Chương 3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM MỤC TIÊU Trình bày được khái niệm chung về phương pháp tách, sắc ký Trình bày được các pp định lượng bằng HPLC PP chuẩn ngoại, chuẩn.
Chương MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HỐ LÝ DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM MỤC TIÊU - Trình bày khái niệm chung phương pháp tách, sắc ký - Trình bày pp định lượng HPLC: PP chuẩn ngoại, chuẩn nội - Trình bày nguyên lý phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS ứng dụng để định tính, định lượng CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH 1.1 Khái niệm Các phương pháp tách nhóm phương pháp vật lý, hố học, hoá lý nhằm tách hỗn hợp phức tạp gồm nhiều chất thành hỗn hợp đơn giản từ tách riêng chất Tuỳ theo hỗn hợp cần tách đồng hay không đồng mà lựa chọn phương pháp tách thích hợp 1.2 Các phương pháp tách thường dùng 1.2.1 Phương pháp lọc Pp đơn giản, hiệu để tách pha rắn khỏi pha lỏng - Kỹ thuật lọc: Có thể lọc áp suất thường lọc áp suất giảm Vật liệu thường dùng giấy, thuỷ tinh, phễu lọc thuỷ tinh xốp, 1.2.2 Phương pháp ly tâm Là phương pháp dùng lực ly tâm để làm lắng kết tủa xuống Tốc độ lắng phụ thuộc vào lực ly tâm 1.2.3 Phương pháp chia cắt pha - Có thể thực cách: chọn lọc học (dựa vào hình dáng, kích thước, màu sắc, để tách chất), 1.2.4 Phương pháp chiết tách lấy chất (hay nhóm chất) từ hỗn hợp nghiên cứu dung môi A Cơ sở phương pháp dựa phân bố chất tan pha A B khơng hồ lẫn vào Đại lượng đặc trưng hệ số phân bố Kp Trong đó: CB: nồng độ chất tan dung môi B; CA: nồng độ chất tan dung mơi A Kp số lỏng - lỏng chiết lỏng - rắn 1.2.4.1 Chiết lỏng - lỏng Có cách: - Chiết đơn: Chiết lần, phịng thí nghiệm chiết bình gạn, lắc tay máy Hiệu suất chiết thấp - Chiết lặp (chiết nhiều lần): Sau lần chiết 1, dung dịch chất tan, thêm dung môi chiết tiếp.Nếu lượng dung mơi ta chiết nhiều lần tốt chiết lần Chiết nhiều lần tốn thời gian, thường chọn tối ưu lần - Chiết ngược dịng: Cho dung mơi dung dịch cần chiết ngược chiều nhau, hai pha tiếp xúc chặt chẽ, pha trộn di chuyển ngược chiều Đây trình liên tục Trong kiểm nghiệm chiết lỏng - lỏng ứng dụng nhiều thường dùng pha nước pha dung môi hữu 1.2.4.2 Chiết lỏng - rắn Thường có cách: - Dùng pha rắn (như Al2O3, nhôm silicat, than, ) để chiết lấy chất từ pha lỏng, chủ yếu nhờ hấp phụ - Dùng pha lỏng để chiết lấy chất từ mẫu phân tích chất rắn PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 2.1 Khái niệm phương pháp sắc ký Sắc ký phương pháp tách chất dựa vào phân bố khác chúng pha khơng hồ lẫn vào ln tiếp xúc với nhau, pha đứng yên gọi pha tĩnh pha di chuyển gọi pha động trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh đến lớp pha tĩnh khác lặp lặp lại trình hấp phụ phản hấp phụ Hệ chất bị hấp phụ nhiều (có lực lớn) với pha tĩnh di chuyển chậm chất bị hấp phụ (có lực yếu) chúng tách khỏi 2.2 Phân loại phương pháp sắc ký Dựa vào trạng thái tập hợp pha động người ta chia sắc ký thành nhóm lớn: sắc ký khí sắc ký lỏng Dựa vào chế trao đổi chất pha động pha tĩnh, cách bố trí pha tĩnh người ta lại chia phương pháp sắc ký thành nhóm nhỏ Bảng 2.1 Các dạng sắc ký Dạng sắc ký Khí- Hấp phụ Khí – lỏng Lỏng – Rắn Lỏng – Lỏng Lỏng – Nhựa trao đổi ion Lớp mỏng Giấy Rây (sắc ký Gel) Pha động Khí Khí Lỏng Lỏng Lỏng Pha tĩnh Rắn Lỏng Rắn Lỏng Rắn Cách bố trí pha tĩnh Cột Cột Cột Cột Cột Cơ chế tách Hấp phụ Phân bố Hấp phụ Phân bố Trao đổi ion Lỏng Lỏng Lỏng Rắn Rắn Lỏng Lớp mỏng Giấy sắc ký Cột Hấp phụ Phân bố Theo KTPT - Quá trình sắc ký thường gồm giai đoạn chính: Đưa mẫu thử lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh, phát chất xử lý kết 2.3 Một số phương pháp sắc ký 2.3.1 Sắc ký lớp mỏng 2.3.1.1 Khái niệm Về chất sắc ký lỏng- rắn đó: - Pha tĩnh rắn trải thành lớp mỏng đồng kính, nhựa hay kim loại - Pha động dung môi đơn đa thành phần - Chấm dung dịch mẫu nghiên cứu lên mỏng (cách rìa mỏng - 3cm) -Chạy sắc ký cách đặt mỏng vào pha động theo hướng phần có vết chấm Dưới tác dụng lực mao quản, dung môi chuyển động qua lớp hấp phụ, cấu tử di chuyển theo hướng pha động với vận tốc khác đưa đến việc tách cấu tử khỏi nhau, ta thu sắc ký đồ lớp mỏng Ứng dụng - định tính, • Thử độ tinh khiết, - Có thể định lượng • Ưu điểm : - Thiết bị đơn giản, dễ tiến hành, thời gian phân tích nhanh, chọn lọc - 2.3.1.2 Đại lượng đặc trưng • Hệ số lưu giữ R f • Hệ số lưu giữ tương đối Rtd Trong c khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết sắc ký chất chọn làm chuẩn đối chiếu sắc ký mỏng với mẫu thử Độ phân giải Rs R S > 1, giá trị tối ưu R S = 1,5 2.3.2 Sắc ký trao đổi ion Là dạng sắc ký lỏng - rắn Ở pha tĩnh chất có khả trao đổi ion (cation anion) + Với cationid: + Với anionid: ứng dụng: - Tách ion, Định lương, Tinh lọc nước • 2.3.3 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Phân tách chất pha tĩnh chứa cột, nhờ di chuyển pha động lỏng áp xuất cao - Cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, loại cỡ (tùy vào chất pha tĩnh) 2.3.3.1 Các kỹ thuật HPLC (SGK) 2.3.3.2 Chon kỹ thuật HPLC (SGK) 2.3.3.3 Chuẩn hóa cột (SGK) 2.3.3.4 Các phương pháp định lượng N/tắc: Nồng độ chất tỷ lệ với chiều cao diện tích Pic Có PP chính: * Phương pháp chuẩn ngoại: - Là PP nhất, nồng độ mẫu thử tính thơng qua so sánh Pic (chiều cao Dt) mẫu chuẩn mẫu thử tiến hành sắc ký điều kiện - Chuẩn hóa điểm ( điểm chuẩn) - Chuẩn hóa nhiều điểm (đường chuẩn) * Phương pháp chuẩn nội - N/tắc: thêm vào mẫu chuẩn thử lượng chất tinh khiết tiến hành sử lý mẫu (nếu có), tiến hành sắc ký điều kiện Chất thêm gọi chuẩn nội - Chất chuẩn nội phải có t/c sau: +Pic phải tách hồn tồn với Pic thử +Có cấu trúc hóa học tương tự +Có nồng độ xấp xỉ với chất thử +Ko phán ứng với thành phần mẫu +Tinh khiết cao, dễ kiếm] - PPđược áp dụng khi: + Sử lý mẫu phức tạp + Nồng độ chất phân tích thấp + Cần giảm thiểu sai sai thiết bị kỹ thuật -Hệ số đáp ứng F Cc Sisc Fx = (Cc/Cisc)/(Sc/Sisc)= -Cisc Sc Trong đó: - Cc Sc nồng độ chuẩn diện tích píc chuẩn - -Cisc Sisc nồng độ chất chuẩn nội diện tich píc chuẩn nội mẫu chuẩn Định lượng thành phần mẫu thử + Chuẩn điểm: Chuẩn nội thêm vào hai mẫu chuẩn thử sử lý mẫu tiến hành sắc ký St St Cc Sisc St Cc Sisc Ct= Cist Fx = - Cist = -Sist Sist Cisc Sc Sist Sc Trong đó: Ct St nồng độ thử diện tích píc thử Cist Sist nồng độ chuẩn nội diện tich píc chuẩn nội mẫu thử + Chuẩn nhiều điểm: dãy chuẩn có nồng độ chất chuẩn khác tất có nồng độ chuẩn nội Tến hành sắc ký, lập tương quan tỷ số diện tích pic chuẩn trân chuẩn nội (Sc /Sis)với tỷ số nồng độ chuẩn chuẩn nội (Cc / Cis) Sắc ký mẫu thử đựơc thêm chuẩn nội thang chuẩn, tính tỷ số diện tích St /Sist áp đường chuẩn suy nồng độ chất thử Ct PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI - KHẢ KIẾN Là phương pháp phân tích xác định chất dựa sở hấp thụ xạ điện từ vùng tử ngoại (UV) khả kiến (VIS) phân tử chất nghiên cứu 3.1 Định luật hấp thụ ánh sáng (Định luật Lambert- Beer) 3.1.1 Định luật Chiếu chùm tia sáng đơn sắc có cường độ Io qua dung dịch có chiều dày L(cm), nồng độ C Sau bị hấp thụ, cường độ chùm tia cịn lại I Hình 3.1 Sơ đồ ánh sáng truyền qua dung dịch + Độ truyền qua + Mật độ quang D (độ hấp thụ A, độ tắt E) Với K hệ số hấp thụ - Nếu C tính mol/l ta có D= K.C.l gọi hệ số hấp thụ phân tử (K=D C=1mol/l l=1cm) đặc trưng cho chất chất nghiên cứu dung dịch phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng đơn sắc - Nếu C tính theo % (KL/TT ) ta có: D = E1%1cm.C.l E1%1cm hệ số hấp thụ riêng (hệ số tắt riêng) - Nếu dung dịch hấp thụ ánh sáng cao độ truyền qua thấp, mật độ quang cao ngược lại 3.1.2 Điều kiện áp dụng định luật - Ánh sáng phải đơn sắc - Nồng độ khoảng thích hợp - Mơi trường khơng ảnh hưởng đến độ hấp thụ chất nghiên cứu 3.2 Quang phổ hấp thụ ứng dụng 3.2.1 Quang phổ hấp thụ UV-VIS Là đường biểu diến phụ thuộc mật độ quang D chất nghiên cứu vào bước sóng ánh sáng Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV – VIS vitamin B12 3.2.2 Ứng dụng: - Định tính thử tinh khiết : Các cực đại hấp thụ tỷ số cực đại hấp thụ đặc trương định tính chất - Định lượng 3.2.3 Một số điều kiện áp dụng - Tia sáng đơn sắc ( tốt có λmax) - Vùng đo mật độ quang từ 0,2- 0,8 - Vùng nồng độ tuân theo định luật Lambert - Beer - Loại bỏ yếu tố ảnh hưởng 3.3 Các phận máy đo quang phổ UV-VIS Các máy có nhiều loại cấu tạo khác nhau, song có sơ đồ chung: Hình 3.3 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ UV-VIS 3.4 Các cách xác định nồng độ dung dịch phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 3.4.1 Phương pháp trực tiếp kết nồng độ Cx • E1%1cm có bảng tra cứu (hoặc tự xác định từ chất chuẩn gốc) Phương pháp có kết tin cậy khi: - Máy chuẩn hóa thơng số kỹ thuật ( bước sóng, độ hấp thụ, độ ổn định….) Tiến hành đo điều kiện tiêu chuẩn ( điều kiện đo E1%1cm ) 3.4.2 Phương pháp so sánh (điểm chuẩn) Theo ĐL lambert-Beer đo độ hấp thụ dd chuẩn so sánh (s) vad dung dịch mâu thử ( X) tao có As = K.L.Cs Ax = K.L.Cx Do Cx = Cs Ax/As 3.4.3 Phương pháp đường chuẩn có nồng độ biết trước C1, C2, C3, C4, C5 đem đo mật độ quang tương ứng D1, D2, D3, D4, D5 Vẽ đồ thị D - C Đồ thị mối tương quan D-C Đo mật độ quang dung dịch cần xác định CX DX Từ giá trị Dx dự vào đồ thị tính Cx Yêu cầu: + Đường chuẩn phải thẳng.( tuyến tính) + CX phải nằm khoảng (C1- C5 ... tinh, phễu lọc thuỷ tinh xốp, 1.2.2 Phương pháp ly tâm Là phương pháp dùng lực ly tâm để làm lắng kết tủa xuống Tốc độ lắng phụ thuộc vào lực ly tâm 1.2.3 Phương pháp chia cắt pha - Có thể thực... chiều nhau, hai pha tiếp xúc chặt chẽ, pha trộn di chuyển ngược chiều Đây trình liên tục Trong kiểm nghiệm chiết lỏng - lỏng ứng dụng nhiều thường dùng pha nước pha dung môi hữu 1.2.4.2 Chiết lỏng... lỏng - lỏng chiết lỏng - rắn 1.2.4.1 Chiết lỏng - lỏng Có cách: - Chiết đơn: Chiết lần, phịng thí nghiệm chiết bình gạn, lắc tay máy Hiệu suất chiết thấp - Chiết lặp (chiết nhiều lần): Sau lần chiết