Các phương pháp hóa lý trong kiểm nghiệm thuốc

CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐCPHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÂN TỬPHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.Quang phổ hấp thụ UVVISQuang phổ hồng ngoại (IR)Quang phổ huỳnh quangQUANG PHỔ HẤP THỤ UVVISĐộ hấp thụĐộ hấp thụ tuân theo định luật Lambert – Beer và được biểu diễn bằng phương trình sau:A =

ĐỀ TÀI

NHÓM 2

VŨ DUY HẢI HOÀNG XUÂN ÁI

HUỲNH QUỐC MINH

NGUYỄN THANH BÌNH

CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG KIỂM NGHIỆM

THUỐC

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÂN TỬ

PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG

CAO.

2

PHẦN 1 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

PHÂN TỬ

Quang phổ hấp thụ UV-VIS

I II III

Quang phổ hồng ngoại (IR) Quang phổ huỳnh quang

3

I0 : cường độ ánh sáng đơn sắc tới.

I : cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch

K : hệ số hấp thụ phụ thuộc λ, thay đổi theo cách biểu thị nồng độ

L : là chiều dài của lớp dung dịch

C : nồng độ chất tan trong dung dịch

4

2 ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG:

Ánh sáng phải đơn sắc

Khoảng nồng

độ phải thích hợp: định luật Lambert- beer chỉ đúng trong một giới hạn nhất định của nồng độ.

Dung dịch phải trong suốt

Chất thử phải bền trong dung dịch và bề dưới tác dụng của ánh sáng UV - VIS

5

3 MÁY QUANG PHỔ

Máy quang phổ thích hợp cho việc đo phổ ở vùng

tử ngoại và khả kiến gồm một hệ quang học có

khả năng tạo ánh sáng đơn sắc trong vùng từ 200

đến 800nm và một thiếp bị thích hợp để đo độ

hấp thụ

6

4 HIỆU CHỈNH MÁY QUANG PHỔ

Kiểm tra thanh độ dài sóng

5 ỨNG DỤNG CỦA PHỔ UV-VIS TRONG KIỂM

Các phương pháp định lượng:

Phương pháp đo phổ trực tiếp:

− Đo phổ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ C của nó dựa vào giá trị độ hấp thụ riêng:

 Để áp dụng phương pháp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ cả về

bước sóng lẫn độ hấp thụ

 Phương pháp gián tiếp: phương pháp đường chuẩn, so sánh thêm chuẩn.

Đặc điểm của phương pháp gián tiếp:

 Phương pháp so sánh: theo định luật Lambert- beer suy ra:

Cx = Cs

Trong đó:

lệch nhau quá nhiều.

10

 Phương pháp thêm chuẩn so sánh:

=

 Trong đó:

: độ hấp thụ của dung dịch chuẩn đã thêm chuẩn.

 : nồng độ của dung dịch chuẩn.

 Phương pháp đường chuẩn:

Đồ thị của phương pháp đường chuẩn A= f (C) 11

 Phương pháp thêm đường chuẩn:

 Kĩ thuật đo quang vi sai theo bước sóng:

o Dùng để loại trừ sai số của tạp chất trong dịch chiết trong kiểm

nghiệm các dạng thuốc trong tế bào

12

truyền qua và ánh sáng tới.

13

3 Ứng dụng phổ hồng ngoại trong định tính

• Định tính sử dụng chất chuẩn so sánh:

• Định tính sử dụng phổ chuẩn trong atlas hoặc thư viện phổ:

 Chuẩn hóa độ phân giải.

 Chuẩn hóa thang số sóng.

 Hầu hết các dược điểm trên thế giới đều dựa trên 2 nguyên tắc:

− So sánh sự phù hợp giữa chất thử với phổ chuẩn cho sẵn trong

sách tra cứu hoặc trong thư viện phổ lưu giữ trong máy tính.

− So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử với phổ của hóa chất

chuẩn được ghi trong cùng điều kiện.

14

III QUANG PHỔ HUỲNH QUANG (FLUOROMETRY)

1 MỞ ĐẦU

Khái niệm: phổ huỳnh quang là phương pháp phổ phát xạ phân tử Sau khi hấp thụ năng

lượng của bức xạ tử ngoại, khả kiến hoặc các bức xạ điện từ khác (bức xạ kích thích), phân tử bị kích thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và giải phóng năng lượng dưới dạng bức xạ, được gọi là bức xạ huỳnh quang.

F = K.I0 C.L

Ở đây:

K : Hằng số

I0 : Cường độ của bức xạ kích thích : Hiệu xuất huỳnh quang

= (0< <1) : hệ số hấp thụ mol của chất ở bước sóng kích thích.

Rút gọn lại ta có : F = K’ C

Ở đây K’ = K.I0 L.

15

Thường dùng đèn

xenon,laser.

Dùng cách tử

Thường dùng thạch anh (1x1 cm) có 4 mặt trong suốt

2 MÁY

Nguồn sáng

3 CHUẨN HÓA MÁY

Máy quang phổ huỳnh quang phải được chuẩn hóa thường xuyên với

chất chuẩn.

Mẫu thử luôn được đo so sánh với mẫu chuẩn.

4 PHƯƠNG PHÁP ĐO

Ghi cường độ huỳnh quang của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và các mẫu trắng tướng ứng của chúng.

Kiểm tra vùng tuyến tính của cường độ huỳnh quang và điều chỉnh

độ nhạy của thiết bị với độ pha loãng thích hợp của dung dịch chuẩn.

17

Tính toán nồng độ của dung dịch thử:

Cx = Cs

Ở đây:

Cx : nồng độ của dung dịch thử

Cs : nồng độ của dung dịch chuẩn

Ix : trị số đo được của dung dịch thử

Is : trị số đo được của dung dịch chuẩn

Iox và Ios : trị số đo được của các mẫu trắng tương ứng

Trong đó - phải không được < 0,5 và không > 2

18

4 PHƯƠNG PHÁP ĐO

PHẦN 2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Định nghĩa: Là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một

pha tĩnh chứa trongcột Nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao

Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc

vào loại pha tĩnh sử dụng

1 CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ

 Hệ số dung lượng k’

k’ = K = = Trong đó:

K : hệ số phân bố Qm: lượng chất trong pha động

tR: thời gian lưu vs: thể tích pha tĩnht’R: thời gian lưu hiệu chỉnh Vm: thể tích pha động

t0: thời gian chết Qs: lượng chất trong pha tĩnh

19

 Hệ số chọn lọc :

Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột

= =

Quy ước ở đây B là chất bị giữ mạnh hơn A nên > 1

Để tách riêng hai chất thường chọn 1,05 2

 Hệ số đối xứng của pic F:

F =

Ở đây:

W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

20

Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N:

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột

N = 16 = 5,54

Ở đây:

W: chiều rộng đo ở đáy pic

W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Độ phân giải Rs:

Rs = Với:

tRB, tRA,: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)

WB,WA: Độ rộng pic đo ở các đáy pic

21

2 MÁY HPLC

Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC

22

Các kỹ thuật HPLC

Sắc ký phân bố

 Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Partition Chromatography)

 Pha tĩnh

Pha tĩnh trong sắc ký phân bố bao gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt

của các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác

Hệ bao gồm pha tĩnh

phân cực và pha động

không phân cực được

gọi là sắc ký pha thuận

và ngược lại

24

Khi sử dụng silica,nhôm oxyd hoặc polyme xốp thì các chất được phân tách theo cơ chế hấp phụ nên được gọi là sắc

ký hấp phụ.

Nếu pha tĩnh là polyme xốp như dextran ,ta có sắc

ký loại cỡ

Nếu pha tĩnh là nhựa trao đổi ion thì gọi là sắc ký trao đổi ion.

 Pha động

 Ái lực của một thành phần đối với pha tĩnh hay nói một cách khác,thời gian lưu giữ

của nó ở trên cột được điều khiển bằng cách thay đổi bộ phân cực của pha động

 Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp của 2,3 hay 4 thành phần

Tùy thuộc vào sử dụng pha động và pha tĩnh người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại:

25

Sắc ký pha thuận Sắc kí pha đảo 1

2

 Sắc ký pha thuận (normal phase)

 Trong kỹ thuật này người ta sử dụng chất nạp cột (packings) gồm các nhóm phân cực liên kết với chất mang như nhóm alkylnitril [-(CH2)nCN] và alkylamin [-(CH2)nNH2]

26

Ưu điểm

Cột rất bền

Cột nhanh đạt cân bằng nên rất thuận lợi cho phân tách gradient

Cột alkylamin có thể

có chức năng như một cột trao đổi anion yếu

Cột thích hợp với nhiều dung môi và

dễ tái sinh

 Sắc kí pha đảo (reversed phase)

Trong kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp HPLC, sắc ký pha đảo được sử

dụng nhiều nhất

Trong kỹ thuật này pha tĩnh bao gồm các nhóm không cực như octadecyl (C18),

octyl (C8) hay phenyl (C6H5)

Pha động là nhưng dung môi phân cực như : nước, methanol, acetonitril (ACN)

Chú ý

Khi pha động có thêm các muối vô cơ hoặc các chất hoạt động bề mặt, nên lọc nó trước khi dùng vì có thể có cặn không tan trong nước gây bẩn cột

Việc đuổi khí rất quan trọng với pha động, pha đảo

Về thứ tự rửa giải: Trong sắc kí pha đảo các chất phân cực ra trước, các chất ít và không phân cực ra sau

27

4 HƯỚNG DẪN CHỌN KỸ THUẬT HPLC

28

Hình 2 Sơ đồ hướng dẫn chọn kỹ thuật HPLC

5 CHUẨN HÓA CỘT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Mục đích: Kiểm tra hiệu năng của các cột HPLC và để xác định một cách khách quan xem khi nào chúng cần phải thay thế.

Chuẩn hóa cột sắc ký pha đảo

Chuẩn bị dung dịch các chất chuẩn:

Pha một hỗn hợp dung dịch các chất chuẩn trong methanol 60%(v/v) với các nồng độ như sau:

»Uracil 0,02 mg/l

»Phenol 1,00 mg/l

»Anisol 1,50 mg/l

29

 Tính toán

Hệ số dung lượng (k):

k’ = ( tA – t0)/t0

  t0: thời gian lưu của uracil

tA: thời gian lưu của anisolHiệu lực cột (N)

N = 5,54 t2

A / W2

1/2

tA: thời gian lưu của anisol

W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic anisol

F= WA /2a

 

WA: chiều rộng pic anisol đo ở 1/20 chiều cao pica: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước của pic tại 1/20 chiều cao pic

30

 Chuẩn hóa cột sắc ký pha thuận

Chuẩn bị dung dịch: Hòa tan khoảng 0,1 - 0,2 ml n- pentan và 20 mg

acetophenon trong 100 ml hexan có chứa 0,5 % (v/v) methanol.

Điều kiện sắc ký

Pha động : hexan – methanol ( 99,5 : 05 ) Tốc độ dòng : 1,0 ml/ phút

Thể tích tiêm : 20 L Detector : UV ở 254 nm Tính toán tương tự chuẩn hóa cột pha đảo

Với:

tA: thời gian lưu của acetophenon

t0: thời gian lưu cua n – pentan

W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic acetophenon

31

3 2

Đo tín hiệu detector

Tiến hành sắc kí

Phương pháp định lượng 4

33

Lấy mẫu

Lấy mẫu đại diện

01

Sai số do lấy mẫu có thể tăng lên ở ít nhất 3 khâu sau:

Tiến hành tách sắc ký

Quá trình chạy sắc ký cần chú ý:

Có thể xảy ra sự phân hủy các chất thử trong khi phân tích

Có thể xuất hiện các pic lạ trên sắc đồ

Vì vậy cần phải kiểm tra bằng sắc ký các vết tạp đó.

Tiến hành tách sắc ký

• Chuẩn bị mẫu thử • Tiêm mẫu

Độ tinh khiết cao để không có pic lạ

Có thể hòa lẫn được với dung môi

rửa giải Cho đáp ứng rất nhỏ với detector

Dung môi và dung dịch thử phải

được lọc qua màng lọc 0,45

Dùng bơm tiêm

Dùng van tiêm mẫu thể tích xác định

Dung môi phải đáp ứng các yêu cầu sau:

Có 2 cách tiêm mẫu vào cột

35

 Đo tín hiệu detector (detector UV-VIS)

a) Detector phải đáp ứng yêu cầu

36

7.1 Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn ngoại là phương

kiện

- So sánh diện tích (chiều cao) của pic

mẫu thử với diện tích (chiều cao) của pic

mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các

chất trong mẫu thử

38

Phương pháp chuẩn hóa:

Nhiều điểm Một điểm

7.1 Phương pháp chuẩn ngoại

của mẩu thử.

Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

Trong đó:

39

7.1 Phương pháp chuẩn ngoại

Chuẩn hóa nhiều điểm: Đối

với mẫu chuẩn ta tiến hành như

sau:

- Chuẩn bị một dãy chuẩn với

nồng độ tăng dần rồi tiến hành

sắc ký.

- Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự

tương quan giữa diện tích S pic

với nồng độ của chất chuẩn C

40

S1

S2

X

7.1 Phương pháp chuẩn ngoại

 Đối với mẫu thử:

Chuẩn bị một dãy mẫu thử với

các nồng độ tăng dần  sắc ký

- Áp dữ kiện diện tích (chiều cao)

pic của chất thử vào đường chuẩn

S2

x

7.2 Phương pháp chuẩn nội

 Là phương pháp người ta thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những

lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

 Chất được thêm gọi là chuẩn nội

43

7.2 Phương pháp chuẩn nội

Yêu cầu đối với chất chuẩn nội:

44

Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử

Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ của chất thử

Không phản ứng với bất kì

thành phần nào của mẫu thử

Phải có độ tinh khiết cao

5

7.2 Phương pháp chuẩn nội

Phương pháp chuẩn hóa 1 điểm

 Là phương pháp chuẩn nội được thêm

vào cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử 

- Tiến hành sắc kí và vẽ đường chuẩn

 Đối với mẫu thử:

-Ta tiến hành song song cũngđược thêm chuẩn nội với lượng hoặc nồng độ như thang chuẩn

-Tính tỉ số ST/Sis rồi dựa vào đường chuẩn sẽ tìm được nồng

độ của chất thử (CT)

Hệ số đáp ứng F x :

Trong đó:

mC,mIS lần lượt là khối lượng của chất chuẩn và chuẩn nội.

CC,CIS lần lượt là nồng độ của chuẩn và chuẩn nội.

SC, SIS lần lược là diện tích pic chuẩn và chuẩn nội.

7.3 Phương pháp chuẩn hóa điện tích

Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều

thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với

tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc đồ.

Yêu cầu:

- Tất cả thành phần đều được rửa giải và được phát hiện.

- Tất cả các thành phần đều đáp ứng detector như nhau.

46

7.3 Phương pháp chuẩn hóa điện tích

- Hàm lượng phần trăm của X ta tính như sau:

- Nếu xét đến đáp ứng khác nhau của detector thì cần xác định các hệ số

đáp ứng đối với mỗi chất để hiệu chính sự sai khác đó.

47

7.3 Phương pháp chuẩn hóa điện tích

Công thức hệ số đáp liên hệ với chất chuẩn: