Phân biệt và đánh giá tác dụng dọn gốc tự do invitro của hai loài kỳ nam kiến và kỳ nam gai

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN TUYẾT NGÂN PHÂN BIỆT VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DỌN GỐC TỰ DO IN VITRO CỦA HAI LOÀI KỲ NAM KIẾN VÀ KỲ NAM GAI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN TUYẾT NGÂN PHÂN BIỆT VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DỌN GỐC TỰ DO IN VITRO CỦA HAI LOÀI KỲ NAM KIẾN VÀ KỲ NAM GAI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU- DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Quỳnh Chi ThS Nguyễn Phương Nhị HÀ NỘI 2022 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Các loài thuộc hai chi Hydnophytum chi Myrmecodia họ Cà phê .3 1.1.1 Phân bố hai chi Hydnophytum chi Myrmecodia 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hydnophytum Myrmecodia 1.2 Tổng quan Kỳ nam kiến 1.2.1 Tên khoa học 1.2.2 Tên khác 1.2.3 Mô tả 1.2.4 Phân bố, sinh thái 1.2.5 Bộ phận dùng 1.2.6 Công dụng 1.2.7 Thành phần hóa học 1.2.8 Tác dụng sinh học 1.2.9 Bài thuốc có Kỳ nam kiến 10 1.3 Tổng quan Kỳ nam gai 11 1.3.1 Tên khoa học 11 1.3.2 Tên khác 11 1.3.3 Mô tả 11 1.3.4 Phân bố, sinh thái 11 1.3.5 Bộ phận dùng 11 1.3.6 Thành phần hóa học 11 1.3.7 Tác dụng sinh học 12 1.4 Gốc tự chất chống oxy hóa 13 1.4.1 Gốc tự 13 1.4.2 Chất chống oxy hóa 14 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU/NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………………………………………… 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Phương tiện nghiên cứu 15 2.2.1 Trang thiết bị máy móc 15 2.2.2 Hóa chất, thuốc thử 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Nghiên cứu so sánh loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai dựa đặc điểm hình thái, đặc điểm dược liệu, thành phần hóa học 16 2.3.2 Đánh giá tác dụng dọn gốc tự in vitro phần thân củ phình to loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 22 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 So sánh hai loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai dựa đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm dược liệu thành phần hóa học 25 3.1.1 Đặc điểm thực vật giám định tên khoa học loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai……… 25 3.1.2 Đặc điểm dược liệu mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 31 3.1.3 Đặc điểm bột củ dược liệu mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 32 3.1.4 Thành phần hóa học loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 34 3.1.4.1 Định tính nhóm hợp chất phản ứng hóa học 34 3.1.4.2 Định tính sắc ký lớp mỏng mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai .36 3.1.4.3 Định lượng polyphenol toàn phần mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai .42 3.2 So sánh tác dụng dọn gốc tự mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 45 3.2.1 Đánh giá khả dọn gốc tự DPPH 45 3.2.2 Đánh giá khả dọn gốc tự OH• 48 3.2.3 Đánh giá khả tạo phức chelat với Fe2+ 51 Chương BÀN LUẬN 53 4.1 Đặc điểm hình thái thực vật, dược liệu thành phần hóa học lồi Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 53 4.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật đặc điểm dược liệu hai loài 53 4.1.2 Thành phần hóa học hai lồi Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 54 4.1.3 Hàm lượng polyphenol toàn phần hai loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 55 4.2 Hoạt tính dọn gốc tự in vitro hai loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 55 4.2.1 Khả dọn gốc tự DPPH 56 4.2.2 Khả dọn gốc tự OH• khả tạo phức chelat với Fe2+ 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Quỳnh Chi Ths Nguyễn Phương Nhị, người thầy ln quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới NCS Nguyễn Thanh Tùng, thầy Lê Trọng Hoàng, người thầy quan tâm, hướng dẫn tận tình q trình tơi thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ nhiệt tình đến tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn ban giám hiệu, phịng sau đại học phòng ban khác trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt chương trình học trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln ủng hộ, khích lệ hết lịng giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2022 Học viên Trần Tuyết Ngân DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A: Absorbance (Độ hấp thụ quang) DĐVN: Dược điển Việt Nam DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ED50: Effective dose 50% EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid EtOAc: Ethyl acetat EtOH: Ethanol GAE: Gallic acid equivalent GET: Dịch chiết phân đoạn ethyl acetat Kỳ nam gai GHX: Dịch chiết phân đoạn n-hexan Kỳ nam gai GTP: Dịch chiết ethanol toàn phần Kỳ nam gai Hep G2: Liver hepatocellular cells IC50: The half maximal inhibitory concentration KET: Dịch chiết phân đoạn ethyl acetat Kỳ nam kiến KHX: Dịch chiết phân đoạn n-hexan Kỳ nam kiến KNG-EtOAc: Phân đoạn ethyl acetat Kỳ nam gai KNG-EtOH: Cao toàn phần Kỳ nam gai KNG-H2O: Phân đoạn nước Kỳ nam gai KNG-nhexan: Phân đoạn n-hexan Kỳ nam gai KNK-EtOAc: Phân đoạn ethyl acetat Kỳ nam kiến KNK-EtOH: Cao toàn phần Kỳ nam kiến KNK-H2O: Phân đoạn nước Kỳ nam kiến KNK-nhexan: Phân đoạn n-hexan Kỳ nam kiến KTP: Dịch chiết ethanol toàn phần Kỳ nam kiến LDL: Low-density lipoprotein MBC: Minimum bactericidal concentration MCF-7: Tế bào ung thư vú MeOH: Methanol MIC: Minimum inhibitory concentration NP/PEG: Natural product/ Polyethylenglycol PE: Plyethylen Pư: Phản ứng Rf: Hệ số di chuyển ROS: Reactive oxygen species RSD: Relative standard deviation SD: Standard deviation SOD: Superoxide dismutase TLC: Thin-layer chromatography TNF-α: Tumor necrosis factor alpha TT: Thuốc thử UV: Ultra Violet DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU STT Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Tên bảng So sánh đặc điểm hình thái thực vật hai loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai Kết định tính nhóm hợp chất củ Kỳ nam kiến củ Kỳ nam gai Kết đo độ hấp thụ dãy chuẩn acid gallic Kết thẩm định độ thích hợp hệ thống phương pháp định lượng Polyphenol Trang 28 34 43 44 Bảng 3.5 Khối lượng cao toàn phần thu từ chiết xuất dược liệu 44 Bảng 3.6 Kết định lượng Polyphenol toàn phần hai mẫu 45 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Giá trị IC50 dịch chiết phân đoạn Kỳ nam kiến khả bắt giữ gốc tự DPPH Giá trị IC50 dịch chiết phân đoạn Kỳ nam gai khả bắt giữ gốc tự DPPH Giá trị IC50 dịch chiết phân đoạn từ Kỳ nam kiến khả bắt giữ gốc tự OH• Giá trị IC50 dịch chiết phân đoạn từ Kỳ nam gai khả bắt giữ gốc tự OH• Giá trị IC50 dịch chiết phân đoạn EtOH từ Kỳ nam kiến Kỳ nam gai khả tạo phức chelat với Fe2+ 46 48 49 50 51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Tên hình Đặc điểm hình thái Kỳ nam kiến (Hydnophytum formicarum Jack) Đặc điểm hình thái Kỳ nam gai (Myrmecodia tuberosa Jack) Hình ảnh dược liệu hai mẫu nghiên cứu (A Kỳ nam kiến, B Kỳ nam gai) Trang 27 27 31 Hình 3.4 Một số đặc điểm bột mẫu Kỳ nam kiến 32 Hình 3.5 Một số đặc điểm bột mẫu Kỳ nam gai 33 Sắc ký đồ dịch chiết cao toàn phần mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai triển khai với hệ dung môi: Cloroform - Methanol Hình 3.6 (9:1) quan sát ở: (1) UV 254nm; (2) UV 366nm; (3) Ánh sáng 37 thường sau phun thuốc thử vanilin/H2SO4 1%; (4) UV 366nm sau phun thuốc thử vanilin/H2SO4 1% Sắc ký đồ dịch chiết cao toàn phần mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai triển khai với hệ dung môi: Toluen – Cloroform – Hình 3.7 Aceton – Acid formic ( 40:25:35:0,1) quan sát ở: (1) UV 254nm; (2) UV 366nm; (3) Ánh sáng thường sau phun thuốc thử 38 anisaldehyd; (4): UV 366nm sau phun thuốc thử anisaldehyd; (5) UV 366nm sau phun thuốc thử NP/PEG Sắc ký đồ dịch chiết cao toàn phần mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai triển khai với hệ dung mơi: Ethylacetat – Methanol Hình 3.8 – Nước ( 77:15:8) quan sát ở: (1) UV 254nm; (2) UV 366nm; 39 (3) Ánh sáng thường sau phun thuốc thử anisaldehyd; (4) UV 366nm sau phun thuốc thử anisaldehyd Sắc ký đồ dịch chiết phân đoạn n-hexan mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai triển khai với hệ dung mơi: Cloroform - Methanol Hình 3.9 (9:1) quan sát ở: (l) UV 254nm; (2) UV 366nm; (3) Ánh sáng thường sau phun thuốc thử vanilin/H2SO4 1%; (4) UV 366nm sau phun thuốc thử vanilin/H2SO4 1% 40 Phụ lục 2: Phiếu giám định tên khoa học mẫu Kỳ nam gai Phụ lục 3: Định tính nhóm chất phản ứng hóa học  Định tính glycoside tim:  Mẫu nghiên cứu: Cân khoảng 10g mẫu nghiên cứu cắt nhỏ cho vào bình nón dung tích 250ml Thêm 100 ml cồn 25% ngâm 24 Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc có mỏ dung tích 100ml Nhỏ vài giọt dịch lọc vào ống nghiệm, thêm giọt chì acetat Nếu xuất tủa ngừng lọc, thêm tiếp chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại tiếp tục thử dịch lọc khơng cịn tủa với chì acetat Chuyển tồn dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml Chiết glycosid tim cách lắc với cloroform lần bình gạn, lần 8ml Gạn lớp cloroform vào cốc có mỏ sấy khơ Gộp dịch chiết chloroform, dịch chiết có lẫn nước lọc lại qua lớp Chia mẫu dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ sấy khô Đặt ống nghiệm lên giá bốc nồi cách thủy đến khô  Tiến hành: - Phản ứng khung steroid: Phản ứng Liebermann – Burchard Cho vào ống nghiệm 1ml anhydride acetic, lắc cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 1ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Phản ứng dương tính mặt tiếp xúc hai lớp chất lỏng xuất vòng màu tím đỏ, lớp chất lỏng phía có màu hồng, lớp có màu xanh - Phản ứng vòng lacton cạnh + Phản ứng Baljet Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to phần dung dịch acid picric 1% phần dung dịch NaOH 10% Lắc Cho vào ống nghiệm thử 0.5ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt thuốc thử Baljet pha vào ống nghiệm Phản ứng dương tính cho thuốc thử Baljet vào xuất màu đỏ cam So sánh với ống chứng ống có ethanol 90% thuốc thử Baljet ống thử có màu đỏ cam đậm ống chứng + Phản ứng Legal Cho vào ống nghiệm có chứa mẫu thử 0.5ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0.5% giọt dung dịch NaOH 10% Lắc Phản ứng dương tính xuất màu đỏ cam So sánh với ống chứng có ethanol 90%, thuốc thử natri nitroprussiat 0.5% giot dung dịch NaOH 10% ống thử có màu đỏ cam đậm ống chứng - Phản ứng phần đường 2,6 – desoxy + Phản ứng Keller – Kiliani Hòa tan cắn mẫu thử ống nghiệm 0.5ml ethanol 90% Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha acid acetic Lắc Nghiêng ống nghiệm 45 Cho tử từ theo thành ống 0.5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Phản ứng dương tính mặt tiếp xúc lớp chất lỏng xuất vịng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía có màu xanh  Định tính saponin  Mẫu nghiên cứu: Cân khoảng 1g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm khoảng 20ml ethanol 30%, đun cách thủy phút lọc nóng qua bơng Cho dịch chiết vào cốc có mỏ, bốc hơ dung môi nồi cách thủy khoảng 5ml Dịch chiết để tiến hành làm thí nghiệm  Tiến hành: - Quan sát tượng tạo bọt Lấy 10 giọt dịch chiết cho vào ống nghiệm lớn có sẵn 5ml nước Dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm lắc mạnh theo chiều đứng ống nghiệm khoảng phút Để yên quan sát tượng tạo bọt Phản ứng dương tính có cột bọt xuất bền vững sau 15 phút - Phản ứng Liebermann – Burchard Lấy 3ml dịch chiết cho vào chén sứ, cách thủy đến cắn, để nguội Hịa tan cắn hỗn hợp gồm 1ml anhydrid acetic 1ml cloroform, lọc nhanh qua lấy dịch cho vào ống nghiệm khô Để nghiêng ống nghiệm, dùng pipet hút khoảng 1ml acid sulfuric đậm đặc cho chảy nhẹ nhàng dọc theo thành ống nghiệm, không lắc ống nghiệm Phản ứng dương tính mặt ngăn cách lớp chất lỏng có màu nâu đỏ, đỏ tím hay tím; lớp dung dịch phía có màu xanh lá, xanh rêu hay nâu đỏ  Định tính anthranoid  Định tính anthranoid tồn phần - Mẫu nghiên cứu: Cân 1g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 10ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun trực tiếp nguồn nhiệt đến sơi Lọc dịch chiết cịn nóng qua giấy lọc qua lớp bơng mỏng vào bình gạn dung tích 50ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5ml cloroform Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước, lấy lớp cloroform để làm phản ứng - Tiến hành: Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính lớp kiềm có màu đỏ sim  Định tính anthranoid dạng tự - Mẫu nghiên cứu: Cân g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm cloroform cho thấm ngập dược liệu khoảng cm, lắc kỹ khoảng 15 phút, gạn lọc dịch chiết Tiếp tục chiết ( 3-5 lần) hết dạng anthranoid tự Gộp dịch chiết cloroform Bã dược liệu giữ lại để định tính dạng kết hợp - Tiến hành: Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính lớp kiềm có màu đỏ sim  Định tính anthranoid dạng kết hợp - Mẫu nghiên cứu: Lấy bã dược liệu mục để khô dung môi, cho vào bình nón Thêm khoảng 10ml acid sulfuric 1N, đun trực tiếp nguồn nhiệt đến sôi Lọc dịch chiết cịn nóng qua giấy lọc qua lớp bơng mỏng cho vào bình gạn dung tích 50ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5ml cloroform, lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước, lấy dịch chiết cloroform để làm phản ứng - Tiến hành: Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính lớp kiềm có màu đỏ sim  Định tính flavonoid  Mẫu nghiên cứu: Cân khoảng 0.5g dược liệu cho vào bình nón Thêm 10ml ethanol 90%, đun cách thủy sôi 3-5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp thu dịch lọc Dịch lọc thu để làm phản ứng định tính  Tiến hành: - Phản ứng với dung dịch kiềm Cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính xuất kết tủa màu vàng Thêm khoảng 1-2ml nước cất tủa tan màu vàng dung dịch tăng thêm - Phản ứng với amoniac Nhỏ 2-3 giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc, để khô đặt lên miệng lọ amoniac đặc mở nút Phản ứng dương tính thấy màu vàng vết dịch chiết tăng lên - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% Cho ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% lắc Phản ứng dương tính xuất kết tủa màu xanh đen - Phản ứng Cyanidin ( Phản ứng Shinoda) Cho ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm khoảng 10mg bột magnesi kim loại, nhỏ giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt) Để yên Phản ứng dương tính dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ - Phản ứng với thuốc thử Diazo Cho ml dịch lọc vào ống nghiệm, kiềm hóa dung dịch kiềm, thêm vài giọt thuốc thử Diazo pha, lắc Phản ứng dương tính xuất màu đỏ  Định tính coumarin  Mẫu nghiên cứu: Cân khoảng 2g dược liệu cho vào bình nón 50ml Thêm 10ml ethanol 90%, đun cách thủy sôi 3-5 phút Lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp thu dịch lọc Dịch lọc thu để làm phản ứng định tính  Tiến hành: - Phản ứng đóng mở vòng lacton: Lấy ống nghiệm đánh số thứ tự 1-2 Cho vào ống nghiệm ống 1ml dịch lọc + Ống 1: Thêm 0.5ml dung dịch NaOH 10% + Ống 2: Để nguyên Đun ống nghiệm đến sôi Để nguội quan sát: + Ống 1: Xuất tủa đục + Ống 2: Trong suốt Thêm vào ống nghiệm, ống 2ml nước cất Lắc quan sát: + Ống 1: Trong suốt + Ống 2: Xuất tủa đục Acid hóa ống vài giọt HCl đặc, ống xuất tủa đục ( Phản ứng dương tính) - Phản ứng với thuốc thử Diazo Cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm 2ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi, để nguội Nhỏ từ từ giọt thuốc thử Diazo pha Phản ứng dương tính xuất màu đỏ cam - Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans Nhỏ vài giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc Nhỏ tiếp vào vài giọt dung dịch NaOH 5% Sấy cho khơ Che phần diện tích dịch chiết giấy lọc miếng kim loại chiếu ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nmtrong khoảng phút Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp đèn tử ngoại thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng phần bị che Tiếp tục chiếu ánh sáng tử ngoại, sau vài phút phần có huỳnh quang sáng sau  Định tính tanin  Mẫu nghiên cứu: Cân 1g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm 20ml nước cất, đun sôi 2-3 phút Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp thu lấy dịch lọc để làm phản ứng định tính  Tiến hành: - Phản ứng với dung dịch gelatin 1% Lấy 2ml dịch lọc, thêm giọt dung dịch gelatin 1% Phản ứng dương tính xuất tủa bơng trắng - Phản ứng với muối kim loại + Lấy 2ml dịch lọc, thêm giọt dung dịch FeCl3 5% Phản ứng dương tính xuất tủa màu xanh đen nâu nhạt + Lấy ml dịch lọc, thêm giọt dung dịch chì acetat 10% Phản ứng dương tính xuất tủa bơng  Định tính alkaloid  Mẫu nghiên cứu: Cân khoảng 1g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm 10ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun đến sôi Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp Dịch lọc kiềm hóa dung dịch amoniac 6N đến pH=9-10 (thử giấy quỳ thị vạn năng) Chuyển dịch lọc kiềm hóa vào bình gạn, chiết cloroform lần ( lần x 10ml, lần x 5ml) Gộp dịch chiết cloroform, loại nước natri sulfat khan lắc với acid sulfuric 1N ( lần x 5ml/lần) Gạn lấy dịch chiết acid Mỗi mẫu dược liệu cho vào ống nghiệm khoảng 1ml dịch chiết để tiến hành làm phản ứng định tính  Tiến hành: - Ống 1: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer Phản ứng dương tính xuất tủa màu trắng đến vàng - Ống 2: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat Phản ứng dương tính xuất kết tủa nâu đến đỏ nâu - Ống 3: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Phản ứng dương tính xuất tủa màu vàng cam đến đỏ  Định tính acid hữu cơ, đường tự do, polysaccharid  Mẫu nghiên cứu: Lấy 10g dược liệu cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml nước cất, đun sơi 10 phút qua lưới amiang, lọc nóng dịch chiết qua Dịch lọc đem làm phản ứng định tính  Tiến hành: - Định tính acid hữu Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm Để nguội, thêm vào tinh thể Na2CO3 Phản ứng dương tính thấy có bọt khí bay lên - Định tính đường tự Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm Thêm 0.5ml thuốc thử Fehling A 0.5ml thuốc thử Fehling B, đun cách thủy vài phút Phản ứng dương tính xuất kết tủa đỏ gạch - Định tính polysaccharid Ống nghiệm 1: Lấy 4ml dịch lọc thêm giọt thuốc thử lugol, dùng ngón tay bịt đầu ống nghiệm, lắc nhẹ nhàng cho thuốc thử trộn Ống nghiệm ( Ống chứng): Lấy 4ml nước cất có thêm giọt thuốc thử lugol Bịt đầu ống nghiệm lắc nhẹ nhàng cho thuốc thử trộn Phản ứng dương tính ống nghiệm màu đỏ đậm ống nghiệm  Định tính thành phần khác ether dầu hỏa  Mẫu nghiên cứu Lấy 10g dược liệu cho vào bình nón 50ml Đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm lọc Dịch lọc đem để tiến hành phản ứng định tính  Tiến hành - Định tính chất béo: Nhỏ vài giọt dịch chiết vào giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung mơi Phản ứng dương tính giấy lọc có vết mờ - Định tính sterol Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Bốc dung môi đến cắn, thêm ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ 1ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính xuất vịng màu đỏ tím mặt ngăn cách lớp chất lỏng, lớp dung dịch phía có màu xanh - Định tính Carotenoid Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống ngiệm, bốc dung môi đến cắn Cho từ từ H2SO4 đặc vào Phản ứng dương tính dung dịch thu có màu xanh  Định tính Iridoid glycosid  Mẫu nghiên cứu: Lấy 2g dược liệu cắt nhỏ, cho vào ống nghiệm Thêm 5ml HCl 1%, lắc Sau vài gạn lấy dịch chiết  Tiến hành: Thuốc thử Trim-Hill: 10ml acid acetic + 1ml CuSO4 0.2% + 0.5ml HCl 1% Lấy 0.1ml dịch chiết trên, thêm 1ml thuốc thử Trim-Hill vào, đun nóng Phản ứng dương tính xuất màu xanh dương màu tím đỏ Phụ lục 4: Hình ảnh kết khảo sát cực đại hấp thụ chuẩn acid gallic Phụ lục 5: Hình ảnh kết đo độ hấp thụ dãy chuẩn acid gallic Phụ lục 6: Hình ảnh kết định lượng Polyphenol toàn phần ... khác hai loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 2.3.2 Đánh giá tác dụng dọn gốc tự in vitro phần thân củ phình to loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai  Tác dụng dọn gốc tự in vitro hai loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai đánh. .. lồi Kỳ nam kiến Kỳ nam gai, đề tài: ? ?Phân biệt đánh giá tác dụng dọn gốc tự in vitro hai loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai? ?? thực với mục tiêu sau: Phân biệt hai loài Kỳ nam kiến Kỳ nam gai dựa đặc... mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai .42 3.2 So sánh tác dụng dọn gốc tự mẫu Kỳ nam kiến Kỳ nam gai 45 3.2.1 Đánh giá khả dọn gốc tự DPPH 45 3.2.2 Đánh giá khả dọn gốc tự OH• 48 3.2.3 Đánh