Xây dựng quy trình định lượng acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic trong sữa ong chúa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong nghiên cứu này, mẫu nghiên cứu được lựa chọn là sữa ong chúa (SOC) – đây là thức ăn được sản sinh từ con ong thợ để nuôi ong chúa; và cũng là nguồn nguyên liệu quý trong sản xuất các dạng thực phẩm bổ sung do giá trị dinh dưỡng cao, và có tác dụng sinh học như kháng khuẩn, kháng viêm, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, kháng ung thư, hạ huyết áp và tác dụng tương tự estrogen.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID (E)-10-HYDROXY-2-DECENOIC TRONG SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Minh Nguyệt*, Trương Văn Đạt*, Nguyễn Hữu Lạc Thủy* TÓMTẮT Mở đầu – Mục tiêu: Hiện nay, nhu cầu sử dụng sản phẩm hỗ trợ sức khỏe có nguồn gốc thiên nhiên ngày phổ biến Các sản phẩm dạng với tên gọi thực phẩm bổ sung, phần lớn có thành phần từ dược liệu, vitamin, khoáng chất, acid béo v.v Trong nghiên cứu này, mẫu nghiên cứu lựa chọn sữa ong chúa (SOC) – thức ăn sản sinh từ ong thợ để nuôi ong chúa; nguồn nguyên liệu quí sản xuất dạng thực phẩm bổ sung giá trị dinh dưỡng cao, có tác dụng sinh học kháng khuẩn, kháng viêm, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, kháng ung thư, hạ huyết áp tác dụng tương tự estrogen Để kiểm soát chất lượng nguồn SOC cung cấp từ trang trại nuôi ong giúp nhà sản xuất cơng tác tiêu chuẩn hóa từ nguyên liệu đến sản phẩm, ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với (E)-10-hydroxy-2-decenoic (10-HAD) chất đối chiếu lựa chọn làm phương pháp thử tiêu chuẩn kiểm nghiệm SOC sản phẩm từ SOC Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: (E)-10-hydroxy-2-decenoic sữa ong chúa Phương pháp nghiên cứu: khảo sát điều kiện sắc ký để xây dựng thẩm định quy trình định lượng (E)-10-hydroxy-2-decenoic phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sơ đánh giá chất lượng số mẫu sữa ong chúa thu thập Kết quả: Các điều kiện sắc ký thích hợp để tách định lượng (E)-10-hydroxy-2-decenoic sữa ong chúa: cột C8 Eurospher II (250 x 4,6 mm; m); pha động hỗn hợp methanol  acid phosphoric pH3 (55: 45), nhiệt độ cột 30 oC; tốc độ dòng ml/phút; thể tích tiêm 10 µl; bước sóng 212 nm Quy trình thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống; độ đặc hiệu; độ xác với RSD < 2%; độ với tỷ lệ phục hồi trung bình 99,4%; khoảng tuyến tính rộng (5,0 – 160,0 µg/mL; ŷ = 58410x; R2 ≥ 0,9999) Hàm lượng (E)-10-hydroxy-2-decenoic mẫu thử 0,95 ± 0,09% Quy trình ứng dụng để đánh giá chất lượng mẫu sữa ong chúa qua hàm lượng (E)-10hydroxy-2-decenoic 0,56; 1,05; 0,95; 1,08 1,53% mẫu sữa ong chúa đơng khơ (do nhóm nghiên cứu sản xuất) có hàm lượng 0,93% Kết luận: Quy trình định lượng (E)-10-hydroxy-2-decenoic phương pháp HPLC-PDA xây dựng thẩm định đạt yêu cầu thẩm định, sở khoa học để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm sữa ong chúa sản phẩm từ sữa ong chúa Từ khóa: sữa ong chúa, (E)-10-hydroxy-2-decenoic, sắc ký lỏng hiệu cao ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF (E)-10-HYDROXY-2-DECENOIC ACID IN ROYAL JELLY BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Nguyen Minh Nguyet, Truong Van Đat, Nguyen Huu Lac Thuy * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 499 – 505 * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 091.551.7890 500 Email: nguyenhuulacthuy@ump.edu.vn Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Background – Objectives: At present, the demand for natural health supplements becomes increasingly These are called supplementary foods, most of which contain medicinal plants, vitamins, minerals, fatty acids, etc In this study, Royal jelly (RJ) was selected as the test sample RJ is the food produced by the worker bees for the nutrition of the queens Royal jelly is also a precious material for production of supplementary foods due to high nutritional value and biological activities such as antibacterial, anti-inflammatory, immunomodulatory, antioxidant, anti-cancer, blood pressure lowering and estrogen-like effects In order to control the quality of various RJ sources from bee farms and products, there of high performance liquid chromatography with (E)-10-hydroxy-2-decenoic as the reference compound was selected Methods: the subject of the study was (E)-10-hydroxy-2-decenoic in RJ Several chromatographic conditions was investigated to find out the suitable chromatographic parameters Finally, the validated method was applied for assay of (E)-10-hydroxy-2-decenoic in several collected RJ samples Results: The suitable chromatographic conditions for quantitation of (E)-10-hydroxy-2-decenoic acid were obtained using a stainless steel column (250 x 4.6 mm), packed with octadecylsilane bonded to porous silica (5 m); mixture of methanol and phosphoric acid pH3 (55 : 45) in isocratic mode as mobile phase; flow rate of ml per minute, injection volume of 10 µl; column temperature at 30 oC and detection wavelength at 212 nm This method was validated and showed system suitability, selectivity, accuracy with recovery in 99.4%; precision with RSD < 2%, wide linearity range (5.0 – 160.0 µg/mL; ŷ = 58410x; R2 ≥ 0.9999) The amount of (E)-10-hydroxy-2-decenoic in the test samples are 0.95 ± 0.09% The validated method was applied for assay of (E)-10-hydroxy-2-decenoic in foru RJ samples that showed the content of 0.56; 1.05; 0.95; 1.08; 1.53 (%), respectively and the one of 0.93% in phyolilized RJ sample Conclusions: the HPLC-PDA method was successfully developed and validated for quantification of (E)-10-hydroxy-2-decenoic acid in RJ Key words: Royal Jelly, (E)-10-hydroxy-2-decenoic acid, HPLC khoa học chứng minh kháng ĐẶTVẤNĐỀ khuẩn, kháng viêm, điều hòa miễn dịch, Hiện nay, nhu cầu sử dụng sản phẩm chống oxy hóa, kháng ung thư, hạ huyết áp hỗ trợ sức khỏe có nguồn gốc thiên nhiên ngày tác dụng tương tự estrogen(6) phổ biến Các sản phẩm xếp vào Mục tiêu nghiên cứu xây nhóm thực phẩm bổ sung, phần lớn có thành dựng thẩm định quy trình định lượng acid phần dược liệu, vitamin, khoáng chất, acid béo Trong xu hướng sử dụng sản phẩm có (E)-10-hydroxy-2-decenoic sữa ong chúa nguồn gốc thiên nhiên nay, sữa ong chúa phương pháp sắc ký lỏng hiệu (SOC) nguyên liệu cao(4) với (E)-10-hydroxy-2-decenoic chất nhà sản xuất người tiêu dùng lựa chọn, đánh dấu, hàm lượng vượt trội tác thành phẩm sữa ong chúa với tác dụng bồi dụng sinh học gắn liền với chất lượng sữa bổ sức khỏe, làm trắng da(1) ong chúa(3,5,7) Kết nghiên cứu góp Trong nghiên cứu này, mẫu nghiên cứu phần việc kiểm soát chất lượng lựa chọn sữa ong chúa – thức nguồn sữa ong chúa cungcấp từ ăn sản sinh từ ong thợ để nuôi ong trang trại nuôi ong giúp nhà sản xuất chúa; nguồn nguyên liệu quí sản xuất dạng thực phẩm bổ sung giá cơng tác tiêu chuẩn hóa từ ngun liệu đến trị dinh dưỡng cao, tác dụng sinh học sản phẩm có sữa ong chúa Chuyên Đề Dược 501 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic sữa ong chúa Nguyên vật liệu Chất đối chiếu acid (E)-10-hydroxy-2decenoic (97%) Tokyo Chemical Industry phân phối, mẫu nghiên cứu gồm mẫu thử SOC thu thập mẫu bán thành phẩm sữa ong chúa đông khô nhóm nghiên cứu sản xuất (SOCNC-0118) Dung dịch đối chiếu: (E)-10-hydroxy-2decenoic 40 μg/ml pha với dung môi methanol Dung dịch thử: cân xác khoảng 0,2 g sữa ong chúa cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml methanol, siêu âm 40 phút, định mức với dung môi Các điều kiện sắc ký cố định: tốc độ dòng mL/phút, thể tích tiêm 10 μl, bước sóng 212 nm Các thử nghiệm khảo sát thực bao gồm: quy trình xử lý mẫu thử; Thiết bị HPLC Alliance 2695, đầu dò PDA 2996; cân phân tích Sartorius (0,1 0,01 mg) khảo sát cột sắc ký (C8 C18); nhiệt độ ổn Dung mơi - hóa chất Acid phosphoric đạt tiêu chuẩn phân tích; acetonitril methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký lỏng (Merck) hệ dung môi pha động với acid Phương pháp nghiên cứu hydroxy-2-decenoic bao gồm độ phân giải, độ Định tính (E)-10-hydroxy-2-decenoic phương pháp sắc ký lớp mỏng: chọn lọc, tính bất đối, độ tinh khiết pic Mẫu thử nghiệm: dung dịch đối chiếu acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic 40 μg/ml mẫu sữa ong chúa nồng độ khoảng mg/ml pha methanol Sử dụng pha động làm mẫu trắng Bản mỏng: silica gel F254; dung môi khai triển: khảo sát vài hệ dung môi cloroform, methanol, ethyl acetat; sắc ký đồ phát đèn UV 254 nm Chọn hệ dung môi cho sắc ký đồ mẫu đối chiếu có Rf khoảng 0,4 đến 0,8 mẫu thử có vết (E)-10-hydroxy-2-decenoic có độ phân giải (Rs) > 1,5 so với hai vết lân cận Trên sắc ký đồ thu được, mẫu thử phải có vết tương đương màu sắc Rf với mẫu đối chiếu Xây dựng thẩm định quy trình định lượng (E)-10-hydroxy-2-decenoic sữa ong chúa phương pháp HPLC-PDA: định cột (25; 30 35 oC) Các dung môi khảo sát gồm acetonitril, methanol phối hợp phosphoric vài pH khác vùng acid Đánh giá hiệu tách thử nghiệm qua thông số sắc ký pic (E)-10- Từ kết thực nghiệm, dự thảo quy trình định lượng (E)-10-hydroxy-2-decenoic sữa ong chúa, khảo sát tính phù hợp hệ thống thẩm định quy trình theo hướng dẫn ICH(2), bao gồm: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ xác tỷ lệ phục hồi qua kết khảo sát độ Quy trình sau đạt yêu cầu thẩm định ứng dụng để đánh giá chất lượng mẫu thử sữa ong chúa qua hàm lượng % (E)-10-hydroxy-2-decenoic KẾTQUẢ Định tính (E)-10-hydroxy-2-decenoic phương pháp sắc ký lớp mỏng Trên SKĐ mẫu thử, hệ dung mơi khảo sát cho vết có tương đương với Rf vết đối chiếu Hình cho thấy khả phân tách (E)-10-hydroxy-2-decenoic sữa ong chúa bằng sắc ký pha đảo thuận lợi vết tách dễ dàng khỏi vết lân cận (Rs > 1,5) 502 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học (1): cloroform – ethyl acetat – formic (1 : : 0,05) (2): cloroform – methanol – formic (5 : : 0,05) (3): ethyl acetat – methanol (3 : 1: 0,05) T1: mẫu thử sữa ong chúa T2: mẫu thử đông khô C: dung dịch đối chiếu 10-HDA (2) (1) (3) Hình 1: Các sắc ký đồ định tính 10-HDA phương pháp SKLM Xây dựng thẩm định quy trình định lượng (E)-10-hydroxy-2-decenoic sữa ong chúa phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao: cấu trúc pha tĩnh C18 C8 có ảnh hưởng Xử lý mẫu tinh khiết pic đạt yêu cầu Mẫu thử hòa tan dung môi methanol, thời gian siêu âm khoảng 40 phút (Spic = 2079050 μV.s) 60 phút (2099569 μV.s) cho kết diện tích pic tương đương Như vậy, chọn thời gian hòa tan mẫu 40 phút Khảo sát điều kiện sắc ký: bảng tóm tắt điều kiện sắc ký khảo sát chọn lọc từ kết thử nghiệm Bảng 1: Các điều kiện sắc ký khảo sát Điều kiện Điều kiện Điều kiện Điều kiện Methanol–acid phosphoric pH3 (55 : 45) Acetonitril–acid phosphoric pH3 (30 : 70) Methanol–acid phosphoric pH4 (55 : 45) Methanol–acid phosphoric pH3 (55 : 45) C8 ưu thời gian lưu ngắn độ Bảng 2: Các thông số sắc ký sắc ký đồ HPLC mẫu thử sữa ong chúa cột C8 C18 Cột TR (phút) Rs As (Thời (độ phân (hệ số gian lưu) giải) bất đối) C8 12,30 4,7 1,1 C18 17,66 2,7 1,0 PA PT (Purity (Purity Angle) Thershold) 0,094 0,277 0,441 0,326 Như vậy, điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng (E)-10-hydroxy-2-decenoic sữa ong chúa là: cột sắc ký Eurospher II C8 (250 x 4,6 mm; m), pha động methanol – Cột C18 acid phosphoric pH3 (55 : 45), tốc độ dòng Cột C18 1ml/phút, nhiệt độ cột 30 oC, thể tích tiêm mẫu Cột C18 10 l, bước sóng 212 nm Cột C8 Các sắc ký đồ cho thấy dung môi hữu pH pha động không ảnh hưởng nhiều đến thông số sắc ký, nhiên triển khai acetonitril pha động pH4 thời gian lưu pic 10-HDA không ổn định Trong Chun Đề Dược rõ rệt (kết trình bày bảng 2), sử dụng cột Khảo sát tính phù hợp hệ thống Được thực mẫu đối chiếu Kết khảo sát trình bày bảng Sau lần tiêm lặp lại mẫu đối chiếu, diện tích pic thời gian lưu có RSD < 2%; giá trị độ phân giả > 1,5 hệ số bất đối khoảng 0,8 – 1,5; số đĩa lý thuyết biểu kiến > 2000 Vậy, quy trình đạt tính phù hợp hệ thống 503 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Bảng 3: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống pic 10-HAD (n = 6) Mẫu chuẩn tR (phút) 12,34 phút (RSD 0,17%) Pic 10-HDA Spic (μVx giây) 2324548 (RSD 0,17%) Thẩm định quy trình Độ đặc hiệu: Kết kháo sát tính đặc hiệu cho thấy: sắc ký đồ mẫu trắng tín hiệu pic thời gian lưu pic 10-HDA (12,34 phút) mẫu đối chiếu Sắc ký đồ mẫu thử thêm chất đối chiếu: chiều cao diện tích pic 10-HDA tăng lên so với mẫu thử (hình 2); phổ UV – Vis thời gian lưu pic 10-HDA mẫu thử tương ứng với phổ UV – Vis pic As (0,8 - 1,5) 1,1 (Đạt) Rs (> 1,5) 5,5 (Đạt) N (>2000) 12982 (Đạt) 10-HDA mẫu đối chiếu Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic khảo sát đạt yêu cầu Như vậy, quy trình đạt yêu cầu độ đặc hiệu Thời gian khảo sát tính đặc hiệu gấp lần (36 phút) thời gian lưu (12 phút) pic 10-HAD rửa giải sau cùng, kết phù hợp với kết phân tích sắc ký lớp mỏng Thời gian phân tích quy trình thực 15 phút Sắc ký đồ mẫu trắng Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 10-HAD Sắc ký đồ mẫu thử sữa ong chúa Sắc ký đồ mẫu thử sữa ong chúa thêm chất đối chiếu 10-HDA Hình 2: Các sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu Quy trình định lượng 10-HDA sữa ong Khoảng tuyến tính, độ xác độ đúng: chúa phương pháp sắc ký lỏng hiệu Kết thống kê cho thấy quy trình phân cao đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan quan cao, tỷ lệ phục hồi giới hạn cho phép cao, độ xác độ đạt yêu cầu 98% – 102% RSD ≤ 2% độ xác Bảng 4: Kết khảo sát khoảng tuyến tính, độ xác độ Chỉ tiêu Khoảng tuyến tính Độ xác (n = 6) Độ (n = 9) 504 Kết Phương trình hồi quy: y = 58401x; hệ số R = 0,9999 (khoảng nồng độ tuyến tính 5,0 – 160,0 μg/ml) RSD = 1,04% < 2,0% Tỷ lệ phục hồi TB 99,41% (99,1 – 101,1%); RSD = 0,26% Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Ứng dụng quy trình để khảo sát số mẫu sữa ong chúa thị trường Nghiên cứu Y học Bảng trình bày kết khảo sát sơ hàm lượng 10-HDA mẫu sữa ong chúa thu thập mẫu sữa ong chúa đông khơ (ngun liệu đóng nang nhóm nghiên cứu sản xuất) Bảng 5: Kết khảo sát mẫu sữa ong chúa thu thập Mẫu Nơi cung cấp Hàm lượng 10-HDA SOC SOC (1) Khu du lịch (Tiền giang) TB: 0,56% (RSD = 0,98%) SOC (2) SOC (3) Đại mộc Garden (Lô 1) Đại mộc Garden (Lô 2) TB: 1,05% (RSD = 1,02%) TB: 0,95% (RSD = 1,04%) SOC (4) Trại nuôi ong (Ban Mê Thuột) TB: 1,08% (RSD = 0,99%) SOC (5) SOC đông khô Trại nuôi ong (Bình Phước) Đơng khơ từ mẫu SOC (Lơ 2) TB: 1,53% (RSD = 0,95%) TB: 0,93% (RSD = 1,03%) Nhận xét: hàm lượng 10-HDA dao động lớn mẫu khảo sát, mẫu (5) có hàm lượng vượt trội mẫu lại Mẫu thu thập trực tiếp từ nơi sản xuất phân tích (thời gian bảo quản tuần); mẫu lại thành phẩm lưu hành thị trường Riêng mẫu (1), nhà sản xuất đề nghị bảo quản điều kiện thường thời gian tháng, nhiên cảm quan có khác biệt hàm lượng 10-HDA 50% so với mẫu khác Điều giải thích thành phần mẫu thêm chất phụ gia chất bảo quản nên kết khác biệt so với mẫu nguyên độ 10-HDA từ 12% – 400% so với nồng độ định lượng (40 μg/ml), đáp ứng mục tiêu khảo sát chất lượng với mẫu thu thập thị trường có chất lượng thay đổi lớn Quy trình đạt yêu cầu thẩm định, bước xử lý mẫu đơn giản, không qua bước chiết tách, pic 10-HDA đạt yêu cầu độ tinh khiết, không bị ảnh hưởng pic lân cận (Rs >1,5), yếu tố thuận lợi cho kết định lượng đạt độ xác độ Nội dung khảo sát (bảng 5) thực tế từ việc thu thập mẫu nghiên cứu cho nhận định điều kiện bảo quản sữa ong chúa để trì hàm lượng 10-HDA cần thiết Qua kết đạt được, định Kết định lượng mẫu đông khô cho thấy quy trình đơng khơ ngun liệu sữa ong chúa khơng làm giảm hàm lượng 10-HDA hướng cho nghiên cứu thu BÀNLUẬN thời vụ thu hoạch, điều kiện bảo quản, thực Cấu trúc hóa học 10-HDA acid hữu phân cực trung bình, qua tham khảo tài liệu kết thực nghiệm cho thấy lựa chọn cột pha đảo C8 phù hợp Nhiệt độ cột nên ổn định 30 oC, triển khai nhiệt độ 25 oC pic 10-HDA không cân đối thập mẫu sữa ong chúa theo vùng miền, thử nghiệm để thống kê hàm lượng 10-HDA Từ đề nghị giới hạn hàm lượng 10-HDA cho tiêu chuẩn kiểm nghiệm sữa ong chúa Việt nam đề nghị điều kiện bảo quản nhằm trì hàm lượng 10-HDA KẾTLUẬN (As 1,7) thời gian lưu khơng ổn định Pha Quy trình định lượng 10-HDA sữa động với pH3 ion hóa hồn toàn 10-HDA ong chúa phương pháp HPLC-PDA sử nên sắc ký đồ ổn định so với pha động dụng cột pha đảo C8 xây dựng pH4 Khoảng nồng độ tuyến tính khảo sát thẩm định đạt yêu cầu theo hướng dẫn đủ rộng để áp dụng cho mẫu thử có nồng ICH Chuyên Đề Dược Kết thu nghiên cứu (2) 505 ... phân tích quy trình thực 15 phút Sắc ký đồ mẫu trắng Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 10-HAD Sắc ký đồ mẫu thử sữa ong chúa Sắc ký đồ mẫu thử sữa ong chúa thêm chất đối chiếu 10-HDA Hình 2: Các sắc ký đồ... hiệu Quy trình định lượng 10-HDA sữa ong Khoảng tuyến tính, độ xác độ đúng: chúa phương pháp sắc ký lỏng hiệu Kết thống kê cho thấy quy trình phân cao đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, ... Trên sắc ký đồ thu được, mẫu thử phải có vết tương đương màu sắc Rf với mẫu đối chiếu Xây dựng thẩm định quy trình định lượng (E)-10-hydroxy-2-decenoic sữa ong chúa phương pháp HPLC-PDA: định