Trên trình tự gen này không có vị trí cắt của các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, NdeI, XhoI...., do đó chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzyme NdeI v[r]
(1)NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ TÁCH DỊNG GEN MÃ HĨA ENZYME LUCIFERASE
Trần Thị Thanh Quỳnh1, Tô Văn Thiệp1, Nguyễn Văn Hoàng1,
Trần Thị Thu Hường1, Lê Duy Khánh1, Nguyễn Đình Hưng1, Phạm Kiên Cường1* Tóm tắt: Đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase từ đom đóm Việt Nam được nhân dịng thành công vào vector pGEMT phương pháp RT-PCR (Reverse transcription-Polymerase chain reaction) ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử khác Sau đó, plasmid mang đoạn gen (pGEM-luciferase) biến nạp vào tế bào E.coli giải trình tự Kết cho thấy: đoạn gen có kích thước khoảng 1,6 kb, có trình tự tương đồng 100% so với trình tự công bố ngân hàng gen giới (X66919.1) Trên trình tự gen khơng có vị trí cắt các enzyme giới hạn HindIII, BamHI, NdeI, XhoI , chúng tơi thiết kế thêm trình tự nhận biết hai enzyme NdeI vào đầu 5' HindIII vào đầu 3' gen mã hóa luciferase để phục vụ cho mục đích biểu sản xuất enzyme bằng phương pháp tái tổ hợp
Từ khóa: Enzyme luciferase, Đom đóm, Nhân dịng luciferase 1 MỞ ĐẦU
Luciferase nhóm enzyme có khả xúc tác cho phản ứng phát quang sinh học, thuộc họ protein dạng aldelynate, có nhóm oxy-4-oxidoreductase để thực hoạt động khử carboxyl hóa thủy phân ATP Hiện có 20 loại luciferase khác xác định dựa vào nguồn gốc chế tác dụng chúng Trong đó, luciferase đom đóm tập trung nghiên cứu nhiều [1,2,3]
Một ứng dụng quan trọng luciferase để phát tổng số vi sinh vật kiểm tra mức độ an toàn lương thực, thực phẩm phát sớm mức độ nhiễm khuẩn bề mặt vật thể chế biến bảo quản lương thực, thực phẩm y dược, với hệ thống enzym-cơ chất cực nhạy đom đóm So với phương pháp truyền thống đòi hỏi tốn nhiều thời gian để xử lý mẫu ni cấy đếm khuẩn lạc, phương pháp phát quang sinh học vượt trội hẳn mặt thời gian độ xác Nhiều hãng sản xuất kít giới phát triển thành cơng kít phát tổng số vi sinh vật phương pháp quang sinh học (Clean-Trace, Kikoman, Bio Thema )[3,7] Trên giới, có nhiều cơng trình nghiên cứu nhân dịng biểu thành cơng đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase đom đóm [4,8,9] hệ thống enzym luciferase trở thành công cụ đa với ứng dụng khác [5,6,7] bao gồm: thử nghiệm gen thị vi khuẩn dòng tế bào có nhân điển hình; phát có mặt vi sinh vật hợp chất độc hại, tương tác vi khuẩn/virut với tế bào chủ thơng qua hình ảnh bên thể, phân tích biểu gen thể động vật sống hình ảnh khối u Ở Việt Nam, có số cơng trình nghiên cứu enzyme luciferase [1,2,3], nhiên công bố ứng dụng phương pháp phát quang sinh học nói chung luciferase nói riêng cịn hạn chế chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu enzyme Đặc biệt việc ứng dụng enzyme luciferase lĩnh vực phục vụ cho quân đội trinh sát phát chất độc hóa học, quan trắc, kiểm sốt chất độc lương thực, thực phẩm môi trường lực lượng tác chiến điều kiện đặc biệt chưa quan tâm nghiên cứu
(2)nguyên liệu đạt hiệu thu hồi thấp Vì vậy, tổng hợp gen mã hóa cho enzyme luciferase, từ hướng tới việc ứng dụng phát triển sản xuất enzyme luciferase công nghệ tái tổ hợp cần thiết, có ý nghĩa khoa học thực tiễn Chính thế, nghiên cứu chúng tơi tiến hành nhân dịng giải trình tự đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase để tạo tiền đề, phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất enyme luciferase theo đường tái tổ hợp
2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu hóa chất
- Đom đóm thu Việt Nam (Nghệ An, 19/2/2015)
- Hóa chất: Các hóa chất thường dùng nghiên cứu sinh học phân tử hãng Sigma, Mecrk, Thermo Scientific
2.2 Thiết bị
Máy PCR thiết bị điện di ngang hãng Bio-rad (Mỹ), hệ thống chụp ảnh điện di Mega bio print hãng Fisher biotech (Úc), máy ly tâm lạnh hãng Orto alresa (Tây Ban Nha)
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số tách chiết từ đom đóm theo kit hãng ANABIO Nghiền 30
mg phần đom đóm nitơ lỏng Sau đó, bổ sung 400 µl Lysis buffer µl β-mecaptoethanol máy vortex 10 giây ủ nhiệt độ phịng phút Tiếp đến, bổ sung 200 µl isopropanol đảo ngược 5-6 lần Dịch có chứa RNA tổng số thu nhận cách ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút 10 phút, nhiệt độ phòng chuyển sang cột lọc SCO1 (Anapure filter spin column) Qua bước rửa cột đệm Washing buffer, ARN tổng số rửa chiết 50 µl Elution buffer
2.3.2 Phương pháp tổng hợp cDNA
RNA tổng số tiếp tục sử dụng để tổng hợp cDNA enzyme phiên mã ngược M-MLV Reverse Transcriptase hãng Enzynomic mồi hexamer
2.3.3 Phương pháp PCR nhân gen luciferase
Sau tách chiết thành công RNA tổng số từ đom đóm tổng hợp cDNA,
đoạn gen luciferase được nhân dựa cDNA tổng hợp phương
pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa trình tự gen luciferase của đom đóm
đã cơng bố ngân hàng gen giới (X66919.1) Cặp mồi có trình tự sau: Mồi Luciferase Fw: 5’ AACATATGGAAAACATGGAGAACGA 3’ Mồi Luciferase Rv: 5’ CCAAGCTTTACATCTTAGCAACTG 3’
Chúng thiết kế thêm trình tự nhận biết hai enzyme NdeI vào đầu 5'
HindIII vào đầu 3' gen mã hóa luciferase để phục vụ cho mục đích biểu sản
xuất enzyme phương pháp tái tổ hợp
Chế độ nhiệt phản ứng PCR sử dụng mồi luciferase sau:
94oC : 30 giây
54oC : 45 giây x 35 chu kỳ 72oC : phút 30 giây
(3)nhân dòng biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5, chọn lọc xanh trắng môi trường nuôi cấy chứa X-gal, IPTG ampicillin Plasmid tái tổ hợp tách
từ khuẩn lạc trắng kiểm tra có mặt gen luciferase PCR với cặp mồi
của vector mồi đặc hiệu gen mã hóa
2.3.5 Phương pháp tách chiết plasmid: Plasmid tái tổ hợp pGEM-luciferase tách
chiết từ tế bào E coli bằng kit hãng Qiagen
2.3.6 Phương pháp giải trình tự phân tích kết quả: Các sản phẩm PCR mong muốn đọc trình tự trực phương pháp Sanger máy giải trình tự tự động CEQ
8000 (Beckman Counter) Gen luciferase sau đọc trình tự so sánh với trình tự
gen tương ứng ngân hàng Gen quốc tế phần mềm BLAST NCBI
2.3.7 Phương pháp phân tích vị trí cắt enzyme giới hạn: Trình tự gen luciferase phân tích phần mềm ApE để xác định vị trí cắt enzyme giới hạn
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết RNA tổng số từ đom đóm tổng hợp cDNA
RNA tổng số tách chiết từ đom đóm kit hãng ANABIO Nồng độ RNA thu được tính tốn dựa kết đo quang phổ bước sóng 230 nm 11,7 ng/µl Tiếp đến, RNA tổng số sử dụng để tổng hợp cDNA enzyme phiên mã ngược M-MLV Reverse Transcriptase hãng Enzynomic mồi hexamer
3.2 Nhân gen mã hóa luciferase từ đom đóm
Đoạn gen luciferase được chúng tơi nhân dựa cDNA tổng hợp
phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa trình tự gen luciferase của
đom đóm cơng bố ngân hàng gen giới (X66919.1)
Sau PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% , thu băng DNA có kích thước khoảng 1,6 kb Trong đó, mẫu đối chứng âm (khơng có khn DNA) khơng xuất băng (Hình 1) Kích thước đoạn gen thu tương đương với kích
thước đoạn gen luciferase (X66919.1) công bố ngân hàng gen giới
Kết cho phép bước đầu khẳng định nhân thành công đoạn gen mã hóa cho luciferase từ đom đóm
3.3 Nhân dịng gen mã hóa luciferase từ đom đóm vào vector pGEM T
Sản phẩm PCR đoạn gen luciferase (1,6 kp) từ đom đóm gắn trực tiếp vào vector
nhân dòng pGEM-T, biến nạp vào tế bào E coli chủng DH5α tế bào biến nạp
nuôi cấy môi trường LB chứa ampicilin 50 g/ml với cảm ứng IPTG (1 mM)
và chất X-gal Tiếp theo, chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc trắng để kiểm tra có mặt đoạn gen nhân dòng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi pGEM.Fw pGEM.Rv thiết kế đặc hiệu cho vector pGEMT Theo tính tốn lý thuyết, nếu vector có
mang đoạn gen luciferase sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng 1,9 kb, bao
gồm kích thước đoạn gen luciferase khoảng 1,6 kb cộng với kích thước đoạn DNA
nằm mồi vector pGEMT 0,3 kb
Kết điện di gel agarose 1% sản phẩm PCR sử dụng DNA từ khuẩn lạc trắng làm khuôn cho thấy sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng cho băng DNA có kích thước khoảng 1,9 kb (các đường chạy 1-3)
Khi sử dụng PCR với cặp mồi đặc hiệu Luciferase Fw/Rv (Hình 2) cho thấy, sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng cho băng ADN kích thước khoảng 1,6 kb tương đương với kích
thước luciferase (đường chạy 7-9) Như vậy, thu khuẩn lạc mang plasmid tái
(4)luciferase Vì vậy, kết luận nhân dịng thành cơng đoạn gen mã hóa luciferase vào vector pGEMT
Hình 1. Kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen luciferase từ đom đóm. 1: Thang chuẩn DNA kb
2: Mẫu đối chứng (-), khơng có DNA 3: Sản phẩm PCR mẫu cDNA tổng hợp từ RNA tổng số tách từ đom đóm
Hình 2. Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc kiểm tra vector pGEM-luciferase 1-3: Khuẩn lạc PCR với mồi pGEM Fw/Rv 4: Đối chứng âm với mồi pGEM Fw/Rv 5: Thang chuẩn DNA 1kb
6: Đối chứng âm với mồi Luciferase Fw/Rv 7-9: Khuẩn lạc PCR với mồi Luciferase Fw/Rv
3.4 Tách chiết plasmid pGEM- luciferase
(a) (b)
Hình Kết điện di sản phẩm tách plasmid (a) và PCR kiểm tra plasmid pGEM- AChE (b) 1’: Thang chuẩn DNA 1kb
2’: Plasmid pGEM- luciferase
1: Plasmid pGEM- luciferase với mồi pGEM Fw/Rv
2: Đối chứng âm với mồi pGEM Fw/Rv 3: Thang chuẩn DNA 1kb
4: Đối chứng âm với mồi Luciferase Fw/Rv
5: Plasmid pGEM- luciferase với mồi Luciferase
Fw/Rv
Một khuẩn lạc trắng mang plasmid pGEM-luiciferase được nuôi lắc 5-10 ml LB
(5)sinh khối tế bào thu nhận dùng để tách plasmid kit hãng
Qiagen (Đức) Plasmid pGEM-luciferase tinh (Hình 3.a) sử dụng làm khuôn
để tiến hành PCR cặp mồi đặc hiệu vector pGEM T đoạn gen luciferase
Kết thể hình 3b
Như vậy, khẳng định tách chiết thành công plasmid pGEM-luciferase
Plasmid dạng tinh sạch sử dụng cho nghiên cứu 3.5 Giải trình tự gen mã hóa luciferase từ đom đóm
Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng tiến hành xác định trình tự đoạn gen mã hóa
luciferase Kết phân tích trình tự nucleotide gen luciferase nghiên cứu
so sánh với trình tự gen cơng bố ngân hàng gen giới (X66919.1) thể Hình
Từ hình cho thấy, trình tự luciferase thu nghiên cứu có khung đọc mở (ORF) 1647 bp, có tương đồng 100% so với trình tự luciferase của lồi đom đóm Luciola lateralis công bố giới Dựa vào kết phân tích phần mềm
ApE, cho thấy trình tự gen luciferase đom đóm Việt Nam khơng có vị trí cắt
(6)Hình 4. So sánh trình tự gen luciferase nghiên cứu trình tự gen luciferase đom đóm cơng bố giới (X66919.1)
Luciola lateralis là lồi đom đóm phổ biến Nhật Bản, kết so sánh
trình tự acid amin suy diễn enzyme luciferase loài L lateralis tương đồng 94% so
với trình tự lồi Luciola cruciata (một lồi đom đóm phổ biến khác Nhật Bản)
tương đồng 67% so với loài Photinus pyralis(loài đom đóm phổ biến Bắc Mỹ) Đoạn
gen mã hóa enzyme luciferase lồi L lateralis nhân dịng biểu thành
cơng E coli, với trình tự protein suy diễn gồm 548 acid amin có khối lượng phân
tử khoảng 60,312 kDa (Tatsumi, 1992) Chính vậy, trình tự gen thu nghiên cứu hoàn toàn phù hợp cho việc nghiên cứu sản xuất enzyme luciferase bẳng phương pháp tái tổ hợp
4 KẾT LUẬN
Đã nhân thành cơng đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase, đoạn gen có kích thước khoảng 1,6 kb từ đom đóm Việt Nam phương pháp RT-PCR Đồng thời
nhân dịng thành cơng đoạn gen nàyvào vector pGEM T
Trình tự đoạn gen mã hóa cho luciferase từ đom đóm Việt Nam tương đồng 100%
so với trình tự gen luciferase đã công bố ngân hàng gen giới (X66919.1),
trình tự khơng có vị trí cắt enzyme giới hạn HindIII, BamHI, NdeI, XhoI thiết kế thêm trình tự nhận biết hai enzyme giới hạn NdeI vào
đầu 5’ XhoI vào đầu 3’
(7)Lời cảm ơn: Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí từ đề tài: "Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học phân tử để tách dịng gen mã hóa enzyme luciferase"
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1].Trần Linh Phước cộng sự, “Tạo dòng sản xuất luciferase tái tổ hợp dùng cho phản
ứng phát sáng sinh học invitro”, Tạp chí Phát triển khoa học công nghệ, Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh (2002), tập 5, số
[2].Phạm Hồ Trương cộng sự, “Nghiên cứu sản xuất Kit vi sinh xác định Arsen
máy đo huỳnh quang ABOATOX 1253”, đề tài cấp Trung tâm KHKT&CNQS (2006)
[3].Ngô Ngọc Trung, “Nghiên cứu khả chế tạo thuốc thử phát nhanh đột biến
số lượng vi sinh vật độc hại mẫu thực phẩm”, để tài Viện Hóa học-Vật liệu (2012) [4].Emamzadeh AR, Hosseinkhani S, Sadeghizadeh M, Nikkhah M, Chaichi MJ, Mortazavi M., “cDNA cloning, expression and homology modeling of a luciferase from the firefly Lampyroidea maculata”, J Biochem Mol Biol. (2006 Sep) 30;39(5):578-85
[5].Frundzhyan V & Ugarova N., “Bioluminescent assay of total bacterial contamination
of drinking water”, Luminescence (2007), 22(3); 241-244
[6].Lyons S.K., Meuwissen R., Krimpenfort P., Berns A., “The generation of a conditional
reporter that enables bioluminescence imaging of Cre/loxP-dependent tumorigenesis in
mice”, Cancer Res. (2003 Nov) 63 (21): 7042–6
[7].Miller J N., Nawawi, M B & Burgess C , “Detection of bacterial ATP by reversed
flow-injection analysis with luminescence detection”, Anal.Che Acta (1992), 266, 339
[8].Tasumi H., Kajiyama M., Nakano E., “Molecular cloning and expression in
Escherichia coli of a cDNA clone encoding luciferase of a firefly, Luiciola lateralis”,
Biochim Biophys Acta (1992 Jun) 15;1131(2):161-5
[9].Tatsumi H1, Masuda T, Kajiyama N, Nakano E, “Luciferase cDNA from Japanese firefly Luciola cruciata: cloning, structure and expession in E.coli”, J Biolumin
Chemilumin. (1989 Apr-Jun);3(2):75-8
ABSTRACT
Research application of molecular biotechnology to clone the luciferase coding gene
In this research, by RT-PCR method and molecular biology techniques, the luciferase complete coding sequence from firefly in Viet Nam was cloned and characterized The cDNA was transformed into the E coli and sequenced The result showed: the gene fragment size about 1.6 kb and has a sequence shares 100% identity with the sequence that was published on GenBank (X66919.1) There is no recognition site of restriction enzymes as HinIII, Bam HI, NdeI, XhoI, on this gene So we designed additional recognition sites for NdeI at the 5' end and for HindIII at the 3' end of the luciferase coding sequence, that is important basic to express and produce recombinant luciferase protein
Keywords: Luciferase, Firefly, Cloned luciferase.
Nhận ngày 22 tháng 10 năm 2015 Hoàn thiện ngày 17 tháng 12 năm 2015 Chấp nhận đăng ngày 22 tháng 02 năm 2016