Chính vì thế mà các nhà chuyên môn trên thế giới khuyến cáo hạn chế sử dụng hóa chất khi nuôi tôm, đồng thời khuyến khích nên ứng dụng công nghệ sinh học và sử dụng chế phẩm sinh học để
TOÅNG QUAN
Enzyme protease
2.1.1 Sơ lược về lịch sử
Các enzyme protease xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid trong các peptid hoặc các protein theo phản ứng sau:
H-N-CH-C-N-CH-C-OH + H2O → H-N-CH-C-OH + H-N-CH-C-OH H R O H R’ O H R O H R’ O
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả Từ thế kỷ thứ 18 nhà tự nhiên học người Pháp (Reomur) đã làm thí nghiệm rất thông minh, đơn giản và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt Năm 1836, Schwann đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị Tuy nhiên mãi hơn 30 năm sau mới tách được các enzyme này Năm 1857, Corvisart tách được tripsin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm
Các protease thực vật được phát hiện muộn hơn Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận được protease từ hạt của một loại đậu
Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dầu từ năm 1918, 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu của protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực vật Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế Trong thời gian gần đây, người ta cũng đã có được những phương pháp thích hợp để nhận các chế phẩm không tan của protease Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong nghiên cứu và ứng dụng các protease
Theo Hartley (1960), protease vi sinh vật được phân loại thành 4 nhóm dựa trên cơ chế phản ứng và pH hoạt động tối ưu: protease serine, protease thiol, protease kim loại và protease axit.
2.1.2 Nguồn enzyme protease từ vi sinh vật
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease mạnh mẽ, trong đó bao gồm cả protease ngoại bào và protease nội bào Tuy nhiên, protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ lưỡng hơn so với protease nội bào.
Các protease ngoại bào được sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và y tế.
2.1.2.2 Các yếu tố hóa lý ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật:
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm, nhiệt độ, pH, độ thông khí, thành phần môi trường v.v…
▪ Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp Đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp
▪ Ảnh hưởng của pH môi trường:
Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật và hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề sâu, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn, đôi khi có vai trò quyết định đối với sự tích lũy protease trong môi trường (Lê Ngọc Tú, 1982) pH môi trường để nuôi vi khuẩn
Bacillus subtilis nhằm tổng hợp protease là 7,0 – 7,8
▪ Độ thông khí: Độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp protease Tuy nhiên ảnh hưởng này sẽù khác nhau tùy theo vi sinh vật Trong một số trường hợp, thiếu oxy tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease (Aleeva, 1973)
▪ Ảnh hưởng thành phần môi trường:
Thành phần môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Trên cùng một môi trường nuôi cấy giống nhau, khả năng sinh tổng hợp protease của các vi sinh vật khác nhau là rất khác nhau Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp, chọn tỷ lệ nồng độ thích hợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng các chất cảm ứng
Các mono và disaccharit thường được dùng làm nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp protease Theo Ortrosko và tập thể (1977) thì glucose, saccharose, maltose, fructose, sorbit là nguồn carbon tốt nhất cho quá trình tổng hợp protease ở Bacillus subtilis var amyloliquefaciens 759
Trong số monosaccharit, glucose ảnh hưởng rất khác nhau đến quá trình sinh tổng hợp enzyme nói chung cũng như sinh tổng hợp protease Trong nhiều trường hợp nó làm giảm rõ rệt lượng enzyme được tổng hợp Ví dụ đối với
Pseudomonas myxogenus, quá trình sinh tổng hợp protease tăng lên khi tăng nồng độ glucose trong môi trường từ 1 đến 10% Ngược lại, đối với B megaterium, glucose lại làm giảm sự tích lũy protease trong môi trường nuôi cấy
Nguồn nitơ hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này Đối với vi khuẩn, để tăng lượng protease trong môi trường cần sử dụng phối hợp nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ Nguồn nitơ vô cơ tốt nhất cho vi khuẩn thường là (NH4)2HPO4 Các nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là: pepton, casein, albumin bột đậu nành v.v… Đối với mỗi một vi sinh vật, khả năng sinh tổng hợp protease thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào môi trường Hơn nữa môi trường cũng ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ giữa các dạng protease được tổng hợp và tính chất của chúng
▪ Thời gian nuôi cấy: Ở nhiều loài thuộc Bacillus sự tích lũy protease trong môi trường đạt cực đại vào cuối pha chỉ số (log pha) của quá trình sinh trưởng vi sinh vật
Enzyme amylase
Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814 Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học Nga – Viện sĩ K S Kirhof Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường
Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Cho mãi tới thời gian gần đây người ta vẫn còn thu amylase từ malt Ngày nay, người ta thu chúng chủ yếu từ canh trường vi khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men
Theo tính chất và phương pháp tác dụng lên tinh bột người ta phân biệt - amylase, β - amylase, gluco - amylase ( - amylase), oligo – 1,6 – glucoxydase (dextrinase)…
2.2.2 Vi sinh vật tạo amylase
Các vi sinh vật được sử dụng để sản xuất amylase phổ biến nhất là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn, trong khi xạ khuẩn ít được sử dụng hơn Trong số các loại nấm mốc, thường sử dụng các giống Aspergillus và Rhizopus Ngoài ra, các loài nấm men thuộc chi Candida, Saccharomyces, Endomycopsis và Endomyces cũng có khả năng sản xuất amylase (Gratrova, 1975; Conovalov, 1972; Fukumoto, 1962; Hattori, 1961).
Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo một lượng lớn amylase như Bacillus subtilis, B mesentericus, B macecassavanum, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas saccharophila v.v… Các vi khuẩn ưa nhiệt (ưa ấm) có khả năng sinh trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác
Trong số vi khuẩn ưa ẩm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất Riêng ở Nhật, hàng năm nguời ta sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ẩm và hiếu khí này Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 37°C
2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của - amylase
- amylase có khả năng phân cắt các liên kết - 1,4 glucosid nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và poliose đồng loại) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả Khi tác dụng lên tinh bột enzyme này giải phóng ra glucose ở dạng - mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là - amylase
- amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột còn nguyên, song với tốc độ rất chậm Dưới tác dụng của - amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp
Tuy nhiên thông thường - amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với iod và một ít maltose
- amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng
Protein của các - amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globulin - amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác
- amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn - amylase vi khuẩn lại có khả năng phân hủy cả các hạt tinh còn nguyên lẫn hồ tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971) Chế phẩm amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với - amylase cuûa naám moác (Lixiuk, Popadicts, 1969) Ở Đức đã tuyển chọn được một chủng Bacillus subtilis mà amylase của nó không khác gì amylase của vi khuẩn thông thường về đặc tính tác dụng lên tinh bột, song lại có độ bền nhiệt như amylase của nấm mốc (Sprister, Unlig, 1972) Tính chất - amylase của chủng bền nhiệt này cũng đặc trưng cho
Bacillus subtilis: pH tối thích = 6,0; bị vô hoạt hoàn toàn ở pH = 4,0 và bị vô hoạt một nửa ở pH = 8,0
2.2.4 Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật
Quá trình nuôi vi sinh vật tạo amylase gồm hai giai đoạn chính: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme Giai đoạn đầu tập trung vào tăng trưởng và sinh sôi của vi sinh vật, tạo ra lượng lớn tế bào vi sinh Giai đoạn tiếp theo liên quan đến việc sản xuất và tích trữ enzyme amylase, có thể diễn ra trong tế bào hoặc được giải phóng ra môi trường nuôi cấy.
Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “trẻ” đều không tìm thấy amylase Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân (autolysis)
Nuôi vi sinh vật tạo amylase bằng phương pháp bề sâu:
▪ Môi trường dinh dưỡng: Ở Anh, Pháp, Đan Mạch, Nhật Bản người ta dùng Bacillus subtilis với tư cách là vi sinh vật tạo amylase chủ yếu Cấu tử chính của môi trường nuôi
Bacillus subtilis là bột ngô Ngoài ra còn có các chất hiệp trợ khác như K2SO4, lactose, NaCl và MgSO4
▪ Chế độ nuôi: pH môi trường để nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm thu - amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5
Bacillus subtilis sinh trưởng thích hợp nhất và tạo nhiều - amylase ở nhiệt độ 37°C
Người ta nuôi Bacillus subtilis trong thùng nhân giống (15 giờ ở nhiệt độ 37°C) có cánh khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng vào môi trường với lưu lượng là 40 m 3 /m 3 môi trường/giờ Còn nuôi vi khuẩn này trong thùng lên men sản xuất (trong 48 giờ ở 37°C) có cánh khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng với lượng 60 m 3 /m 3 môi trường/giờ
Thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis trong thùng nhân giống là 15 giờ, trong khi thời gian nuôi cấy trong thùng sản xuất kéo dài tới 48 giờ Tỷ lệ giống sử dụng trong quá trình sản xuất là 10% so với thể tích môi trường dinh dưỡng (theo nghiên cứu của Lê Ngọc Tú, 1982).
2.2.5 Ứng dụng amylase vi sinh vật:
Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp rượu bia (thay thế một phần mầm đại mạch), công nghiệp nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hóa tinh bột, công nghiệp bánh mì (nâng cao chất lượng bánh), công nghiệp chế biến rau quả, bổ sung vào khẩu phần chăn nuôi.
Đại cương vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức Lúc đầu chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lỵ của các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc ứng dụng điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 – 1950 khi Henry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Từ đó, “Subtilistherapie” có nghĩa là thuốc Subtilis ra đời trị các chứng viêm ruột, đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa Ngày nay vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, trong chăn nuôi, thực phẩm…(Lorie Kramer, 2004; Lê Văn Hiệp, 2004)
Bacillus subtilis là vi khuẩn thuộc bộ Eubacteriales, họ Bacillaceae, giống Bacillus, loài Bacillus subtilis (Tô Minh Châu, 2001)
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, gram dương, hiếu khí, kớch thước 3 - 5 x 0,6 àm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động cú 8 – 12 lông, sinh bào tử nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, không làm phình tế bào, kớch thước bào tử 0,9 – 0,6 àm Phỏt triển bằng cỏch nảy chồi do sự nứt của bào tử Cấu trúc kháng nguyên: có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và dạng L- acid glutamic
2.3.3 Sự hình thành bào tử
Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tạo bào tử khi trải qua giai đoạn phát triển mạnh và hết dinh dưỡng Mỗi tế bào chỉ tạo ra một bào tử, và khi bào tử trưởng thành, tế bào mẹ sẽ tự phân hủy để giải phóng bào tử Trong trạng thái bào tử, vi khuẩn ngừng trao đổi chất và có thể tồn tại nhiều năm Bào tử có sức chịu đựng cao trước nhiệt độ, độ ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ và các chất độc hại.
▪ Sự phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis:
Phần lớn vi khuẩn Bacillus subtilis cư trú trong đất Một số sống hoại sinh tiết ra enzyme thủy phân tinh bột, protein Thông thường, đất trồng trọt chứa khoảng 10 –100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang vi khuẩn
Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn cửa sông có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis Bacillus subtilis còn có mặt ở đại dương (Vũ Thị Thứ, 1996)
▪ Bacillus subtilis kết hợp với thực vật:
Vi khuẩn Bacillus subtilis giúp cho thực vật phòng và chống các bệnh nấm nhờ khả năng tiết các chất kháng sinh chống nấm Vi khuẩn này thường tìm thấy trong thực phẩm, rau, hoa quả Một số loài cư trú ở cây lương thực, đặc biệt, lương thực dạng hạt
Theo De Beer và Diderichsen đã khẳng định không có trường hợp nào bị nhiễm trùng khi sử dụng Bacillus subtilis
Bacillus subtilis có khả năng sử dụng các chất vô cơ cho sự sinh trưởng
Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nghiêm ngặt nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy, sinh aceton và 2,3_butanediol từ pyruvat bằng con đường acetolactat Chúng cũng có thể hoàn nguyên NAD + từ phản ứng acetoin thành butanediol Đến nay, vẫn chưa giải thích lý do tại sao chúng không phát triển mạnh trong điều kiện kỵ khí như Bacillus cereus hoặc Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis tiết enzyme ngoại bào chịu trách nhiệm chuyển hóa các hợp chất cao phân tử trong môi trường (những chất không thể chuyển vào tế bào vì quá lớn) thành các chất có trọng lượng phân tử thấp làm nguồn carbon và năng lượng Bacillus subtilis có khả năng thủy phân tinh bột nhờ hoạt động của
_amylase, phân hủy protein nhờ protease và thủy phân polisacarit nhờ β_glucanase
▪ Với vi sinh vật gây bệnh:
Mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi tức là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của
Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm vị ức chế
▪ Với đồng loại: Đầu năm nay, giáo sư Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston (Mỹ) và Jose Gonzalez-Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Mairid (Tây Ban Nha) đã thí nghiệm trên những tập đoàn khuẩn Bacillus subtilis bị bỏ đói, bằng cách rút bớt chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy
Thông thường, khi dưỡng chất bắt đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang trạng thái “ngủ đông”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra một bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỷ nếu cần thieát
Tuy nhiên, trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus subtilis đã tạo ra chất kháng sinh giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào của tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng, và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ
Lý giải cho hiện tượng này, các nhà nghiên cứu trên cho rằng quá trình tạo bào tử thường tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vài giờ và một khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược Chính vì thế vi khuẩn sẽ cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt Trong tình huống xấu nhất, khi dinh dưỡng trong môi trường đã kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những kẻ xung quanh (bất chấp đó có phải là anh em ruột hay không) hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kỳ chờ đợi này, cho đến khi buộc phải chuyển sang sống tiềm sinh
▪ Thuốc trị tiêu chảy sinh học và dược phẩm:
Năm 1949 tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa toàn vi khuẩn
Bacillus subtilis chủng IP 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng ống và viên nang Năm 1962, Guy Albot còn phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn Trộn thêm với các vi khuẩn lên men lactic khác, Bacillus subtilis chữa loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả
Từ năm 1952, Bs Phạm Ngọc Thạch đã sử dụng chủng Bacillus subtilis của Bs thú y Trần Văn Du phân lập để điều trị tiêu chảy, kiết lỵ thậm chí để chữa các vết thương chiến tranh và lao phổi (1959), lao màng não trẻ em Sau đó
Bacillus subtilis được dùng rộng rãi trong phạm vi cả nước Từ 1983 đến nay
Ứng dụng Bacillus subtilis trong ngành nuôi tôm
2.4.1 Tình hình nuôi tôm của các nước trên thế giới và Việt Nam
Khoảng 50 quốc gia trên thế giới có ít nhiều khả năng sản xuất tôm
Những nước có tiềm năng sản xuất với số lượng quan trọng hơn cả là:
Tại các quốc gia Đông bán cầu, nhất là các nước tại Á Châu tổng sản lượng tôm nuôi chiếm tới 80% toàn thế giới Đó là các nước Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan, Ấn Độ, Philipine, Đài Loan, Việt Nam, Bangladesh, Nhật Bản
Tại các quốc gia Tây bán cầu sản xuất 20% số tôm nuôi còn lại 99% sản lượng này phát xuất từ Châu Mỹ La Tinh, đứng đầu là Ecuador chiếm tới 71%, sau đó là Colombia rồi Mexico, tiếp theo là Honduras, Peru, Panama, Brazil và Guatemala
Nhu cầu thị trường đối với tôm nuôi vẫn không ngừng tăng trong thời gian qua làm cho con tôm có một giá cả hấp dẫn và ngành công nghiệp nuôi tôm có được đầu ra ổn định Nuôi tôm công nghiệp có thể đạt lợi nhuận từ 50 – 80% tổng doanh thu (Lin, 1995) Lợi nhuận hấp dẫn và giá trị xuất khẩu cao của tôm nuôi đã tác động đến chính sách phát triển của một số nước nuôi tôm Năm 1998, Bangladesh đã chọn nuôi tôm sú xuất khẩu là quốc sách Chính phủ Ấn Độ đã có những chính sách khuyến khích phát triển nghề nuôi tôm như: hỗ trợ vốn vay, phát triển dịch vụ kỹ thuật, giảm thuế nhập khẩu đối với các nguyên liệu, máy móc phục vụ nuôi tôm… Với các chính sách hỗ trợ này đã làm cho nghề nuôi tôm được mở rộng, giá thành sản xuất tôm thấp hơn các nước cạnh tranh raát nhieàu (CP Group, 1998)
Theo tạp chí World Shrimp Farming, sản lượng tôm của Việt Nam vào năm 1991 đạt 30.000 tấn/năm, tương đương với Philippines Lúc đó, Việt Nam có 120 trại dưỡng ngư và 1000 trại nuôi tôm Các giống tôm nuôi phổ biến ở Việt Nam bao gồm Penaeus monodon, P merguiensis, P indicus với năng suất trung bình 188 kg/ha.
▪ Những thuận lợi cho sự phát triển ngành nuôi tôm ở Việt Nam:
− Việt Nam có bờ biển rất dài, dài hơn bờ biển Thái Lan khá nhiều (Thái Lan có khoảng 2400 km bờ biển, theo tài liệu của công ty CP)
− Sông ngòi ao hồ tại Việt Nam thì vô lượng Riêng tại vùng Cà Mau đã có hơn 150000 ha rừng bần, đặc biệt thích hợp cho việc nuôi tôm
Ruộng lúa cho phép nuôi chung với tôm nước ngọt quanh năm hoặc chỉ một giai đoạn khi cấy quanh năm Nếu chỉ cấy một vụ và vụ còn lại ruộng bị ngập nước mặn, người nông dân có thể nuôi các loại tôm họ Penaeus spp như tôm sú, tôm thẻ, tôm bạc (Penaeus monodon, P merguiensis, P vannamei…)
− Tại Cần Thơ đã sản xuất được thức ăn gọi là Artemia rất thích hợp cho tôm trong giai đoạn ấu trùng, vì kích thước của Artemia do Cần Thơ sản xuất nhỏ hơn nhiều nơi khác trên thế giới
− Kỹ nghệ tôm đông lạnh thì Việt Nam đã có từ lâu, nhân công đã quen thuộc với nghề này Các nhà máy đã xuất hiện ở nhiều nơi
− Nhân công ở Việt Nam rất rẻ so với các nước Đông Nam Á khác
− Các chuyên viên ngư nghiệp ở Việt Nam cả ở trong lẫn ngoài nước thì dư thừa cho phát triển ngành này
2.4.2 Vấn đề dịch bệnh ở tôm
Công nghệ nuôi tôm ở các nước tuy phát triển rất mạnh nhưng phải đối phó với vấn đề dịch bệnh và sự suy thoái môi trường Kết quả đã đưa đến nhiều thiệt hại lớn cho người nuôi Ở Trung Quốc sản lượng tôm nuôi giảm rất mạnh khoảng 120000 tấn/năm (1993), trong khi đó ở Đài Loan sản lượng tôm liên tục giảm từ đỉnh cao 88000 tấn/năm (1987) còn 12000 tấn/năm (1993) Trong khoảng thời gian từ 1993 – 1995 sản lượng tôm ở Indonesia và Philipine giảm khoảng 48 và 58% Hiện nay tơm nuơi (chủ yếu là tơm sú) ở nước ta thường bị mắc một số bệnh nguy hiểm dẫn đến tôm bị chết nhanh và dịch lây lan trên diện rộng gây tổn thất Sau đây là các bệnh thường gặp (theo giáo trình bệnh thủy sản):
▪ Bệnh đốm trắng do virus gây ra (WSBV: White spot symdrome Baculovirus)
Tôm mắc bệnh này thường chết hàng loạt và là loại bệnh thường gặp ở tôm nuôi không chỉ ở nước ta mà còn ở nhiều nước nuôi tôm trên thế giới Thí dụ, các năm 1999 - 2000 bệnh đốm trắng lan tràn khắp các nước nuôi tôm chân trắng (P vanmamei) ở Trung Mỹ và Nam Mỹ gây tổn thất ước tính trên 100 nghìn tấn tôm thương phẩm Riêng Ecuađo bò tổn thất khoảng 70% tôm nuôi (ước tính thiệt hại 500 - 600 triệu USD).
Các dấu hiệu đặc trưng của bệnh là sự xuất hiện của các đốm trắng kích thước 0,5 - 2mm dưới vỏ tôm Tôm chuyển màu thành đỏ hoặc hồng, mang bị bẩn Bệnh nhân có biểu hiện bỏ ăn và bơi gần mặt nước Tỷ lệ tử vong có thể lên tới 100% chỉ sau 3 - 7 ngày khi xuất hiện các đốm trắng.
Bệnh do virus đốm trắng gây nên, virus này là loại ADN-virus có vỏ bọc và gây ra hiện tượng trương nhân trong tế bào Bệnh có thể lây qua sự ăn thịt đồng loại, từ các động vật mang bệnh trung gian hoặc do nước bị nhiễm virus Bệnh đốm trắng có thể gây chết cho tôm ngay khi lượng virus trong cơ thể tôm đủ mạnh mà không cần đến việc tôm bị sốc do môi trường.
▪ Bệnh đầu vàng (YHD: Yellow head disease) do virus gây ra:
Là bệnh nguy hiểm cho tôm nuôi ở nước ta và nhiều quốc gia nuôi tôm khác
Bệnh gây tổn thất ở bộ phận gan tuỵ của tôm, tổ chức gan tuỵ có màu vàng, thân và thịt có mầu đỏ Bệnh thường xuất hiện khi tôm được 40 - 70 ngày tuổi Thời gian ủ bệnh ngắn Tôm ăn nhiều hơn mức bình thường Bệnh thường xảy ra ở các ao có điều kiện môi trường xấu và khi nuôi với mật độ dầy Có rất nhiều dòng virus trong nhóm virus đầu vàng, nhưng chỉ có vài dòng là gây ra các bệnh nguy hiểm cho tôm
Sự lây lan bệnh từ các con tôm trong ao đầm hoặc từ nước hay các dụng cụ khác
Đối với tôm giống, các chủng Vibrio gây bệnh phổ biến bao gồm V harveyi (nghiêm trọng nhất), tiếp theo là V vulnificus, V parahaemolyticus và Vibrio sp Trong giai đoạn nuôi tôm thương phẩm, các chủng gây bệnh thường gặp là V parahaemolyticus (nghiêm trọng nhất), tiếp theo là V alginolyticus, V harveyi, V vulnificus và Vibrio sp.
Tôm thường bị các bệnh do vi khuẩn gây ra là: bệnh đen mang, bệnh phát sáng và một số bệnh khác
Việc trị bệnh bằng sử dụng kháng sinh qua đường thức ăn chỉ có hiệu quả ở giai đoạn đầu của sự nhiễm bệnh khi tôm vẫn còn có dấu hiệu thèm ăn Ở các giai đoạn muộn hơn khi tôm đãngừng ăn thì việc dùng thuốc qua thức ăn hết tác dụng.
Khi tôm bị bệnh do vi khuẩn thấy tôm chết nhiều và tôm ít ăn thì cần thu hoạch ngay Sự chậm chạp trong khâu thu hoạch sẽ dẫn đến thiệt hại lớn.
Ngoài 3 bệnh nguy hiểm thường gặp nêu trên, tôm nuôi còn bị các bệnh khác như: bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh đóng rong, triệu chứng mất vỏ tôm, triệu chứng tôm chậm lớn…
❖ Một số khuyến nghị chung để ph òng tránh cá c bệnh n êu trên là:
− Cần xây dựng kế hoạch nuôi tôm để tôm được thả vào lúc thời tiết thuận lợi và ổn định nhất.
− Chỉ chọn những tôm giống khoẻ để thả, kiên quyết loại bỏ những con giống yếu.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm
❑ Thời gian thực hiện đề tài: từ 10/3/2004 đến 10/9/2004
❑ Địa điểm thực hiện đề tài: phòng thực hành Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi- Thú y, Trường Đại Học Nông Lâm, Tp HCM.
Vật liệu nghiên cứu
Chủng Bacillus subtilis của khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học
▪ Môi trường nuôi cấy tổng hợp:
− Môi trường giữ giống, đếm số lượng tế bào: TSA (Trypticase Soya Agar), NA (Nutrient Agar)
− Môi trường khảo sát đặc điểm sinh học: TSB (Trypticase Soya Broth), Clark Lubs, Simmons Citrate Agar, BA (Blood Agar), Starch Agar, Gelatin, thạch bán lỏng, môi trường lên men các loại đường, …
− Môi trường khảo sát khả năng nhạy cảm kháng sinh: NB (Nutrient Broth)
Các môi trường được vô trùng ở điều kiện thích hợp
(Thành phần các môi trường được trình bày ở phần phụ lục)
Môi trường nuôi cấy tối ưu cho quá trình sản xuất protease và amylase bao gồm canh bột đậu nành cung cấp nguồn nitơ và carbon, sữa loại béo cung cấp nguồn lipid, môi trường NB bổ sung bột đậu nành, cám gạo và bột gạo cung cấp nguồn dinh dưỡng bổ sung cho sự phát triển của vi sinh vật sản xuất enzyme.
Các môi trường được vô trùng ở điều kiện thích hợp
(Thành phần các môi trường được trình bày ở phần phụ lục)
− Hóa chất cơ bản: H2O, cồn 70°, NaOH 1N, HCl 1%, NaCl, …
− Hóa chất dùng khảo sát đặc tính sinh học: dầu soi kính, xylen, NaOH 40%, -naphton 10% trong coàn, HgCl2, HCl, H2O2,, …
− Hóa chất dùng thử hoạt độ enzyme: dung dịch casein, dung dịch acid acetic_ethanol, dung dịch NaCl 1%, dung dịch tinh bột 1‰, dung dịch iod 0,02N, …
− Kháng sinh: ampicilin, gentamycin, penicilin, tetracylin
3.2.4 Thieỏt bũ, duùng cuù thớ nghieọm
Tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), khay nhựa, cân điện tử, máy vortex, máy lắc ngang, bếp chưng cách thủy, tủ lạnh, kính hiển vi, máy đo pH, …
▪ Duùng cuù: Đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, bình tam giác 500 ml, ống đong, đũa khuấy thủy tinh, que cấy, que trang, pippetman, đèn cồn, lame, lamelle, …
Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải được xử lý, bao gói và sấy khô ở 170 0 C/120 phút.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis
3.3.1.1 Quan sát đặc điểm hình thái của B subtilis:
Vi khuẩn B subtilis được nuôi trong môi trường thạch nghiêng TSA sau 24 giờ, đem nhuộm Gram và xem dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần (xem phương pháp nhuộm Gram ở phần phụ lục)
3.3.1.2 Quan sát đặc điểm khóm của B subtilis:
Môi trường NA đã được hấp tiệt trùng phân phối 15ml vào đĩa petri vô trùng rồi để nguội Hòa vi khuẩn vào nước muối sinh lý rồi lấy một ít chan lên môi trường để tạo khuẩn lạc đơn của vi khuẩn B subtilis Sau đó gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ 37°C/ 24 giờ
3.3.1.3 Quan sát đặc điểm nuôi cấy của B subtilis trong môi trường canh:
Môi trường TSB được hấp tiệt trùng sau khi phân phối 4 – 5 ml vào ống nghiệm vô trùng Sau đó, tiến hành cấy giống vi khuẩn B subtilis vào môi trường TSB đã chuẩn bị Cuối cùng, ống nghiệm được ủ trong điều kiện nhiệt độ 37°C trong thời gian 48 giờ.
❖ Khả năng phân giải protein:
▪ Khả năng phân giải casein:
Một số vi sinh vật có enzyme caseinase, do đó có thể phân giải casein thành các acid amin Xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn này (khi cấy vi khuẩn trên môi trường casein) sẽ hình thành các vòng phân giải trong suoát
Cấy vi khuẩn B subtilis thành các khóm nhỏ trên môi trường thạch đĩa casein Nuôi ở nhiệt độ 37°C/48 giờ Đọc kết quả bằng cách quan sát vòng phân giải trong suốt xung quanh khóm
▪ Khả năng phân giải gelatin:
Một số vi sinh vật có thể tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác sự thủy phân của gelatin thành polypeptide và acid amin Để nhận biết khả năng làm tan gelatin của vi sinh vật, sau khi cấy và nuôi vi khuẩn vài ngày dùng thuốc thử nhỏ lên bề mặt môi trường, thuốc thử sẽ làm kết tủa phần gelatin chưa bị phân giải Nếu vi sinh vật có khả năng tiết gelatinase sẽ tạo vòng phân giải gelatin trong suốt
Môi trường sử dụng là môi trường dinh dưỡng chứa gelatin (Nutrient Gelatin Agar) đã được hấp tiệt trùng phân phối 15ml vào các đĩa petri vô trùng Sau khi để cho bề mặt môi trường ráo nước, tiến hành cấy vi khuẩn B subtilis thành khóm nhỏ lên môi trường, ủ trong tủ ấm ở 37°C/48 giờ Đọc kết quả bằng cách nhỏ thuốc thử HgCl+HCl+H2O trực tiếp lên bề mặt môi trường,quan sát vòng phân giải
▪ Khả năng làm dung huyết:
Một số vi sinh vật có enzyme hemolysine có khả năng phá hủy hồng cầu, làm cho chúng không còn màu đỏ Trên môi trường thạch máu, nếu vi sinh vật được nuôi cấy có enzyme hemolysine, enzyme này sẽ khuyếch tán ra môi trường xung quanh khuẩn lạc, phá hủy hồng cầu và tạo nên một vòng không có màu đỏ xung quanh khuẩn lạc
Cho 15 ml môi trường thạch máu BA (Blood Agar) đã hấp tiệt trùng vào đĩa petri vô trùng Kiểm tra vô trùng trước khi cấy sinh khối vi khuẩn B subtilis thành khóm nhỏ trên môi trường Ủ 37°C/24 giờ
Quan sát vòng phân giải
❖ Khả năng phân giải tinh bột:
Một số vi sinh vật có các enzyme amylase có khả năng phân giải tinh bột thành đường để sử dụng làm nguồn thức ăn hay năng lượng Bình thường, khi cho dung dịch Iod tác động lên tinh bột sẽ thấy xuất hiện màu xanh Trong trường hợp chúng ra nhỏ dung dịch iod vào môi trường có chứa tinh bột đã nuôi cấy vi sinh vật mà không thấy xuất hiện màu xanh nữa, có nghĩa là tinh bột đã bị phân giải bởi enzyme amylase được sinh ra bởi vi sinh vật
Dùng que cấy lấy một ít sinh khối vi khuẩn B subtilis cấy thành khóm nhỏ lên môi trường Starch Agar, ủ ở 37°C/48 giờ Khi đọc kết quả dùng iod nhỏ lên mặt môi trường để quan sát đường kính vòng phân giải tinh bột
❖ Đặc tính sinh hóa khác:
Phương pháp thử trên phiến kính: dùng pipet pasteur lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc vi khuẩn B subtilis đặt lên một phiến kính sạch
Nhỏ một giọt H2O2 lên sinh khối vi khuẩn trên phiến kính Ghi nhận sự sủi bọt nếu có
▪ Thử nghiệm khả năng lên men:
Môi trường đường để thử nghiệm được phân phối khoảng 4- 5 ml vào các ống nghiệm vô trùng có chứa ống Durham rồi đem hấp tiệt trùng Sau khi làm nguội tiến hành cấy vi khuẩn B subtilis rồi ủ
▪ Thử nghiệm khả năng sinh indol:
Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường TSB
Cấy một ít vi khuẩn B subtilis vào ống môi trường, ủ ở nhiệt độ
37°C/24 giờ Khi đọc kết quả dùng ống nhỏ giọt sạch, nhỏ vào ống nghiệm vi khuẩn vài giọt thuốc thử Kowac’s
▪ Thử nghiệm MR (Methyl red):
Thử nghiệm được thực hiện trong môi trường Clark-Lubs, có 1% đường glucose Dùng que cấy vòng cấy một ít vi khuẩn B subtilis cho vào môi trường, ủ ở 37°C/24 giờ Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc ngay kết quả
▪ Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer):
Môi trường sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs Dùng que cấy vòng cấy một ít vi khuẩn B subtilis cho vào môi trường, ủ ở 37°C/24 giờ Sau khi ủ dùng ống nhỏ giọt sạch, nhỏ vào ống nghiệm vi khuẩn 0,5ml dung dịch NaOH 40%, có thể hơ nóng nhẹ, hoặc để ở nhiệt độ phòng 10 phút Dùng một ống nhỏ giọt khác, nhỏ 1ml dung dịch -naphtol 10% trong cồn Lắc đều, đọc kết quả
▪ Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate:
Môi trường thạch SCA (Simmons Citrate Agar) được nấu tan phân phối vào các ống nghiệm vô trùng rồi đem hấp tiệt trùng Sau đó để nghiêng và chờ nguội Dùng que cấy tròn lấy một ít sinh khối vi khuẩn B subtilis rồi cấy ziczắc trên môi trường thạch nghiêng SCA, ủ 37°C/48 Đọc kết quả
▪ Thử nghiệm nitratase (khử nitrate):
