 Thiết bị nghiên cứu trình thủy phân dầu VCO 26 2.1.6.2 Thiết bị nghiên cứu trình thu nhận tổ hợp acid béo tự 26 2.1.6.3 Thiết bị nghiên cứu hoạt tính sinh học tổ hợp acid béo tự 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Khảo sát trình thủy phân dầu VCO bốn loại enzyme lipase khác 28 2.2.1.1 Khảo sát nguyên liệu dầu VCO hoạt tính enzyme lipase 28 2.2.1.2 Khảo sát yếu tố tác động lên trình thủy phân dầu VCO bốn loại enzyme lipase 28 2.2.1.3 Động học enzyme lipase 28 2.2.1.4 Khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO xúc tác loại enzyme lipase theo thời gian 29 2.2.2 Thu nhận phân đoạn acid béo tự 29 2.2.2.1 Thu nhận sản phẩm sau thủy phân 29 2.2.2.2 Thu nhận phân đoạn acid béo tự 29 vi 2.2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo tự 29 2.2.3.1 Khả kháng khuẩn FFA, HVCO VCO 29 2.2.3.2 Khả kháng khuẩn phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 FFA3 29 2.2.3.3 Tác động phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 FFA3 đến hàm lượng cholesterol máu 30 2.3 Bố trí thí nghiệm 30 2.3.1 Thí nghiệm khảo sát q trình thủy phân dầu VCO 30 2.3.1.1 Thí nghiệm khảo sát nguyên liệu dầu VCO hoạt tính enzyme lipase 30 2.3.1.2 Thí nghiệm khảo sát trình thủy phân dầu VCO 31 2.3.1.3 Thí nghiệm khảo sát động học enzyme lipase 35 2.3.1.4 Thí nghiệm khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO theo thời gian 37 Thí nghiệm thu nhận phân đoạn acid béo tự .37 2.3.2 37 2.3.2.1 Thí nghiệm thu nhận sản phẩm thủy phân FFA HVCO 37 2.3.2.2 Thí nghiệm thu nhận phân đoạn acid béo tự FFA1, FFA2 FFA3 38 2.3.3 Thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo tự 39 2.3.3.1 Thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn 39 2.3.3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính phân đoạn acid béo ảnh hưởng đến hàm lượng cholesterol trọng lượng chuột 40 i) Cân trọng lượng thể, trọng lượng gan trọng lượng gan tương đối 41 ii) Xác định số sinh hóa máu men gan 42 iii) Phân tích mô học 44 iv) Thu nhận, phân tích cholesterol thành phần acid béo gan chuột 45 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 45 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46 3.1 Kết nghiên cứu trình thủy phân dầu VCO enzyme lipase 46 3.1.1 Tính chất nguyên liệu dầu VCO hoạt tính enzyme lipase 46 3.1.1.1 Các số ban đầu dầu VCO 46 vii 3.1.1.2 Hoạt tính bốn loại enzyme lipase chất dầu VCO 47 3.1.2 Nghiên cứu trình thủy phân dầu VCO loại enzyme lipase 48 3.1.2.1 Ảnh hưởng tỉ lệ VCO/đệm (w/w) đến mức độ thủy phân dầu VCO loại enzyme lipase 48 3.1.2.2 Ảnh hưởng tỉ lệ enzyme đến mức độ thủy phân dầu VCO loại enzyme lipase 50 3.1.2.3 Ảnh hưởng pH đến mức độ thủy phân dầu VCO loại enzyme lipase 52 3.1.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến mức độ thủy phân loại enzyme 54 3.1.3 Động học enzyme lipase 56 3.1.3.1 Động học enzyme Lypozyme TL 100L 56 3.1.3.2 Động học enzyme TL IM 57 3.1.3.3 Động học enzyme CRL 58 3.1.3.4 Động học enzyme PPL 59 3.1.3.5 So sánh động học loại enzyme lipase xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO 61 3.1.3.6 Khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO bốn loại enzyme lipase theo thời gian 64 Thu nhận phân đoạn acid béo tự 66 3.2 66 3.2.1 Thu nhận sản phẩm sau thủy phân (FFA HVCO) 66 3.2.2 Thu nhận phân đoạn acid béo tự FFA1, FFA2, FFA3 .68 3.2.2.1 Tỷ lệ phần trăm khối lượng phân đoạn 68 3.2.2.2 Thành phần acid béo phân đoạn 69 3.3 Hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo tự 71 3.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn acid béo tự 71 3.3.1.1 Hoạt tính kháng khuẩn FFA, HVCO VCO 71 3.3.1.2 Hoạt tính kháng khuẩn FFA1, FFA2 FFA3 73 3.3.2 Hoạt tính phân đoạn acid béo tự tác động đến hàm lượng cholesterol máu 76 3.3.2.1 Thay đổi trọng lượng chuột 76 viii chế độ ăn HFD, cholesterol bổ sung trực tiếp 2% vào thức ăn sở) hay giọt chất béo acid béo FFA1, chủ yếu MCFA chiếm 97,3% Do đó, bốn lơ chuột thí nghiệm cho ăn uống bảng 2.7 (chương 2) 28 ngày Kết thúc thí nghiệm, mẫu gan thu nhận, trích ly chất béo phân tích sắc ký khí với đầu dị ion hóa lửa để xác định thành phần acid béo hàm lượng cholesterol mẫu Kết trình bày mục 3.3.2.4 3.3.2.4 Hàm lượng cholesterol gan chế độ điều trị (thí nghiệm đợt 2) Hàm lượng (mg/100g) 2,0 1,706 1,499 1,5 1,0 0,5 0,232 0,226 0,0 Đối chứng HFD HFD + FFA1 FFA1 Nhóm thử Hình 3.19 Hàm lượng cholesterol mẫu thí nghiệm Sau 28 ngày thí nghiệm, kết phân tích số cholesterol mơ gan thể hình 3.19 Chỉ số cholesterol nhóm thể khác biệt đáng kể, đó, nhóm ăn thức ăn sở kết hợp uống FFA1, có hàm lượng cholesterol gan tương đương với nhóm đối chứng ăn thức ăn sở kết hợp uống nước cất, tương ứng 0,22 0,23% Như vậy, chất FFA1 không làm tăng hàm lượng cholesterol gan Tuy nhiên, chuột ăn chế độ HFD kết hợp với uống FFA1 hàm lượng cholesterol gan cao hẳn nhóm đối chứng cao nhóm ni ăn chế độ HFD kết hợp uống nước cất Điều giải thích phần HFD ni ăn có tới 2% cholesterol bổ sung, FFA1 chủ yếu acid béo mạch trung bình (97,3%), vào thể chuột MCFA ưu tiên sử dụng trước để chuyển hóa trực tiếp thành lượng, xảy việc tích tụ mỡ thể nên khơng gây tăng cân [16] Vì vậy, cân nặng nhóm ăn thức ăn sở kết hợp uống FFA1 ăn HFD kết hợp uống FFA1 giảm 1,1 lần so với chuột ăn chế độ HFD kết 85 hợp uống nước cất 35,45 ± 0,5b, 35,09 ± 0,8bc 37,91 ± 0,77a (g) (phụ lục 1.14) Trong đó, LCFA có xu hướng vận chuyển qua đường bạch huyết nên dễ tích tụ mỡ, gây tăng cân [16] Đối với lô chuột ăn HFD kết hợp uống FFA1, có cạnh tranh MCFA (từ FFA1) LCFA (từ thức ăn HFD) trình hấp thụ, kết là, MCFA ưu tiên sử dụng trước nên đủ lượng cung cấp cho nhu cầu hoạt động thể cholesterol chế độ ăn HFD cịn lại sau q trình chuyển hóa khơng sử dụng, điều khiến cho lô chuột ăn HFD kết hợp uống FFA1 có hàm lượng cholesterol gan cao nhóm ăn HFD [76] Trên sở đó, giả thuyết rằng, hạt chất béo xuất mô gan lơ chuột ăn HFD kết hợp uống FFA1 (hình 3.18F) có chất cholesterol khơng phải MCFA tích tụ Để kiểm chứng giả thuyết này, mẫu gan phân tích thành phần hàm lượng acid béo có mẫu Kết trình bày mục 3.3.2.5 3.3.2.5 Thành phần acid béo gan chế độ điều trị (thí nghiệm đợt 2) 2,00 Nồng độ (mg/100g) 1,50 Control 1,00 HFD HFD + FFA1 FFA1 0,50 - Thành phần FFA Hình 3.20 Kết phân tích thành phần acid béo Nhóm đối chứng: thức ăn sở + nước cất (control), nhóm FFA1: thức ăn sở + uống FFA1, nhóm HFD: ăn HFD + nước cất, nhóm ăn HFD + uống FFA1 (HFD+FFA1) 86 Mẫu gan xác định thành phần acid béo đồng thời với việc phân tích hàm lượng cholesterol, kết thể hình 3.20 Kết phân tích cho thấy, bốn chế độ thí nghiệm, bao gồm lô chuột ăn thức ăn sở kết hợp uống nước cất, lô ăn thức ăn sở kết hợp uống FFA1, lô ăn thức ăn giàu béo HFD kết hợp uống FFA1 lô ăn HFD kết hợp uống nước cất, thành phần acid béo tồn gan có mạch cacbon từ C16 đến C22, tuyệt đối khơng có mặt MCFA mẫu phân tích Kết này, lần chứng minh rằng, q trình chuyển hóa MCFA ưu tiên hấp thụ trước, đồng thời, chúng chuyển hóa trực tiếp thành lượng Khi xét hàm lượng acid béo mẫu phân tích, hình 3.20 phụ lục phần 2, thấy thành phần acid béo mẫu gan chuột nuôi thức ăn sở kết hợp uống FFA1 không khác mẫu gan chuột đối chứng (thức ăn sở kết hợp uống nước cất); mẫu gan chuột nuôi ăn HFD HFD+FFA1 hàm lượng C18:1 C18:2 tăng lên đáng kể so với mẫu gan chuột không sử dụng HFD, cao mẫu gan chuột ăn HFD kết hợp uống nước cất Mặt khác, xét hàm lượng triglyceride tổng kết phân tích bảng 3.13 cho thấy, máu chuột nhóm F-( HFD+FFA1) hàm lượng triglyceride tổng thấp đáng kể so với nhóm B(HFD), 0,57±0,09d 0,84±0,14ab (mmol/L) (p