Nghiên cứu thủy phân tryglyceride trong dầu dừa để thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có hoạt tính sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ ÁI VÂN NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN TRIGLYCERIDE TRONG DẦU DỪA ĐỂ THU NHẬN CÁC PHÂN ĐOẠN ACID BÉO TỰ DO CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số chuyên ngành: 62540101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2019 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Phan Ngọc Hòa Người hướng dẫn khoa học 2: TS Trần Bích Lam Phản biện độc lập 1: Phản biện độc lập 2: Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp vào lúc ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp HCM - Thư viện Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Tạp chí quốc tế Van T.A Nguyen, Truong D Le, Hoa N Phan, and Lam B Tran, “Antibacterial Activity of Free Fatty Acids from Hydrolyzed Virgin Coconut Oil Using Lipase from Candida rugosa,” J Lipids, vol 2017, pp 1–7, 2017 (Scopus) Van T.A Nguyen, Truong D Le, Hoa N Phan, and Lam B Tran, “Hydrolysis Activity of Virgin Coconut Oil Using Lipase from Different Sources,” Scientifica, vol 2018, pp 1–7, 2018 (Scopus) Van T A Nguyen, Truong D Le, Hoa N Phan, and Lam B Tran, “Isolating free fatty acid from virgin coconut oil using lipase from different sources,” Jurnal Teknologi, vol 3, pp 55–59, 2018 (Scopus) Tạp chí nước Van T.A Nguyen, Tuan M Pham, Duy H Truong, and Hoa N Phan, “Antibacterial activity of hydrolyzed virgin coconut oil by immobilized lipase,” Journal of Science and Technology, vol 54, 2016 Kỷ yếu hội nghị quốc tế Van T A Nguyen, Hoa N Phan, and Lam B Tran, "Enzymatic hydrolysis of coconut oil using lipases from Candida rugosa and porcine pancreas", The 2nd International Conference on Chemical Engineering, Food and Biotechnology 2015, ISBN: 978-604-63-1598-8 Van T A Nguyen, Hoa N Phan, and Lam B Tran, "Hydrolysis of virgin coconut oil using free and immobilized lipase from Apergillus Oryzae" proceeding of the 2016 International Conference on Advanced Technology and Sustainable Development, ISBN: 978-604-920-040-3 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Việt Nam có sản lượng dầu thực vật thấp, nhập nhiều, số nguồn dầu nước chưa khai thác chế biến tốt, nhiều nơi bán ngun liệu thơ, từ nguyên liệu tạo sản phẩm có giá trị sử dụng cao Dầu dừa nguồn dầu béo Việt Nam Dầu dừa có thành phần acid béo mạch cacbon từ C6 đến C18, chủ yếu acid béo bão hòa, có đặc điểm hàm lượng lớn acid béo no mạch trung bình, khó bị oxi hóa Ở số nước Đông Nam Á Philippines, Indonesia Thái Lan, từ dầu dừa sản xuất nhiều sản phẩm có giá trị, dùng dược phẩm mỹ phẩm Theo số cơng bố dầu dừa VCO có khả làm giảm hàm lượng cholesterol máu (Harini, 2009) Những nghiên cứu trước chứng minh rằng, triglyceride acid béo mạch trung bình dễ dàng hấp thu giải phóng thành lượng, làm tăng cảm giác no sớm, nên giảm ăn, giúp giảm trọng lượng (St – Onge cộng sự, 2002) Mặt khác, nhiều nghiên cứu cho thấy, trạng thái tự do, acid béo mạch trung bình dầu dừa thể khả kháng khuẩn kháng nấm (Shilling cộng sự, 2013; Beena Shino cộng sự, 2016) Đặc biệt công dụng acid lauric – acid béo mạch trung bình điển hình dầu dừa, thu hút ý nhà nghiên cứu chế biến thực phẩm nhờ hoạt tính sinh học cao, khả kháng vi khuẩn, kháng nấm mốc kháng virút (Kim cộng sự, 2016; Sun cộng sự, 2003; F.M Dayrit, 2014) Tùy thuộc vào điều kiện thủy phân dầu dừa, thu sản phẩm thuỷ phân có tính chất khác nhau, có giá trị sinh học khác Trên sở đó, luận án nghiên cứu qui luật thủy phân dầu dừa VCO số loại enzyme lipase để thu chất có hoạt tính sinh học” Mục tiêu nghiên cứu, đóng góp mặt khoa học thực tiễn 2.1 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định loại enzyme lipase thủy phân dầu VCO phù hợp; - Đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo tự 2.2 Ý nghĩa khoa học tính luận án - Đã xác định qui luật thủy phân dầu VCO bốn loại enzyme lipase ảnh hưởng bốn yếu tố như: tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, pH nhiệt độ, đồng thời xác định thông số động học loại enzyme lipase chất dầu VCO - Đã xác định khả kháng lại bốn loại vi khuẩn Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) Salmonella enteritidis (ATCC 13076) phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 FFA3 thu nhận từ trình thủy phân dầu VCO - Bước đầu xác định ảnh hưởng phân đoạn FFA1, FFA2 FFA3 đến hàm lượng cholesterol thể chuột FFA1 FFA2 vừa giúp giảm hàm lượng cholesterol máu vừa giúp giảm trọng lượng chuột cho ăn chế độ giàu béo (HFD) Riêng FFA3 (phân đoạn chứa acid béo tự mạch dài, chủ yếu từ C14 – C18), không cải thiện trọng lượng chuột cho ăn chế độ HFD mà gây viêm gan 2.3 Ý nghĩa thực tiễn - Đã xác định điều kiện thủy phân dầu VCO phù hợp cho loại enzyme lipase chọn loại enzyme thủy phân VCO với mức độ thủy phân cao thời gian ngắn hàm lượng acid béo mạch trung bình (MCFA) giải phóng lên đến 61.37% - Đã thu nhận phân đoạn acid béo tự FFA1, FFA2 FFA3, đồng thời xác định thành phần hàm lượng acid béo tự phân đoạn - Đã chứng minh được, acid béo có mạch cacbon từ C6 đến C12 (FFA1 FFA2) có hoạt tính kháng bốn loại vi khuẩn thử nghiệm, acid béo có mạch cacbon từ C14 đến C18 (FFA3) khơng có hoạt tính kháng bốn loại vi khuẩn kể - Đã xác định hai phân đoạn FFA1 FFA2 có khả cải thiện hàm lượng cholesterol máu trọng lượng chuột giống Wistar cho ăn chế độ HFD Trong đó, phân đoạn FFA3, chứa chủ yếu acid béo mạch dài, gây viêm gan mà làm tăng trọng so với chuột cho ăn chế độ HFD Cấu trúc luận án Luận án gồm có chương Mở đầu Chương Tổng quan Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương Kết biện luận Chương Kết luận kiến nghị CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Dầu dừa VCO hợp chất có hoạt tính sinh học 1.2 Các phương pháp thủy phân dầu VCO 1.3 Enzyme lipase 1.4 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu trọng tâm luận án bao gồm vấn đề sau: - Xác định qui luật ảnh hưởng tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/ chất, pH nhiệt độ đến mức độ thủy phân dầu VCO bốn loại enzyme lipase Xác định giá trị động học 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 loại enzyme lipase xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO - Xác định loại enzyme lipase xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO đạt mức độ thủy phân cao thời gian ngắn giải phóng hàm lượng acid béo mạch trung bình nhiều nhất, để thu nhận sản phẩm acid béo tự (FFA) Các phân đoạn acid béo có chiều dài mạch cacbon khác FFA1, FFA2, FFA3 thu nhận từ FFA tổng, phương pháp chưng cất chân khơng Trong đó, FFA1 acid béo tự mạch trung bình (MCFA), mạch cacbon từ C6 – C10, FFA2 acid lauric (C12), FFA3 acid béo mạch dài (LCFA), mạch cacbon từ C14 –C18 - Đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo thông qua khả kháng bốn loại vi khuẩn gây bệnh thường gặp thực phẩm như: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) Salmonella enteritidis (ATCC 13076) Đồng thời, tác động phân đoạn acid béo đến hàm lượng cholesterol máu chuột giống Wistar khảo sát CHƯƠNG 2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - Dầu dừa VCO sản xuất tài trợ công ty TNHH chế biến dừa Lương Quới (tỉnh Bến Tre, Việt Nam) - Lypozyme TL 100L chế phẩm enzyme cơng nghiệp, dạng lỏng, màu vàng nâu, trích ly từ nấm Thermomyces lanuginosus, đặc hiệu vị trí xúc tác sn – 1,3 mạch triglyceride, cung cấp hãng Novozymes (Đan Mạch) - Lypozyme TL IM chế phẩm enzyme cố định, dạng bột, màu trắng, trích ly từ nấm Thermomyces lanuginosus, đặc hiệu vị trí xúc tác sn – 1,3 mạch triglyceride, cung cấp hãng Novozymes (Đan Mạch) - Candida rugosa lipase (CRL), ký hiệu L1754, Type VII, cung cấp hãng Sigma – Aldrich (Mỹ) CRL chế phẩm enzyme tự do, màu trắng, dạng bột, có nguồn gốc từ nấm Candida rugosa, khơng đặc hiệu vị trí xúc tác mạch triglyceride - Porcine pancreas lipase (PPL), ký hiệu L3126, Type II, cung cấp hãng Sigma – Aldrich (Mỹ) PPL chế phẩm enzyme tự do, màu trắng, dạng bột, có nguồn gốc từ tuyến tụy lợn, đặc hiệu vị trí xúc tác sn – 1,3 mạch triglyceride - Chủng vi khuẩn dùng để thử nghiệm khả kháng khuẩn tổ hợp acid béo tự Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) Salmonella enteritidis (ATCC 13076) Tất cung cấp Microbiologics, Inc (St Cloud, Minnesota, USA) - Chuột đực giống Wistar tuần tuổi, trọng lượng trung bình khoảng 30 gam/con, cung cấp viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh - Các hóa chất sử dụng nghiên cứu có xuất xứ từ hãng Merck & Co (Đức), Sigma Chemical Co (Hoa kỳ) cung cấp Cơng ty hóa chất Hóa Nam (Việt Nam) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu dầu VCO loại enzyme lipase - Xác định A, X, I, P - Xác định thành phần acid béo - Xác định hoạt tính Nghiên cứu thủy phân VCO - Khảo sát tỉ lệ dầu/đệm - Khảo sát tỉ lệ enzyme/cơ chất - Kháo sát nhiệt độ - Khảo sát pH - Khảo sát thời gian thủy phân - Khảo sát động học enzyme Nghiên cứu thu nhận sản phẩm sau thủy phân Nghiên cứu thu nhận phân đoạn acid béo Khảo sát giảm Cholesterol trọng lượng chuột Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu Nội dung nghiên cứu luận án chia làm phần: Phần Nghiên cứu trình thủy phân dầu VCO bốn loại enzyme lipase khác Phần Nghiên cứu thu nhận sản phẩm sau thủy phân gồm phân đoạn acid béo tự mạch trung bình, acid lauric acid béo mạch dài Phần Khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo đến khả kháng loại vi khuẩn thường gây bệnh thực phẩm Đồng thời, khảo sát tác động chúng đến hàm lượng cholesterol máu 2.2.1 Khảo sát trình thủy phân dầu VCO bốn loại enzyme lipase khác Mục đích phần nghiên cứu tìm điều kiện thủy phân phù hợp loại enzyme lipase xúc tác trình thủy phân dầu VCO, từ xác định qui luật xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO loại enzyme lipase Xác định số Michaelis Menten Km vận tốc phản ứng cực đại Vmax đặc trưng cho enzyme, từ nhận định lực liên kết loại enzyme với chất dầu VCO Xác định qui luật xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO loại enzyme lipase 2.2.2 Thu nhận phân đoạn acid béo tự Mục đích phần nghiên cứu thu nhận phân đoạn acid béo tự có chiều dài mạch cacbon mong muốn Trong đó, tổ hợp acid béo FFA1 chứa chủ yếu acid béo tự mạch trung bình (C6 – C12), FFA2 chứa chủ yếu acid lauric (C12) FFA3 chứa chủ yếu acid béo tự mạch dài (C14 – C18) 2.2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo tự Mục đích phần nghiên cứu xác định hoạt tính sinh học phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 FFA3 Xác định qui luật kháng khuẩn qui luật tác động đến hàm lượng cholesterol máu phân đoạn acid béo tự từ dầu VCO 2.3 Phương pháp xử lý số liệu Tất thí nghiệm lặp lại lần, phân tích thống kê thực phần mềm R version 3.1.3 (cập nhật ngày 03-09-2015) Dữ liệu trình bày dạng độ lệch chuẩn ± trung bình Riêng thí nghiệm động vật, khác biệt nhóm phân tích cách sử dụng phương pháp phân tích phương sai (Nested ANOVA) trước sử dụng Duncan, giá trị có ý nghĩa thống kê p