VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC — G8G8 Lũ SDS0 — KH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội ĐÊ TÀI Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kế.
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC —-G8G8 Lũ SDS0-— K'H KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội ĐÊ TÀI: Tách dịng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biến Quáng Trị Giáo viên hướng dẫn : T.s Vũ Thị Thu Huyền Giáo viên hướng dẩn : Th.s Trần Thị Kim Dung Sinh viên thực Lóp : Phạm Vũ Vưong : 13-01 Hà Nội, 05-2017 Mục Lục MÓ ĐÀU PHÀN 1: TÒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hái miên: 1.2 Vi sinh vật liên kết hài miên: 1,3 Một số nghiên cứu nước giới chất có hoạt tính sinh học thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên: 1,4 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết với hãi miên Việt Nam: 10 1.5 Vai trò polyketide synthase: 12 1.6 Vector tách dòng pCR2.1 invitrogen 15 6Tnurvien việiĩĐạiì nọc MO Ha Nọỉ PHÀN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 18 2.1 Vật liệu 18 2.1.1 Vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị phân lập 18 2.1.2 Các thiết bị sinh phẩm 18 2.1.3 Trang thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 21 2.2.1 Phương pháp tách DNA tổng vi sinh vật liên kết hái miên: 21 2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ quang phổ kế : 23 2.2.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): 24 2.2.4 Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng: 27 2.2.5 Tách chiết plasmid: 28 2.2.6 Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose (thôi gel): 31 2.2.7 Tinh vector tái tồ hợp,- 33 2.2.8 Xác định trình tự gen máy tự động: 34 PHẦN 3: KẾT QUÁ 36 3.1 Kết quà tách DNA tổng số: 36 3.2 Kết quà khuếch đại gen (PCR) 37 3.3 Kết thu nhận gen polyketide synthase từ gel agarose (thôi gel).39 3.4 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợpvào tế bào khã biến 40 3.5 Kết tách plasmid 41 3.6 Ket giải trình tự PHẦN 4: KÉT lĨỊKÌ vi(?n viện Đạ' học Mo‘ Hà 42 47 PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHÁO 48 DANH MỤC TÙ VIÉT TẤT Amp Ampicillin DNA Deoxyribonucleotid Acid DEPC Diethylpyrocarbonat dNTP Deoxyribonucleotid 5' -triphosphates EtBr Ethidium bromide EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid kb Kilo base LB Lauria-Bertani Non ribosomal peptide synthases NRPS mRNA Messenger RNA OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Tteibịtóìeỉrtỉd vU&ii học Mơ Hà Nội RNA RNase Ribonuclease RT Room temperature SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris-Acetate-EDTA Taq polymerase Polymerase Thermus aquaticus TE Tris-EDTA KPS x-gal Vsv v/p Polykctidc synthase 5-bomo-chlorua-3-indolyl-0-D-galactoside Vi sinh vật vòng/phút DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mầu hải miên thu nhận từ biển Quàng Trị Việt Nam Hình 1.2.Phàn ứng tong hợp polyketide sinh tống hợp tiền chất doxorubicin, e-rhodomycinone 14 Hình 1.3.So đồ cấu trúc vị trí cắt giới hạn vector pCR®2.1 17 Hình 2.1 Trình tự cắt enzyme giới hạn EcoR 30 Hình 3.1 Điện di đồ sàn phấm DNA tống so vi sinh vật liên kết hài miên 36 Hình 3.2 Kết điện di sản phấmPCR gel agarose % 39 Hình 3.3.Kết điện di sản phấm PCR tinh sau gel 40 Hình 3.4.Hình ánh đĩa ni cấy sau biến nạp 41 Hình 3.5.Điện di đô sàn phâm tách plasmid 42 Hình 3.6.Hình ánh so sánh trình tự nucleotide gen PKS thu genbank Th«viêfi"ViệnĐạthọe"MỞHàNợi 45 Hình 3.7.S0 sánh trình tự acid amin dịch mã từ trinh tự nucleotide với trình tự acid amin công bố genbank 46 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các enzymes biển phát từ nguồn mctagenomics: Bảng : Thành phần vị trí vector tách dịng pCR®2.1: 16 Bàng Thành phần phàn ứng PCR: 38 Bàng 4.Chu trình nhiệt phàn ứng PCR: 38 Bàng Thành phần phàn ứng chu trình nhiệt: 43 Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI MỞ ĐẦU Dặt vấn đề: Việt Nam nằm khu vực Thái Bình Dương, nơi có nguồn đa dạng sinh học vô phong phú.Một vài năm trước nghiên cứu hóa học hợp chất thiên nhiên biển Việt Nam mới, nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất từ nguồn sinh vật biến nham phục vụ sàn xuất thực phấm chức dùng làm nguyên liệu nghiên cứu thuốc giai đoạn đàu Sinh vật biền nguồn nguyên liệu lý tưởng cung cấp hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao kháng khuấn, kháng nấm, kháng sinh, chống sốt rét, chống ung thư, kìm hãm HIV, điều biến cung cấp nhiều loại thuốc mới, chế phấm có giá trị cao phục vụ nơng nghiệp, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm nước xuất Đại dương chứa 500.000 lồi động vật khơng xương sống cá lồi rong, tao.Mơi trường biên kho làng họp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mà nhiều chất cho thấy đặc điếm cấu trúc chưa gặp hợp chất thiên nhiên cạn.Một số loài tạo họp chất sinh học từ nguồn thức ăn, số khác tự tồng họp mới, số chất vi sinh vật liên kết sinh ra, số khác đòi hỏi phái có kết họp vật chù vi sinh vật Cấu trúc, tính chất hợp chất cùa mầu bị tác động bời vùng phân bố mẫu hoặcbởi yếu tố địa lý mùa vụ Hài miên biết nguồn giàu sàn phấm tự nhiên giá trị polyketides, nonribosomal peptids alkaloids Các nhà khoa học tin nhiều sàn phẩm hải miên thực tế vi sinh vật liên kết hải miên sinh Vùng biến Quảng Trị nơi phát đánh giá khu vực hải miên sinh nhiều hoạt chất thiên nhiên phong phú Bới vậy, thực đề tài: “Tách dịng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết Phạm Vũ Vương - Lóp 1301 - CNSH Trang KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI hải miên vùng biến Quãng Trị.” nhằm xác định vi sinh vật liên kết hải miên nguồn thu polyketide synthase hiệu có ứng dụng thực tế Mục tiêu Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị thành cơng tìm hiếu írng dụng polyketide synthasetrong nghiên cứu sản xuất Nội dung nghiên cứu Tách dịng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hái miên vùng biên Quăng Trị Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Phạm Vũ Vương - Lóp 1301 - CNSH Trang KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI PHẦN 1: TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hải miên: Hãi miên (hay gọi bọt biền sea sponge) động vật đơn giàn sống sàn đại dương Chúng gan thường xuyên vào nơi đó, di chuyến nước qua chúng, lọc sinh vật nhò li ti đế làm thực phấm Những chỗ nước qua cấu trúc lỗ sàng làm cho thể chúng hữu ích Hình 1.1: Mầu hài miên thu nhận từ biến Quàng Trị Việt Nam Bên nhiều loài hải miên nơi cư trú cộng đồng vi sinh vật bao gồm vi khuân cô, vi khuân, nấm virus Sinh khối vi sinh vật chiếm tới 35% khối lượng hải miên Những loại hái miên phân loại hái miên có hàm lượng vi sinh vật cao nồng độ vi sinh vật mô loại hái miên khoáng 108 - 1O10 tế bào/lg, nồng độ cao - lần vi sinh vật loại tìm thấy mầu nước biển Đối với loại hái miên có hàm lượng vi sinh vật thấp nồng độ vi sinh vật mô loại hái miên vào khoảng 105 - 106 tế bào/lg; tương đương với lượng vi sinh vật tìm thấy mầu nước biển Phạm Vũ Vương - Lóp 1301 - CNSH Trang KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Hài miên có vai trị quan trọng chu trình dinh dưỡng cùa hệ thống rạn san hô Các nhà khoa học tin rang chúng nhân tố quan trọng làm thay đối chất lượng nước theo hướng xấu tốt Các nhà khoa học phân tích hải miên thớ nhanh the lượng nitrogen chúng thài trình Hài miên thu thập vi sinh vật lọc nước quanh chúng, vi sinh vật tin tướng làm nhiều việc Các vi khuẩn có thề có khã tăng tạo dạng nitrogen từ khí nitơ nước làm chất dinh dường cho hải miên Chúng có khả chuyển hóa ammonium hái miên thớ thành khí nitơ, sau giãi phóng vào khí quyển.Q trình làm giám hàm lượng nitrogen dư thừa rạn san hơ, ngăn cản thay đổi có hại hệ sinh thái.Các nhà khoa học tin việc chuyến hóa khí nitơ thành nitrogen có ích có lợi cho việc sống sót cùa thể khác biển Hãi miên biên đáph giá mở vàng năm gần đa dạng chất trao đổi thứ cấp chúng Tác dụng sinh học chat trao đối từ hái miên báo cáo hàng trăm báo khoa học hải miên tương lai có tiềm cung cấp thuốc chống bệnh quan trọng ung thư, số bệnh virus, sốt rét viêm nhiễm Hài miên sản sinh nhiều hợp chất hóa học với khung cacbon khác nhau, chúng cản trở phát sinh bệnh thời điếm khác Việc bệnh bị chống lại thời diem khác làm tàng phát triền loại thuốc chọn lọc cho đích đặc hiệu 1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên: Người ta tính vi khuẩn biển nhiều, đạt mật độ đen 106/ml nước biển, sinh khối biển chất trao đối nhiều Môi trường biển, gồm cà lớp bề mật, người ta tin chứa khoảng 3,67x1 o'(' vi Phạm Vũ Vương - Lóp 1301 - CNSH Trang KHOẮ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Hình 3.2 Kết điện di sản phấm PCR gel agarose % Giếng 1: Sán phẩm PCR; giếng 2: Thang DNA Ikbp plus Fermentas Ket điện di cho thấy, sản phẩm PCR có nhiều băng rõ nét, nhiên sàn phẩm lý thuyết mong đợi xuất với kích thước tương ,,ứng khoang ™ Thu, ýiện viên ĐaiiiocxMởxHà Nôi ;â 700 bp, điêu chứng tở cặp mơi thiêt kẽ có hiệu qua Ngồi sản phấm mong muốn, cịn xuất thêm hai sàn phấm khác, chúng tơi nhận định hệ gen của nhiều vi sinh vật liên kết hái miên tồn nhiều vùng có trình tự tương đồng với trình tự cặp mồi 3.3 Kết thu nhận gen polyketide synthase từ gel agarose (thơi gel) Sản phẩm PCR có kích thước khoáng 700 bp xuất rõ điện di đồ lựa chọn Tuy nhiên, sản phẩm chưa có đủ độ cần thiết đế làm thí nghiệm cịn lẫn tạp với sân phấm khác có sàn phẩm Do đó, chúng tơi tiến hành tinh sạch, thu nhận gen từ gel agarose này, phương pháp gel tiến hành theo quy trình hãng Sản phấm tinh sau gel điện di kiếm tra gel agarose 1% (hình 3.3) Phạm Vũ Vương - Lóp 130Ị - CNSH Trang 39 KHOẮ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Hình 3.3 Kết quă điện di sản phẩm PCR tinh sau gcl Giếng 1: sàn phẩm PCR tinh sạch; Giếng 2: Marker DNA kb Ket quà hình 3.3 cho thay sản phàm tinh băng rõ nét, khơng bị đứt gãy có kích thước khoảng 700 bp Điều cho thấy rang băng DNA đích tinh thành cơng có tính ngun vẹn cao, sừ dụng làm nguyên liệu đế gan vào vector tách dòng Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội 3.4 Kết biến nạp plasmid tái tổ họpvào tế bào khả biến Quá trình biến nạp vectơ tái tồ hợp vào tế bào vi khuấn khả biến chúng E coli thực phưong pháp sốc nhiệt Môi trường chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp môi trường LB đặc, có bố sung ampicillin (100 pg/ml), X-gal (40 pg/ml), IPTG (40 pg/ml) Sau nuôi 37()c 16 đĩa mơi trường có hai dạng khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu xanh khuân lạc có màu trăng Do vectơ pCR 2.1 có mang gen kháng Ampicillin, khuân lạc mọc môi trường chứa Ampicilin phải vi khuần mang plasmid Ngồi ra, trình tự đa điếm cho enzym giới hạn nhận biết lại nằm vùng promotor gen mã cho tiểu phần a cùa enzym p - galactosidase Bình thường, vùng đa điếm khơng ãnh hưởng tới đoạn gen, tiều Phạm Vũ Vương - Lóp 130Ị - CNSH Trang 40 KHOẮ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI phần tống hợp enzym tạo có tác dụng phân huỷ X- gal tạo sản phẩm làm cho khuẩn lạc có màu xanh Khi có đoạn gen lạ chèn vào vùng đa điểm, điều khiến tống hợp tiểu phần bị ngắt quãng, tế bào khơng có enzym hoạt động, kết q khơng phân h X-gal, khuẩn lạc có màu trắng Như khuẩn lạc trắng khuẩn lạc cho có khả mang plasmid tái tố hợp Kết biến nạp cho thấy có nhiều khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh xuất đìa thạch Đẻ kiềm tra khuần lạc trắng chắn mang plasmid tái tố hợp (plasmid có mang gen mục tiêu), chúng tơi lựa chọn ngẫu nhiên khuấn lạc trắng khuẩn lạc xanh, khuẩn lạc nuôi môi trường LB lịng có bổ sung Ampicilin nồng độ cuối 100 pg/ml , 37°c 18 Hình 3.4 Hình ành đĩa ni cấy sau biến nạp 3.5 Kết tách plasmid Mỗi khuẩn lạc chọn nuôi riêng 2ml mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin nêu Qui trình tách plasmit lien hành theo phưong pháp mô tả Plasmid sau tách Phạm Vũ Vương - Lóp 130Ị - CNSH Trang 41 KHOẮ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI điện di kiếm tra gel agarose l%.Ket tách chiết DNA plasmid từ E.coli thề hình 3.5 Hình 3.5 Điện di đồ sản phấm tách plasmid Giếng 1,2 plasmid tách từ khuẩn lạc trắng; Giếng plasmid tách từ khuần Ịạc xạnh Điện di đồ hình 3.5 cho thấy plasmid tách từ khuẩn lạc tráng có kích thước lớn kích thước plasmid từ khuấn lạc xanh, cho khuẩn lạc mang plasmit có gắn gen mục tiêu Do vậy, tiến hành giải trình tự plasmid khuẩn lạc 1,2 đề kiềm tra 3.6 Kết giải trình tự Trình lự nucleotide gen mục tiêu giải máy giái trình tự tự động ABI PRISM ® 3100 Avant (Aplied Biosytem) với hóa chất sinh phấm chuẩn BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi MI3 Phạm Vũ Vương - Lóp 130Ị - CNSH Trang 42 KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Trên sở hoạt động cùa máy, trước tiên phàn ứng gắn nucleotide đánh dấu vào sợi DNA tông hợp sợi khuôn tiến hành máy PCR Thành phan cùa phàn ứng mô tá bàng Băng 5: Thành phần phán ứng chu trình nhiệt đưọc trình bày sau: Thành phần phản ứng Big Dye : ịil Mồi (xuôi ngược ): 1,275 Ị11 Chu trình nhiệt Bước : 96°c / phút Bước : 96°c / 10 giây Buffer 2,5 X : |11 Bước : 50°C / giây Plasmid : pl Bước : 60°C / phút H2O khử ion vô trùng : 4,725 pl Bước : Lặp lại 25 chu kì từ bước dến bước Tổng thể tích Thư víộniViện Đ i họt B ước 6: 4%! /00 Tinh sach sản phàm đê xác định trình tư - Bổ sung pl EDTA 125mM pH ống sản phẩm - Thêm vào 60 pl etanol 100% ú nhiệt độ phòng 15 phút - Ly tâm tốc độ 4500 vòng 45 phút Thu tủa, rửa 60 pl etanol 70% - Ly tâm tốc độ 10000 v/p 10 phút Loại dịch thu cặn - Làm khô DNA Thêm vào 15j.ll Hidiformamide - Biến tính 95°c phút Đưa mẫu vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Sau kết thúc trình giái trình lự, trình tự xử iý bang phần mềm Bio-edit, kết xác định trình tự với cặp moi M13R sau (trình tự nucleotit từ vị trí nucleotide số đến 683): Phạm Vũ Vương - Lóp 1301 - CNSH Trang 43 KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI GCCATGGACCCGCAGCAACGCATCTTGCTGACGTATGCGTGGAAAGCGATTGAAGATGCCGGATAT GCGTCAẦAGAGTCTCTCAGGCACAAAGACAGGTG 101 tgtttatcgggaccggaaacaccggctacggttctcttttagccaatgccgatgcggcgattgaag GGTCATCCGCGGCGAATACAAGTCCGTCTGTCGG 201 ACCGAGCCGTGTCAGCTATACGCTCAATCTGCACGGGCCGAGCGAGCCGATTGATACCGCCTGCTC AAGCTCACTCGTTGCCATACACCATGCCGTTTCT 301 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội TCAATTGAAGAAGGGACGTGCGACATGGCTTTGGCGGGAGGAATCAATACGATTGTTCTTCCGGAT GTGTATATCAGCTTTGACAAAGCGGGCGCGCTGA 401 GCAAAGAAGGAAGATGCAAAACGTTCTCCGATCAGGCTGACGGTTTTGCCCATGGTGAAGGAGCCG GGCTCTTTTTCCTTAAAAAGCTGAAAGCCGCTGA 501 GGCGGATGGGGACCATATTTACGGCGTCATTAAAGGAAGCGCGGTGAATCACGGCGGCCGTGCGGC ATCTTTAACAACGCCTAACCCGAAACAACAGGCG 601 GAAGTTATTAAAGCCGCATACAAAAAAGCGGGCATTGATCCGAAAACAGTCTCTTATGTCGAGGCG CATGGCACGGGGACAAG Trình tự sau dịch mã sang acid amin: Phạm Vũ Vương - Lóp 1301 - CNSH Trang 44 KHOẮ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI AMDPQQRILLTYAWKAIEDAGYASKSLSGTKTGV F1GTGNTGYGSLLANADAA1EGSS AANTSPSVGPS RVSYTLNLHGPSEPIDTACSSSLVAIHHAVSSIEEG TCDMALAGGINTIVLPDV Y1SFDKAGALSKEGRCK TFSDQADGFAHGEGAGLFFLKKLKAAEADGDHIY GVIKGSAVNHGGRAASLTTPNPKQQAEVIKAAYK KAGIDPKTVSYVEAHGTGT Trình tự sau xừ lý phần mềm biocdit chúng tồi so sánh ngân hàng gen quốc tế, kết q cho thấy trình tự có độ tương đồng 99% nucleotidevà trình tự acid arnin với trình tự polyketide synthase kí hiệu WPySW2 cơng bố bởiFang,W Zhu,p Trường Đại học Ningbo,Zhejiang, P.R China Điều cho thấy chúng tơi tách dịng thành cơng đoạn gen PKS dài 683 bp, làm tiền đề cho công việc Sequences producing significant alignments: Select: All None Selected'.o ;■ Alignments ■ Ger£bc: Ộ L- ỉ Description rs _ ■■ score score cover Max Toial Quefy E Ident Accession value poivketide synthase IBacillus SP WPyS'AQl 458 458 99% 4e-163 99% ACG70841.1 J cỵk.iơe synthase [Bacillus sp S'Al6i 451 451 98% 3e-160 98% AGL92436.1 J coivketiơe synthase [Bacillus amvioliquefiaciensl 449 449 98% 9e-160 98% AGL92430 J colvketiơe synthase [Aspergillus carbcnanusi 449 449 99% tvce I tetosvnthase [Bacillus so LX-12GÌ 447 447 98% 7e-159 97% AIQ09653 J ketosvnthase [Bacillus sp.l 448 448 97% 7e-159 98% SAJ35048.1 ketosvnthase[Bacillus SD- LX-116Ì 446 446 97% 2e-158 98% AIU64903.1 1e-159 97% AAZ99721.1 DOiyketiơe synthase [Streptemvces SO L1161 442 442 98% 7e-157 96% ABU25212 □ ketosvn-hase [Bacillus SP.I 437 437 97% 7e-155 96% SAJ35047.1 ketosvnthase[Bacillus SP LX-94Ì 436 436 95% 2e-154 98% AIU64896.1 Phạm Vù Vương - Lớp 130 J - CNSH Trang 45 KHOẮ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Hình 3.6 Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide gen PKS thu genbank g Download V GenPept Graphics ▼ Next Descriptions polyketide synthase partial [Bacillus sp WPySW2| Sequence ID: ACG70841 Length: 227 Number of Matches: Related Information Range 1:1 to 227 GenPept Graphics Score Expect Method Identities Positives Gaps 458 b»ts(1178) 4e-163 Compositional matrix adjust 224/227(99%) 227/227(100%) 0/227(0%) Query Sbjct Query 61 Sbjct 61 AFDPQQRILLTYAWKAIEDAGYASKSLSGTKTGVFIGTG’CTGYGSLLAHADAAIEGSSAA 60 AFDPQQRiLLTYAWKAIEDAGYASKSLSGTKTGVFIGTGNTGYGSLLAHADAAIEGSSAA WDPQ^LLLTYAWKAIEDAGYASKSLSGTKTGVFIGTffliTGYGSLLANADAAIEGSSAA 60 trt^VGPSRVSYTLHLHGPSEPIDTACSSSLVAlHHAVSSIEEGTCOWLAGGINTIVL 120 KTSPSVGP’RVSYTuiLHGP^PIDTACSSSLVAlHHAVSSIEEGTCO^LAGGi^lVL irtSPSVGPNRVSYTLNLHGPSEPIDTACSSSLVAMiAVSSIEEGTCDmGGINTIVL 120 Query 121 POVYISFDKAGALSKEGRCKTrSDQADGFAHGEGAGLFFLKKLKAAEADGDHIYGVIKGS 180 ■ PDVYISFDKAGALSKEGRCKTFSDQADGFAHGEGAGLFFLKIiLKAAEADGDHIYGVIKGS Sbjct 121 PDVYISfDKAGALSKEGRCKTFSOQADGFAHGEGAGLFFLKKLKAAEADGDHIYGVIKGS 180 Query 181 AVWGGRAASLTIPNPKQQAEVIKAAYKKAGIDPKTVSYVEAMGTGT 227 AVWG6RAASLTTPfiPKQ$!.EVlKAAYKKAGIDPKTVSY*EAHGT6T Sbjct 181 AWiGGRAASLTIPfiPKQQAEVIKAAYKKMIQPKTVSYIEAHGTGT 227 Hình 3.7: So sánh trình tự acid amin dịch mã từ trinh tự nucleotide với trình tự acid amin công bố genbank Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Phạm Vũ Vương - Lóp 130Ị - CNSH Trang 46 KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI PHÀN 4: KÉT LUẬN Từ kết quà nhận được, khăng định tách dịng thành cơng đoạn gen polyketide synthase có độ dài 683 bp từ vi sinh vật liên kết hãi miên, làm tiền đề cho việc biếu gen thu nhận protein có hoạt tính từ dịng gen Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Phạm Vũ Vương - Lóp 1301 - CNSH Trang 47 KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdelmohsen Usama Ramadan Matthias Szesny, Eman Maher Othman, Tanja Schirmeister, Stephanie Grond, Helga Stopper and Ute Hentschel (2012) Antioxidant and Anti-Protease Activities of Diazepinomicin from the Sponge- Associated Micromonospora Strain RV115 Mar Drugs, 10 2208-2221; doi: 10.3390/mdl 0102208 Azzini Francesca, Barbara Calcinai, Carlo Cerrano, Giorgio Bavestrello, Maurizio Pansini (2007) Sponges of the marine karst lakes and of the coast of the islands of Ha Long Bay (North Vietnam)Porifera Research: Biodiversity, Innovation and Sustainability - 2007: 157- 164 Bas.ak O’ztuTk, Lenny de Jaeger, Hauke Smidt & Detmer Sipkema (2013) Culture-dependent and independent approaches for identifying novel halogenases encoded by Crqmbe ^rcimbe (marine sponge) microbiota Sci Reports 3:2780 DOI: 10.1038/srep02780 Basnak O'ztu 'rk, Lenny de Jaeger, Hauke Smidt & Detmer Sipkema (2013) Culture-dependent and independent approaches for identifying novel halogenases encoded by Crambe crambe (marine sponge) microbiota Scientific Reports 3:2780 DOI: 10.1038/srep02780 Brakhage A.A., 2013 Regulation of fungal secondary metabolism Nat Rev Microbiol 11,21-32 Calcinai Barbara Francesca Azzini, Giorgio Bavestrello, Carlo Cerrano, Maurizio Pansini and Do Cong Thung (2006) Boring sponges from Ha Long Bay, Tonkin Gulf, Vietnam Zoological studies 45(2): 201-212 Desbois, A p., and V J Smith 2010 Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential Appl Microbiol Biotechnol 85:1629-1642 Phạm Vũ Vương - Lóp 130 J - CNSH Trang 48 KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Đỗ Mạnh Hào Phạm Thế Thư (2010) Một số kết quà nghiên cứu vi sinh vật vùng ven biến Hái Phòng TC Khoa học Công nghệ biến 10( ):51 -65 Feby Annie, Shanta Nair (2010) Sponge-associated bacteria of Lakshadweep coral reefs, India:resources for extracellular hydrolytic enzymes Adv Biosci Biotechnol 1:330-337 doi: 10.4236/abb.2010.14043 Goode Ann Marie (2009) Polyketide synthase pathway discovery from soil metagenomic libraries MS thesis, Auburn University 10 He R Bochu Wang Toshiyuki Wakimoto Manyuan Wang, Liancai Zhu and Ikuro Abe (2013) Cyclodipeptides from Metagenomic Library of a Japanese Marine Sponge J Braz Chern Soc., 24(12): 1926-1932 1 He Rui, Toshiyuki Wakimoto, Yoko Egami, Hiromichi Kenmoku, Takuya Ito, Yoshinori Asakawa, Ikuro Abe (2012) Heterologously expressed bhydroxyl fatty acids from a metagenomic library of a marine sponge Bioorganic & Medicinal Chetpisfr^ Letters 22 7322-j7325 12 Hill Malcolm, April Hill Nora Lopez, Olivia Harriott (2006) Sponge-specific symbionts bacterial in the Caribbean sponge, Chondrilla nucula (Demospongiae Chondrosida) Marine Biology 148: 1221-1230 DOI 10.1007/S00227-005-0164-5 13 Jiang Cheng-Jian, Zhen-Yu Hao, Rong Zeng, Pei-Hong Shen, Jun-Fang Li and Bo Wu (2011) Characterization of a Novel Serine Protease Inhibitor Gene from a Marine Metagenome Mar Drugs, 9, 1487-1501; doi:10.3390/md9091487 14 Kar pushova A., F Bru'mmer, s Barth, s Lange, and R D Schmid 2005 Cloning, recombinant expression and biochemical characterization of novel esterases from Bacillus sp associated with the marine sponge Aplysina aerophoba Appl Microbiol Biotechnol 67:59-69 Phạm Vũ Vương - Lóp 130 J - CNSH Trang 49 KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 15 Kennedy J., N.D O’Leary, G.s Kiran, J.p Morrissey, F O’Gara, J Selvin and A.D.W Dobson (2011) Functional metagenomic strategies for the discovery of novel enzymes and biosurfactants with biotechnological applications from marine ecosystems J Appl Microbiol 111, 787-799 16 Kennedy Jonathan, Caroline E Codling, Brian V Jones, Alan D w Dobson and Julian R Marches! (2008) Diversity of microbes associated with the marine sponge, Haliclona simulans, isolated from Irish waters and identification of polyketide synthase genes from the sponge metagenome Environmental Microbiology 10(7): 1888-1902 17 Kim Tae Kyung and John A Fuerst (2006) Diversity of polyketide synthase genes from bacteria associated with the marine sponge Pseudoceratina : clavata culture-dependent and culture-independent Approaches Environmental Microbiology 18 Lại Thúy Hiền, Dương Văn Thắng, Trần cẩm Vân, Dỗn Thái Hịa (2003) Vi •, } Tnirvien viện Đại nọc Mơ Fla Nội khuân tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học phân lập từ bãi biền Nha Trang TC Sinh học 25(4): 53-61 19 Li Zhiyong, Ye Hu, Yan Liu.Yi Huang, Liming He Xiaoling Miao(2007) 16S rDNA clone library-based bacterial phylogenetic diversity associated with three South China Sea sponges World J Microbiol Biotechnol 23:1265-1272 20 Nguyen Huu Tung, Chau Van Minh, Tran Thu Ha, Phan Van Kiem, Hoang Thanh Huong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Jae-Hee Hyun, Hee-Kyoung Kang, Young Ho Kim (2009) C29-Sterols with a cyclopropane ring at C-25 and 26 from the Vietnamese marine sponge lanthella sp and their anticancer properties Bioorganic & Medicinal Chern Letter DOI: 10.1016/j.bmcl.2009.06.097 21 Nguyen Xuan Cuong, Arlette Longeon, Van Cuong Pham, Felix Urvois, Christine Bressy, Thi Thanh Van Trinh , Hoai Nam Nguyen Van Kiem Phan, Phạm Vũ Vương - Lóp 130 J - CNSH Trang 50 KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Van Minh Chau Jean-Francois Briand, and Marie-Lise Bourguet-Kondraeki (2013) Antifouling 26,27-Cyelosterols from the Vietnamese Marine Sponge Xestospongia testudinariai Nat Prod., 76 (7): 1313—1318 22 Nguyen Xuan Cuong.Tran Anh Tuan.Phan Van Kiem.Chau Van Minh,Eun Mi Choi,and Young Ho Kim (2008) New Cembranoid Diterpenes from the Vietnamese Soft Coral Sarcophyton mililatensis Stimulate Osteoblastic Differentiation in MC3T3-E1 CellsC/tiTO Pharm Bull 56(7) 988—992 23 Okamura, Y., et al 2010 Isolation and characterization of a GDSL esterase from the metagenome of a marine sponge-associated bacteria Mar Biotechnol 12:395^)02 24 Penesyan Anahit, Jan Tcbbcn, Matthew Lee, Torsten Thomas, Staffan Kjcllcberg, Tilmann Harder and Suhclcn Egan (2011) Identification of the Antibacterial Compound Produced by the Marine Epiphytic Bacterium Pseudovibrio sp D323 and Related Sponge-Associated Bacteria Mar Drugs, Fiiir viện Viẹn ỄTại nọc MOTia INỌ1 9, 1391-1402 25 Piel Jo" rn, Dequan Hui, Gaiping Wen, Daniel Butzke, Matthias Platzer, Nobuhiro Fusetani, and Shigeki Matsunaga (2004) Antitumor polyketide biosynthesis by an uncultivated bacterial symbiont of the marine sponge Theonella swinhoei PNAS 101 (46): 16222-16227 26 Quyền Đình Thi Trần Thị Quỳnh Anh Nguyền Thị Thao (2007) Tối ưu số điều kiện nuôi cấy chúng vi sinh vật biền Acinetobacter sp QN6 sinh tông hợp protease TC Công nghệ sinh học, 5(2): 187-196 27 Radjasa Ocky Kama, Agus Sabdono, Junaidi and Elena Zocchi (2007) Richness of secondary metabolite-producing marine bacteria associated with sponge Haliclona sp Inter J Pharmacology 3(3): 275-279 28 Schirmer Andreas, Rishali Gadkari, Christopher D Reeves, Fadia Ibrahim, Edward F DeLong and c Richard Hutchinson (2005) Metagenomic analysis Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 - CNSH Trang 51 KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI reveals diverse polyketid synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta Appl Environ Microbiol, 71(8): 4840- 4849 29 Sipkema D, Schippers K, Maalcke WJ, Yang Y, Salim s, Blanch HW (2011) Multiple approaches to enhance the cultivability of bacteria associated with the marine sponge Haliclona (gellius) sp Appl Environ Microbiol 77, 2130- 2140 30 Thomas Tresa Remya A., Devanand p Kavlekar and Ponnapakkam A LokaBharathi (2010) Marine Drugs from Sponge-Microbe Association—A Review A/ar Drugs 8: 1417-1468; doi:10.3390/md8041417 31 Tseng C-H and Sen-Lin Tang (2014) Marine Microbial Metagcnomics: From Individual to the Environment Int J Mol Sci., 15, 8878-8892; doi: 10.3390/ijms 15058878 32 Utkina N K and V A Denisenko (2011) Sesquiterpene Quinones From a Thir vien viẹnưại r >c Mv Ha iN0r Viet Nam sea sponge Spongia SP Chern Natural Compounds 47(1): 135-137 33,Wahyudi AT, Qatrunnada, Nisa Rachmania Mubarik (2010) Screening and Characterization of Protease Inhibitors from Marine Bacteria Associated with Sponge Jaspis sp HAYATI Journal of Biosciences December, 17(4): 173178 34 Wahyudi AT, Qatrunnada, Nisa Rachmania Mubarik Screening and Characterization of Protease Inhibitors from Marine Bacteria Associated with Sponge Jaspis sp HAYATI Journal of Biosciences December 2010, 17(4): 173-178 35 Wang Guangyi (2006)Diversity and biotechnological potential of the spongeassociated microbial consortia J Ind Microbiol Biotechnol 33: 545-551 36 Yung Pui Yi, Catherine Burke, Matt Lewis, Staffan Kjelleberg, Torsten Thomas (2010)Novel antibacterial Phạm Vũ Vương - Lớp 130 J - CNSH proteins from the microbial Trang 52 KHOĂ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI communitiesassociated with the sponge Cymbastela concentrica and the green alga Ulva australis Appl Environ Microbiol., doi: 10.1I28/AEM.0203810 37 Zhang Hongzhen, Fengli Zhang, Zhiyong Li(2009) Gene analysis, optimized production and property of marine lipase from Bacillus pumilus Bl06 associated with South China Sea sponge Halichondria rugosa World J Microbiol Biotechnol 25:1267-1274 DOI 10.1007/sl 1274-009-0010-x Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Phạm Vũ Vương - Lóp 1301 - CNSH Trang 53 ... sinh vật liên kết hải miên nguồn thu polyketide synthase hiệu có ứng dụng thực tế Mục tiêu Tách dịng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị thành... írng dụng polyketide synthasetrong nghiên cứu sản xuất Nội dung nghiên cứu Tách dịng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hái miên vùng biên Quăng Trị Thư vi? ??n Vi? ??n Đại... hải miên thực tế vi sinh vật liên kết hải miên sinh Vùng biến Quảng Trị nơi phát đánh giá khu vực hải miên sinh nhiều hoạt chất thiên nhiên phong phú Bới vậy, thực đề tài: ? ?Tách dịng gen mã hóa