CÁC PHƯƠNG PHÁP hóa lý TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC p3

KHOA DƯỢC BỘ MƠN HĨA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC (Tiếp theo) (2 giờ) Giảng viên: Phan Thị Thu Trang Email: phantttrang47@gmail.com Điện thoại: 0702396147 NỘI DUNG Quang phổ phân tử Quang phổ hấp thụ UV-VIS Quang phổ hồng ngoại Sắc ký lỏng hiệu cao – Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquic Chromatography – HPLC) NỘI DUNG • Thơng số đặc trưng • Hệ thống máy HPLC • Các kỹ thuật HPLC • Hướng dẫn chọn kỹ thuật HPLC • Các phương pháp định lượng HPLC 2.3 Các kỹ thuật HPLC Phân bố Hấp phụ Phân loại Rây phân tử Trao đổi ion 2.3 Các kỹ thuật HPLC Sắc ký phân bố hiệu cao Pha tĩnh Sắc ký lỏng- lỏng (LLC): lớp Sắc ký pha liên kết (BPC): mỏng pha lỏng hữu bao liên kết hóa học với bề mặt tiểu phân chất mang Các nhóm chức chất mang hữu liên kết với bề mặt Nhược điểm: bị rửa trôi dần tiểu phân silica qua theo dịng pha động → hiệu nhóm silanol lực cột bị giảm dần trình sử dụng 2.3 Các kỹ thuật HPLC Sắc ký phân bố hiệu cao Pha tĩnh Một số pha liên kết thường dùng 2.3 Các kỹ thuật HPLC Pha động ❖ Pha động dung mơi đơn hay hỗn hợp 2, hay thành phần Người ta thay đổi độ phân cực pha động cách thay đổi tỷ lệ thành phần dung môi hỗn hợp ❖ Kỹ thuật thay đổi liên tục thành phần dung môi thời gian chạy sắc ký gọi rửa giải gradient chương trình hóa dung môi 2.3 Các kỹ thuật HPLC Sắc ký phân bố hiệu cao Tuỳ thuộc vào việc sử dụng pha động pha tĩnh người ta chia sắc ký phân bố thành loại (sắc ký pha thuận sắc ký pha đảo) 2.3 Các kỹ thuật HPLC Sắc ký pha thuận (Nomal Phase Chromatography) Sắc ký pha đảo (Reversed-Phase Chromatography) Link xem: https://www.youtube.com/watch ?v=MLoitPJQH3g 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn ngoại Chuẩn hóa nhiều điểm Khoảng tuyến tính - Pha dãy dd chuấn với nồng độ tăng dần - Thu S (H) pic điểm - Vẽ đồ thị S (H) theo C - Hàm có dạng Y = a.X + b - Từ S (H) pic chất cần tìm xác định nồng độ Y S (H) dd thử 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội ❑ Áp dụng phân tích mẫu phải xử lý phức tạp (chiết tách ) đặc biệt mẫu vừa phức tạp vừa có hàm lượng thấp chất cần định lượng ❑ Có thể giúp cực tiểu hóa sai số gây nên máy móc kỹ thuật 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Thêm vào mẫu chuẩn lẫn mẫu thử lượng chất tinh khiết, tiến hành sắc ký điều kiện Chất thêm gọi chuẩn nội Chuẩn ✓ Sắc ký điều kiện ✓ Dựa vào S (H) pic lượng (nồng độ) chuẩn, chuẩn nội mẫu thử, Thử xác định hàm lượng thành phần cần định lượng mẫu thử cách xác 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Xác định hệ số đáp ứng Fx - mC , mIS : khối lượng chất chuẩn chuẩn nội - CC , CIS : nồng độ chuẩn chuẩn nội - SC , SIS : diện tích pic chuẩn chuẩn nội 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Pp chuẩn điểm Ch + IS → Sch, SIS T + IS → St, SIS 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Pp chuẩn nhiều điểm - Chuẩn bị dãy chuẩn có chứa lượng (nồng độ) chất chuẩn khác tất chứa lượng (nồng độ) chuẩn nội - Thu S (H) pic chất chuẩn, chuẩn nội - Vẽ đồ thị SS/SIS (H) theo CS/CIS - Tiến hành mẫu thử tương tự T + IS thu S (H) - Từ ST/ SIS tính CT/CIS theo đồ thị - Từ suy CT 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Yêu cầu chất chuẩn nội - Trong điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải tách hồn tồn có thời gian lưu gần với thời gian lưu chất cần phân tích mẫu thử - Có cấu trúc hố học tương tự chất thử - Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử - Không phản ứng với thành phần mẫu thử - Phải có độ tinh khiết cao dễ kiếm 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp thêm chuẩn ❑ Kỹ thuật phối hợp phương pháp chuẩn ngoại chuẩn nội ❑ Ưu điểm kỹ thuật thêm chuẩn có độ xác cao loại trừ sai số yếu tố ảnh hưởng, đặc biệt ảnh hưởng trình xử lý mẫu (chiết xuất, tinh chế chất từ dạng bào chế ) 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp thêm chuẩn Phương pháp thêm điểm + Chuẩn bị mẫu thử song song + Thêm vào mẫu thử thứ lượng biết chất chuẩn + Tiến hành xử lý mẫu sắc ký điều kiện ΔC CX =SX ΔS ΔC: lượng chất chuẩn them vào ΔS: S (T+C) – S (T) 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp thêm chuẩn Kỹ thuật thêm đường chuẩn - Chuẩn bị dãy hỗn hợp gồm lượng mẫu thử giống chất chuẩn với lượng tăng dần - Vẽ đồ thị S (T+C) theo C thêm vào - Giao điểm đường chuẩn kéo dài với trục hồnh nồng độ chất cần xác định 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic Ngun tắc: Hàm lượng phần trăm chất hỗn hợp nhiều thành phần tính tỷ lệ phần trăm diện tích pic so với tổng diện tích tất pic thành phần sắc đồ Phương pháp yêu cầu tất thành phần rửa giải đươc phát Tất thành phần có đáp ứng detector (response) 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic VD: hỗn hợp thành phần X, Y, Z Tính lại hệ số đáp ứng liên hệ chất chuẩn SS SX : diện tích pic chuẩn pic thử CS CX : nồng độ chất chuẩn chất thử fS : hệ số hiệu chỉnh chuẩn Suy 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic Ứng dụng: ❑ Trong sắc ký khí chất phân tích có đáp ứng detector ion hóa lửa ❑ Trong HPLC bị hạn chế vì: + Đáp ứng detector với chất phân tích khơng giống + Thường dùng để thử tạp chất liên quan Câu hỏi lượng giá: Câu 1: Sắc ký pha thuận sắc ký pha đảo gì? Cho ví dụ pha tĩnh pha động dùng sắc ký pha thuận sắc ký pha đảo Câu Hãy so sánh sắc ký lỏng hiệu cao với sắc ký cổ điển Câu3: Hãy trình bày loại bơm sử dụng HPLC THANK YOU ... 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Nồng độ chất tỷ lệ với chiều cao diện tích pic Phương pháp chuẩn ngoại Phương pháp chuẩn nội Phương pháp thêm chuẩn Phương pháp chuẩn hóa diện tích 2.5 Các phương. .. pic chuẩn chuẩn nội 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Pp chuẩn điểm Ch + IS → Sch, SIS T + IS → St, SIS 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Pp chuẩn... hiệu chỉnh chuẩn Suy 2.5 Các phương pháp định lượng HPLC Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic Ứng dụng: ❑ Trong sắc ký khí chất phân tích có đáp ứng detector ion hóa lửa ❑ Trong HPLC bị hạn chế vì: