Đang tải... (xem toàn văn)
Giáo trình Công nghệ sinh học trong Bảo vệ thực vật cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản về các loại dịch hại trên cây trồng và những tiến bộ hiện nay trong bảo vệ cây trồng nhờ ứng dụng các biện pháp sinh học phân tử. Sau khi kết thúc môn học, sinh viên có khả năng suy luận đánh giá kết quả của các mối tương tác đa chiều trong tự nhiên dựa theo quan hệ ký sinh – ký chủ - môi trường – con người và chọn lựa phương pháp tiếp cận nghiên cứu các khía cạnh liên quan đến bảo vệ cây trồng. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 2 giáo trình.
Chương THÀNH TỰU CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT NN405-3 Mục tiêu: giúp sinh viên biết thành tựu công nghệ sinh học BVTV Trong thập kỷ qua, nhờ thành tựu to lớn công nghệ gen, người ta chuyển thành công gen phân lập từ sinh vật vào sinh vật khác để tạo thể biến đổi gen mang đặc tính mong muốn Sản phẩm biến đổi gen đem lại lợi nhuận kinh tế khổng lồ cho nhiều quốc gia Ở Mỹ, có tới 1.300 cơng ty Cơng nghệ sinh học với doanh thu hàng năm đạt khoảng 12,7 tỷ la Trong số sản phẩm tạo (có liên quan đến biến đổi gen), sản phẩm y dược chiếm tới 75%, sản phẩm nông nghiệp chiếm 3% Tuy nhiên, đầu tư mở rộng quy mô nghiên cứu khai thác sản phẩm nông nghiệp biến đổi gen ngày tăng Năm 1996, toàn giới có 1,7 triệu trồng biến đổi gen, đến năm 2004 diện tích trồng biến đổi gen toàn cầu tăng lên gần 48 lần, đạt tới 81 triệu ha, 1/3 diện tích nước phát triển Hiện nay, có khoảng 20 quốc gia sản xuất trồng biến đổi gen với diện tích từ 50.000 trở lên Mỹ quốc gia hàng đầu trồng biến đổi gen với diện tích năm 2004 47,6 triệu (chiếm 59%) Tiếp đến Argentina: 16,2 triệu (20%), Canada: 5,4 triệu (6,7), Brazil: triệu (6%), Trung Quốc: 3,7 triệu (4,6%) Ở châu Á, trồng biến đổi gen chủ yếu bông, trồng nhiều Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines Indonesia (trích từ Trần Thị Lệ, 2006) Có loại trồng biến đổi gen thương mại hóa mạnh Đó là: đậu tương kháng thuốc diệt cỏ đạt đến diện tích 48,4 triệu (chiếm 60% tổng diện tích trồng biến đổi gen năm 2004), ngô kháng thuốc diệt cỏ kháng sâu đạt diện tích 19,3 triệu (chiếm 24%), kháng thuốc diệt cỏ kháng sâu đạt diện tích triệu (chiếm 11%) cải dầu kháng thuốc diệt cỏ đạt diện tích 4,3 triệu (chiếm 5%) Nếu so sánh diện tích trồng biến đổi gen với tổng diện tích trồng loại quy mơ tồn cầu đậu tương biến đổi gen chiếm 56%, biến đổi gen chiếm 28%, cải dầu biến đổi gen chiếm 19% ngô biến đổi gen chiếm 14% Ngoài loại trồng biến đổi gen thương mại hóa rộng rãi nói trên, cịn có hàng loạt trồng biến đổi gen khác kháng nấm, kháng virus, chín chậm phổ biến (trích từ Trần Thị Lệ, 2006) 29 Hình 3.1 Tỷ lệ (%) loại biến đổi gen đưa vào sản xuất Thực vật biến đổi gen mang lại đặc tính tốt cho trồng Cho đến gen chuyển vào thực vật nhiều gen kháng thuốc diệt cỏ kháng trùng Vì vậy, làm giảm lượng đáng kể thuốc diệt cỏ trừ sâu sử dụng nông nghiệp 3.1 Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ Trong sản xuất nơng nghiệp có tính chun mơn hóa cao việc sử dụng loại thuốc diệt cỏ dại điều cần thiết nhằm đảm bảo suất trồng Tuy nhiên, việc lạm dụng số thuốc diệt cỏ có độc tính cao gây hậu nghiêm trọng môi trường, hệ sinh thái sức khỏe người Gần đây, người ta tổng hợp số hợp chất tồn tự nhiên thời gian ngắn, lại tiêu diệt toàn cối Các hợp chất gọi thuốc diệt cỏ không chọn lọc Bằng phương pháp sử dụng đột biến, người ta phân lập số gen tạo cho trồng có khả kháng loại thuốc diệt cỏ nói Việc chuyển gen vào nâng cao tính chọn lọc hiệu kinh tế thuốc diệt cỏ làm giảm ảnh hưởng thuốc quần thể sinh vật đất Thật vậy, chưa có loại trồng biến đổi gen kháng thuốc không chọn lọc, người ta phải phun nhiều lần trước gieo hạt nhằm loại bỏ hoàn toàn mầm mống cỏ dại Nhưng người nông dân gieo trồng loại biến đổi gen họ đợi cho trồng cỏ dại phát triển đến mức độ định, tiến hành phun thuốc lần đảm bảo loại bỏ xâm lấn cỏ dại Đồng thời việc phun thuốc mà trồng phát triển làm giảm thuốc diệt cỏ thấm vào đất, làm giảm nguy gây hại môi trường Kháng thuốc diệt cỏ nhân tạo đặc điểm thường sử dụng nhiều thực vật biến đổi gen Điều có nhiều nguyên nhân: - Thứ tạo thực vật biến đổi gen loại tương đối đơn giản - Thứ hai, cỏ dại vấn đề lớn nông nghiệp, làm giảm suất từ 1015% Về phân biệt loại thuốc diệt cỏ chọn lọc với loại không chọn lọc Ở liều lượng định loại kháng chọn lọc có tác dụng thực vật có đặc điểm sinh lý hình thái định Ví dụ: thuộc nhóm gồm có: atrazin, bromoxynil, 2,4-D Tác dụng thuốc diệt cỏ chọn lọc: Atrazin: Làm ngừng vận chuyển điện tử hệ thống quang hóa II lục lạp (cần thiết quang hợp thực vật) Ngô không mẫn cảm với atrazin Bromoxynil: Đình vận chuyển điện tử hệ thống quang hóa II lạp thể, làm chết hai mầm Glyphosate (Round upR): Làm ngừng hoạt động enzyme EPSP-synthase qua kìm hãm tổng hợp amino acid thơm Phosphinothricin (PPT) gọi Basta: PPT đồng phân dạng L sản phẩm tổng hợp glufosinate PPT có cấu trúc tương tự glutamic acid, gắn không thuận nghịch với enzyme glutamatsynthase, gây độc tích lũy NH3 2,4-D: Auxin tổng hợp gây hại cho phát triển hai mầm, phần lớn mầm không mẫn cảm 30 Một số loại thuốc diệt cỏ chọn lọc tồn lâu đất, làm nhiễm nguồn nước Ngược lại, thuốc diệt cỏ không chọn lọc glyphosate phosphinothricin (PPT) độc tất trồng Ưu điểm hai loại thuốc diệt cỏ phân giải nhanh đất thành chất không hại Thời gian bán hủy Basta đất 10 ngày Round up từ đến 60 ngày Thời gian bán hủy khoảng thời gian mà 50% chất bị biến đổi phân giải Để sản xuất chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, người ta cần gen kháng mã hóa cho protein, protein làm bất hoạt thuốc diệt cỏ, thay đổi vị trí tác động thuốc tế bào, làm thuốc khơng cịn gây hại Cơ chế kháng thuốc diệt cỏ không chọn lọc Basta glyphosate giải thích sau: Basta thuốc diệt cỏ không chọn lọc sử dụng 50 quốc gia, sử dụng có giới hạn, gây độc trồng cỏ dại Gần đây, nhiều loại trồng biến đổi gen tạo nên thử nghiệm 100 thí nghiệm đồng ruộng, nhiều loại đưa thị trường Những gen kháng phân lập từ vi sinh vật từ thực vật kháng tự nhiên Từ linh lăng thảo (Medicago sativa) gen không mẫn cảm với Basta phân lập từ vi khuẩn đất Streptomyces hygroscopius S viridochromogenes gen bar pat phân lập, gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin-acetyltransferase Enzyme làm độc tính thuốc acetyl hóa, gắn vào gốc acetyl Để sử dụng cho thực vật, gen từ vi khuẩn biến đổi điều khiển promoter CaMV 35S nhằm đạt biểu gen thường xuyên tất mô Bằng cách linh lăng thảo, cà chua, ngô, lúa, lúa mỳ đậu tương kháng thuốc diệt cỏ tạo nên Thuốc diệt cỏ glyphosate đình đặc hiệu enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3phosphate-synthase (EPSP-synthase) Đây enzyme cần thiết thực vật để tổng hợp amino acid thơm (phenylalanin, tryptophan tyrosin), số vitamin hợp chất có nguồn gốc thứ cấp Enzyme khơng có người động vật, glyphosate khơng độc người Glyphosate phân giải đất nhờ vi sinh vật không để lại sản phẩm độc hại Kháng glyphosate chế khác nhau: - Thứ có biểu mạnh mẽ enzyme EPSP-synthase điều khiển promoter CaMV-35S đồng thời tạo nên enzyme oxidoreductase vi khuẩn Nhờ enzyme oxidoreductase mà thuốc bị bất hoạt với lượng lớn EPSP-synthase tạo nên lượng thuốc cịn lại khơng thể gây hại biến đổi gen (Hình 3.2) Ở gen cần thiết, gen oxidoreductase khơng có thực vật 31 Hình 3.2 Hiệu kháng thuốc diệt cỏ sau 15 ngày phun thuốc Một khả thứ hai sử dụng EPSP-synthase vi khuẩn Từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (loài CP4), EPSP-synthase vi khuẩn phân lập thay đổi trình tự amino acid nên enzyme khơng cịn mẫn cảm với glyphosate sử dụng nhiều trồng thương mại Thứ ba xuất dạng đột biến EPSP-synthase trồng có khả kháng glyphosate (Hình 3.3) Tính kháng khơng chọn lọc sử dụng nhiều trồng biến đổi gen, bông, khoai tây, ngơ, đậu tương, thuốc lúa mì Bằng việc sử dụng trồng kháng thuốc diệt cỏ, lượng thuốc diệt cỏ sử dụng giảm đáng kể, thuốc dùng theo yêu cầu phạm vi nhỏ Hình 3.3 Đột biến xảy EPSP-synthase làm cho kháng thuốc diệt cỏ glyphosate Sự kết hợp glyphosate vào enzyme EPSP-synthase loại hình bình thường làm hoạt tính xúc tác hạn chế di chuyển enzyme vào lục lạp Dạng EPSP*-synthase (mã hóa ShkG*-dạng đột biến) có hoạt tính thấp với glyphosate thể hoạt tính có mặt thuốc diệt cỏ 32 Năm 1996 1997 Mỹ, sử dụng kháng thuốc diệt cỏ làm giảm lượng thuốc dùng tương ứng 26% 22% Rửa trôi đất giảm 90%, đất cày sâu, đồng thời suất tăng lên 5% Một vấn đề khó khăn việc sử dụng biến đổi gen lan truyền tính kháng qua hạt phấn đến họ hàng Để giải vấn đề việc tạo biến đổi gen dựa vào thay đổi gen lạp thể Vì gen lạp thể phần lớn thực vật di truyền theo tế bào chất, tính kháng thuốc diệt cỏ khơng thể lan truyền qua hạt phấn EPSP-synthase hoạt động lạp thể Nhưng gen mã hóa cho enzyme lại có mặt nhân Protein dịch mã ribosome tế bào chất có trình tự đích lạp thể nên vận chuyển vào quan tử Cây thuốc kháng glyphosate tạo nên cách biến nạp gen mã hóa cho EPSP-synthase có nguồn gốc từ dã yên thảo Gen chèn vào DNA lạp thể Lạp thể có ribosome nên tổng hợp trực tiếp EPSP-synthese Bằng cách việc vận chuyển gen qua hạt phấn phần lớn trồng không xảy 33 3.2 Kháng côn trùng gây hại Các tổn thất trước thu hoạch gây loại sâu phá hoại nguyên nhân chủ yếu làm giảm suất trồng, đặc biệt nước nhiệt đới có nhiệt độ cao, ẩm độ lớn, thích hợp cho phát triển sâu bệnh nước ta Côn trùng gây hại trồng hai khía cạnh: - Thứ gián tiếp truyền tác nhân gây bệnh khác virus, vi khuẩn nấm - Thứ hai trực tiếp ăn hại quan trồng Biện pháp hữu hiệu sử dụng rộng rãi phun thuốc trừ sâu hóa học Việc sử dụng thuốc trừ sâu làm ảnh hưởng đến mơi trường sinh thái, dư lượng cịn lại tích lũy chuỗi thức ăn mặt khác thuốc trừ sâu gây độc không đặc hiệu tất động vật Vì vậy, phát triển trồng chuyển gen kháng sâu có ý nghĩa lớn Ở đề cập đến loại toxin tự nhiên, tạo vi khuẩn Bacillus thuringensis gây hại số lồi trùng định, khơng hại động vật khác người Toxin gọi Bt-toxin B thuringensis vi khuẩn đất tạo bào tử Ở trình tạo bào tử xuất vỏ tinh thể chứa -endotoxin Ở loài B thuringensis khác người ta xác định 100 loại toxin khác nhau, protein với khối lượng phân tử khoảng 130 kDa Trong ruột côn trùng -endotoxin biến đổi thành dạng độc tố hoạt động tích lũy tế bào thượng bì ruột Việc tạo bào tử màng dẫn đến phân giải thẩm thấu tế bào làm cho côn trùng chết Trong nông nghiệp sinh thái vi khuẩn B thuringensis phun trực tiếp đồng ruộng Tuy nhiên, số trồng, việc phun thuốc trừ sâu Bt đơi hiệu đặc tính hình thái trồng thời điểm cần phun thuốc Ví dụ: ngơ loại trùng phá hoại sâu đục thân Ostrinia nubilalis Để phòng trừ loại sâu này, người ta phun thuốc vào thời điểm sâu bắt đầu nở Nhưng đặc tính khí hậu số vùng, thời điểm sâu bắt đầu nở rơi vào lúc phát triển Điều ngăn cản thuốc trừ sâu Bt tới mô, phận mà sâu đục thân phá hoại Mặt khác, thuốc trừ sâu Bt dễ phân hủy môi trường tự nhiên, đặc biệt ánh sáng mặt trời chứa nhiều tia cực tím Do vậy, vùng thích hợp cho phát triển sâu đục thân, khiến cho thời kỳ sinh sản sâu kéo dài, người nông dân phải phun thuốc nhiều lần tốn Bắt nguồn từ hạn chế việc phun thuốc trừ sâu Bt, nhà khoa học chuyển gen Bt vào nhiều loại trồng Lúc này, chuyển gen Bt có khả sinh tổng hợp trực tiếp loại thuốc trừ sâu sinh học Điều giúp cho việc phòng trừ trở nên hiệu giảm chi phí mua thuốc trừ sâu cho người nơng dân 34 Hình 3.4 Cây ngơ biến đổi gen, tạo Bt-endotoxin (phía trên) ngơ bình thường bị nhiễm sâu hại (phía dưới) Gen mã hóa cho Bt-toxin biến đổi cho phù hợp với thực vật, đưa vào trồng khác bông, ngô, khoai tây cà chua chuyển gen sản xuất thương mại biểu độc tố Βt để tạo tính kháng côn trùng loại nhai-nghiền (chewing insects) Vi khuẩn B thuringensis tổng hợp protein endotoxin tinh thể mã hóa gen Cry Người ta phân biệt nhóm endotoxin (CryI đến CryIV), tùy thuộc độc với loài sâu nào, Lepidoptere (bướm, CryI), Lepidoptere Diptere (ruồi muỗi, CryII), Coledoptere (côn trùng cánh cứng, Cry III) Diptere (Cry IV) Sau nhiều thí nghiệm đồng ruộng loại trồng chứa gen Bt có mặt thị trường với kết tốt Ví dụ: với việc sử dụng ngơ chứa gen Bt năm 1996 1997 làm giảm lượng thuốc trừ sâu cho ngô Mỹ 10%, suất tăng lên 9%, chứa gen Bt suất tăng 7% 60% nơng dân loại bỏ hồn tồn thuốc trừ sâu Một số ưu điểm độc tố Bt sau : - Tính đặc hiệu, protein Cry hoạt động chống lại một vài lồi trùng - Sự đa dạng, nhiều protein Cry khác nhận biết - Các ảnh hưởng không bất lợi bị giảm xác nhận trùng khơng phải đích địch thủ tự nhiên trùng - Độc tính với động vật có vú thấp - Có thể thối biến dễ dàng Kết nghiên cứu cho thấy điểm mấu chốt gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein tinh thể trừ sâu vi khuẩn B thuringensis chủng kurstaki, chưa đặc biệt biểu rõ trồng Để nâng cao hiệu độc tố, nhà nghiên cứu cắt gọt bớt 35 gen để tổng hợp phần protein có hoạt tính chứa độc tố mà không cần phần gen phụ khác Gen Cry cắt bớt biểu tổng hợp protein gấp 500 lần so với gen nguyên thủy Hiện nay, 40 gen khác mang tính kháng trùng hợp trồng chuyển gen với vài giống thương mại hóa nước Mỹ, Úc… Lợi ích độc tố Bt kiểm sốt trùng buộc phải có phương thức quản lý khác để làm chậm phát triển tính kháng trùng Βt, bao gồm : - Bố trí vùng bên cạnh trồng không chuyển gen Bt, làm nơi trú ẩn để giảm áp lực chọn lọc hướng tới việc kháng côn trùng - Triển khai gen kháng trùng khác (Ví dụ: protease inhibitors) - Dùng loại độc tố Bt cho receptor đích khác - Dùng promoter khác để điều chỉnh biểu gen Bt - Dùng promoter đặc trưng mô (tissue-specific promoter), côn trùng ăn mà khơng tổn hại đến kinh tế phận quan trọng thực vật - Có hướng khác để phát triển tính kháng côn trùng cho chuyển gen dựa sở: protease inhibitors, -amylase, lectins, chitinases, cholesterol oxidase, virus trùng tạo dịng, tryptophan decarboxylase, anti-chymotrypsin, bovine pancreatic trypsin inhibitor nhân tố ức chế lách Dĩ nhiên Bt-toxin không độc cho tất trùng tự nhiên ln có khả xuất lồi sâu kháng Vì vậy, phải có chiến lược tiếp tục tạo loại trồng kháng Đặc biệt hứa hẹn chất ức chế serin-protease, kìm hãm enzyme tiêu hóa quan trọng trùng Những trồng chứa lượng lớn protein có tác dụng bảo vệ trước phá hoại sâu hại Ngoài ra, nhiều phương pháp khác thử nghiệm Về nguyên tắc phương pháp dựa việc sử dụng protein có tự nhiên đặc hiệu gây hại cho côn trùng Điều đặc biệt có ý nghĩa lương thực thực phẩm khơng chứa chất độc gây hại cho người tiêu dùng 3.3 Kháng virus gây bệnh Tương tự vi khuẩn, động vật người; thực vật tồn số lượng lớn virus Ngồi ra, thực vật cịn gọi viroide Virus chứa vỏ protein có màng lipid Vật chất di truyền virus DNA RNA Viroide khơng có vỏ protein màng mà có phân tử RNA dạng vịng nhỏ Sự tái sinh virus viroide hồn tồn phụ thuộc vào trao đổi chất ký chủ Theo quy ước quốc tế tên virus gọi theo tên thực vật mà loại virus tìm ra, sau đến triệu chứng thêm từ virus (ví dụ: thuốc lákhảm-virus: tobacco-mosaic-virus) Virus thực vật cần sinh vật khác để truyền từ sang khác Ở phần lớn nhờ côn trùng, chúng mang virus gọi vector Virus thường coi tác nhân gây bệnh nguy hiểm Tuy nhiên, quan niệm khơng hồn tồn xác, phân tích phần hệ gen thực vật cho thấy, trồng hoang dại tồn số lượng lớn loại virus, chúng phần 36 lớn khơng gây hại Ngồi ra, virus thực vật virus người động vật Chỉ có số lồi virus gây thiệt hại lớn cho mùa màng Ví dụ lồi virus tạo nhiều rễ nhỏ củ cải đường số vùng lớn Đức gây thiệt hại đến 75% Triệu chứng thực vật sau virus xâm nhiễm (thay đổi màu, dạng chết) đa dạng phụ thuộc vào yếu tố môi trường Ngược lại, virus thực vật có cấu tạo đơn giản, chúng gồm vỏ protein đơn giản bên vỏ chứa nucleic acid mang gen khác Phần lớn virus chứa gen mã hóa cho vỏ protein, cho chép thơng tin di truyền (từ DNA RNA) gen cho di chuyển bên thực vật từ tế bào đến tế bào khác Thường tồn chủng virus họ hàng với mức độ gây bệnh khác Có chủng khơng gây triệu chứng, có độc tính thấp, có chủng gây triệu chứng hại nặng, gọi virus có độc tính cao Đã lâu người ta biết rằng, tiêm chủng trước với lồi virus độc tính yếu xuất tính miễn dịch lồi virus họ hàng độc tính mạnh Sự tái sinh virus bị ngừng giảm mạnh, gọi bảo vệ chéo (cross protection) (Hình 3.5) Người ta lợi dụng hiệu để tạo biến đổi gen kháng virus Đầu tiên gen mã hóa cho protein vỏ virus đưa vào thực vật biểu điều khiển promoter CaMV 35S Thực tế cho thấy sau nhiễm virus không xuất triệu chứng Theo chế tính kháng với nhiều loại virus khác tạo nên Nhiều phương thức sử dụng để kiểm soát xâm nhiễm virus bao gồm xử lý hóa học để giết vector virus, chuyển vào trồng gen kháng tự nhiên từ loài liên quan, sử dụng phương pháp chẩn đoán đại PCR đưa dẫn thích hợp để đảm bảo nhân giống vật liệu khởi đầu virus (ví dụ: hạt, củ…) 37 Hình 3.5 Thí nghiệm bảo vệ chéo Bên trái: Cây thuốc xử lý với TMV yếu, sau lây nhiễm với TMV độc tính kết không gây bệnh Ở giữa: Cây thuốc không xử lý với TMV yếu, xuất triệu chứng bệnh sau xử lý với TMV độc tính Bên phải: Cây biến đổi gen, chứa gen mã hóa cho protein vỏ TMV, kháng lây nhiễm Tuy nhiên, phương pháp chủ yếu để khắc phục tình trạng khai thác tính kháng xuất phát từ tác nhân gây bệnh Chẳng hạn, sử dụng trình tự có nguồn gốc từ virus biểu chuyển gen để tạo tính kháng virus thực vật Hướng dựa sở nghiên cứu gây nhiễm (inoculation) hay xâm nhiễm (infection) thực vật, khởi đầu với chủng virus nhẹ tạo khả bảo vệ chống lại gây nhiễm với chủng virus virus có liên quan gần gũi Tính kháng bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh cần biến nạp thực vật với trình tự có nguồn gốc từ virus Tính kháng vật chủ xuất từ hai chế khác nhau: (1) Sự bảo vệ dàn xếp thông qua biểu protein virus tự nhiên biến đổi (ví dụ: protein vỏ, replicase, replicase khiếm khuyết) (2) Sự bảo vệ dàn xếp mức độ phiên mã (RNA-mediated resistance), đòi hỏi phiên mã RNA từ trình tự hồn chỉnh phần có nguồn gốc từ virus đích (bao gồm gen cho protein vỏ, replicase, replicase khiếm khuyết, protease, protein vận động…) Một đường hướng khác tạo trồng kháng dựa việc sử dụng gen kháng (các gen R) tồn số thực vật tự nhiên Những gen kháng xuất 38 Sơ đồ bố trí mạch máy xung điện Sơ đồ cho thấy mạch điện cung cấp điện cho kỹ thuật xung điện Khi công tắc thứ đóng, tụ điện nạp điện vào tích điện áp cao Khi cơng tắc thứ hai đóng, điện áp phóng qua dịch huyền phù tế bào Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật thường khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước tế bào) vài phần triệu giây đến phần ngàn giây Xung điện làm rối loạn phospholipid kép màng tế bào tạo lỗ tạm thời Khả điện qua màng tế bào lúc tăng lên 0,5-1,0 v phân tử nạp điện qua màng tế bào thông qua lỗ cách thức tương tự điện di (Hình dưới) Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai qua lỗ tạm thời màng bào chất Lối DNA vào tế bào quan sát thấy kính hiển vi, hình vẽ cho thấy khái niệm tạo thành lỗ màng mà DNA qua Khi ion nạp điện phân tử qua lỗ, màng tế bào phóng điện lỗ đóng lại cách nhanh chóng phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ (Weaver, 1995) Lúc phân tử mong muốn tế bào chúng sử dụng cho nghiên cứu Phương pháp sử dụng gần tất loại tế bào loài Lúc đầu phương pháp sử dụng để chuyển gen vào tế bào động vật có 52 vú, sau cho tế bào thực vật dạng protoplast Với số mầm quan trọng (lồi lúa phụ Japonica, ngơ, lúa mì) mà thể thực phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium người ta thành công với phương pháp Hiệu biến nạp cao Trong nghiên cứu E.coli, 80% số tế bào nhận DNA ngoại lai (Miller Nickoloff, 1995) Lượng DNA ngoại lai cần thiết so với phương pháp khác (Withers, 1995) Phương pháp thực với mơ in vivo cịn nguyên vẹn (Weaver, 1995) Ðoạn DNA ngoại lai biến nạp có kích thước lớn Tuy nhiên xung điện có cường độ chiều dài khơng số lỗ tế bào trở nên lớn bị hỏng khơng thể đóng lại sau tế bào phóng điện, làm cho tế bào bị tổn thương bị thủng (Weaver, 1995) Một hạn chế vận chuyển DNA ngoại lai vào khỏi tế bào suốt thời gian điện biến nạp tương đối không đặc hiệu Ðiều dẫn đến kết khơng cân ion mà sau làm rối loạn chức tế bào tế bào chết (Weaver, 1995) Kỹ thuật xung điện sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác sinh học phân tử y học Các ứng dụng kỹ thuật xung điện bao gồm: - Biến nạp DNA: gen đặc hiệu tạo dịng plamid sau plasmid đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc chức gen protein - Chuyển plasmid trực tiếp tế bào: tế bào vi khuẩn chứa plasmid ủ với dịng khác khơng mang plasmid lại có đặc tính mong muốn khác Ðiện áp xung điện tạo lỗ, cho phép số plasmid khỏi tế bào lại vào tế bào khác Sau tế bào mong muốn chọn lọc tính kháng thuốc kháng sinh phương pháp tương tự khác (Withers, 1995) Kiểu chuyển gen thực lồi khác Vì vậy, lượng lớn plasmid sinh trưởng khuẩn lạc vi khuẩn nhân lên cách nhanh chóng sau chuyển vào tế bào nấm men kỹ thuật xung điện để nghiên cứu (Gunn, 1995) - Dung hợp tế bào kích thích: tạo thành lỗ thủng màng xảy xung điện chớp nhống tạo cho thấy kích thích dung hợp tế bào (Weber Berrg, 1995) - Phân phối thuốc qua da: Chỉ xung điện gây lỗ tạm thời màng sinh chất, lỗ tương tự tạo màng lipid kép lớp da chết phía ngồi Các lỗ cho phép thuốc qua da đến mơ đích Các bệnh nhân thích phương pháp phương pháp tiêm (khơng cần kim tiêm) tránh vấn đề phân hủy hấp thu không liệu pháp uống thuốc (oral medication) hệ tiêu hóa (Praustmitz, 1993) - Liệu pháp hóa điện khối u ung thư (cancer tumor electrochemotherapy): nhà khoa học nghiên cứu tiềm kỹ thuật xung điện để tăng tính hiệu liệu pháp hóa học Khi sử dụng kỹ thuật xung điện để biến nạp DNA, xung điện phá vỡ màng tế bào ung thư làm tăng lượng thuốc đến vị trí Một số nghiên cứu cho làm giảm phát triển khối u áp dụng phương pháp cho tế bào ung thư hệ thống mơ hình động vật (Maeda, 1998) - Liệu pháp gen: kỹ thuật xung điện cho phép vector mang gen quan tâm biến nạp qua da đến mơ đích Khi hợp vào tế bào thể, protein tổng hợp từ gen thay gen sai hỏng điều trị rối loạn di truyền (Hình dưới)(Inovio, 2002) 53 Ứng dụng kỹ thuật xung điện liệu pháp gen CÂU HỎI ÔN TẬP Chuyển gen gì? Các bước chuyển gen vi khuẩn? Súng bắn gen gì? Ưu nhược điểm phương pháp ? Khái niệm chuyển gen xung điện ? Nêu khác biệt phương pháp chuyển gen ? TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002 Sinh học phân tử NXB Giáo dục 54 Nguyễn văn Ây, 2011 Bài giảng công nghệ sinh học BVTV Phạm Thị Thùy, 2004 Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật NXB Đại học quốc gia Hà Nội Trần Thị Thanh, 2003 Công nghệ vi sinh NXB Giáo dục https://voer.edu.vn/c/cac-phuong-phap-chuyen-gen/b998e48c/993889db 55 PHẦN II: THỰC HÀNH Bài NHÂN SINH KHỐI NẤM ĐỐI KHÁNG Mục đích: Giúp SV biết cách chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm đối kháng phịng thí nghiệm mơi trường rơm trấu Dụng cụ - hóa chất - Đĩa Petri, ống nghiệm - Môi trường khoai tây agar - Rơm, trấu, nước cất, gòn - Nồi hấp tiệt trùng, - Tủ cấy vi sinh - Tủ ủ ấm Thực hành Đối tượng nhân sinh khối: nấm trichoderma nấm xanh 2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Mỗi SV tự pha chế khử trùng môi trường nuôi cấy nấm Môi trường nuôi cấy sử dụng môi trường PDA Thao tác gồm: + Đổ đĩa: sinh viên đỗ đĩa petri + Cấy nấm vào đĩa petri 2.2 Nhân sinh khối nấm kháng môi trường rơm trấu Mỗi SV sử dụng đĩa nấm trichoderma đĩa nấm xanh cấy vào rơm trấu khử trùng - Chuẩn bị giá thể cấy chuyền: giá thể khử trùng nồi auto clave - Cấy vào môi trường nhân sinh khối - Theo dõi trình ủ Viết phúc trình Ghi nhận đặc điểm sinh trưởng nấm bao gồm: ẩm độ, nhiệt độ, tơ nấm, hạch nấm trình nhân sinh khối Bài MỘT SỐ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN ĐẠI Mục đích: Giúp cho sinh viên biết kỹ thuật công nghệ sinh học đại như: PCR, điện di, chuyển gen… ứng dụng chúng đời sống Phương pháp thực Sinh viên kiến tập kỹ thuật PCR, điện di, chuyển gen… trung tâm phân tích tỉnh Đồng Tháp 56 Viết phúc trình Sau kiến tập sinh viên nộp thu hoạch đợt kiến tập gồm có: - Các kỹ thuật mà trung tâm sử dụng ứng dụng chúng - Ưu nhược điểm phương pháp - Những trở ngại sử dụng kỹ thuật công nghệ sinh học đại 57 Bài Tách đỉnh sinh trưởng vi ghép bệnh Mục đích: Giúp SV biết kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng vi ghép bệnh Dụng cụ - hóa chất - Mẫu hoa lan - Mẫu cam quyt - Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS phù hợp cho loại - Lưỡi lam - Dao mổ Thực hành 2.1 Chuẩn bị môi trường MS a Thành phần mơi trường dinh dưỡng Thành phần muối khống môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Thành phần vitamin Morel Cách pha dung dịch mẹ 58 59 60 Bảng thành phần vitamin Morel Thành phần chất điều hòa sinh trưởng Dung dịch chất Phương pháp thực Dung dịch BAP (1mg/ml) Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan 5ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100 ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg BAP Dung dịch IAA (1mg/ml) Dung dịch IBA (1mg/ml) Cân 100mg Indolacetic acid (IAA) hòa tan 5ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg IAA Cân 100mg Indolebutyric acid (IBA) hòa tan 5ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg IBA Dung dịch Kinetin (1mg/ml) Cân 100mg Kinetin (KIN) hòa tan 5ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg KIN Dung dịch NAA (1mg/ml) Dung dịch 2,4-D (1mg/ml) Cân 100mg Naphthaleneacetic acid (NAA) hòa tan 5ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg NAA Cân 100mg 2,4-D (2,4dichlorophenoxyacetic acid) hòa tan 50ml ethanol 50% Cho thêm nước cất cho đủ 100ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg 2,4-D 2.2 Hoa lan 61 2.2.1 Dụng cụ - Bình tam giác, Becher, Ống nghiệm + mơi trường - Kẹp inox, đĩa petri vô trùng, dao cấy, đèn cồn, pipet thủy tinh - Bình định mức, ống đong, bóp cao su, giấy cấy vơ trùng 2.2.2 Hóa chất mơi trường Khống đa lượng Knudson 100ml Khống vi lượng Heller 5ml Skoog II MS : 2ml Vitamin Morel: 2ml Glycerin :2ml Inositol : 5ml Vitamin B1: 5ml Đường: 30g Nước dừa: 150ml Khoai tây: 60g Than hoạt tính: 0,25g Agar: 6g pH: 5,5 * Khống đa lượng KnudsonC (Morel,G.M.,1965) NH4NO3: 500mg/l NH4(SO4)2: 500mg/l Ca(NO3)2: 241,3mg/l KCl : 250 mg/l KH2PO4: 250 mg/l MgSO4: 122,15mg/l * Khoáng vi lượng Heller (1953) AlCl3.6H2O : 0,054 mg/l CuSO4.5H2O : 0,03 mg/l H3BO3: 6,2 mg/l KI : 0,01 mg/l MnSO4.H2O : 0,08 mg/l NiCl2.6H2O : 0,03 mg/l ZnSO4.7H2O :1,0 mg/l 2.2.3 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH: + Nguyên vật liệu thí nghiệm: Các đoạn chồi Dendrobium cao 10cm 62 - Rửa chồi Dendrobium vòi nước chảy Dùng dao mổ lột hết non bao xung quanh chồi để lộ chồi bên chồi - Ngâm chồi nước xà phòng lỗng dùng gịn lau nhẹ lên thân chồi Rửa cho xà phòng vòi nước chảy - Lắc chồi cồn 700 phút Sau xử lý với dung dịch javel thương phẩm theo tỉ lệ 1:5 vòng 25-30 phút - Trong tủ cấy, dùng kẹp vơ trùng cho chồi vào bécher có chứa nước cất vô trùng - Lắc rửa 3-5 lần cho hết mùi javel - Đặt chồi lên giấy vô trùng Dùng dao cắt riêng chồi bên chồi khỏi chồi mẹ ban đầu Nhớ cắt bỏ hết mô chết bị chất khử trùng làm trắng phần gốc chồi - Cấy chồi vào ống nghiệm có chứa mơi trường chuẩn bị - Ni phịng sáng - Ghi rõ tên nhóm, ngày cấy, giống vào tất ống nghiệm 2.2.4 BÁO CÁO THỰC HÀNH - Thực thao tác tách nuôi cấy vô trùng đỉnh chồi lan Dendrobium - Thu cụm chồi vô trùng ống nghiệm - Quan sát ghi nhận thời gian tăng trưởng hoàn chỉnh 63 2.3 Cây cam quyt 2.3.1 Dụng cụ - Bình tam giác, Becher, Ống nghiệm + môi trường - Kẹp inox, Đĩa petri vô trùng, Dao cấy, đèn cồn - Pipet thủy tinh, Bình định mức, ống đong, Quả bóp cao su - Giấy cấy vơ trùng, lưỡi lam 2.3.2 Hố chất Dung dịch Skoog I, II III môi trường MS Stock vitamin Morel Cồn 90%, 70% Stock glycine Đường saccharose Xà phòng bột Dung dịch hypochloride calcium 10% Nước cất vô trùng Agar 2.3.3 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH * Chuẩn bị môi trường (thành phần cho 1l môi trường) - Skoog I (MS):100ml - Skoog II (MS): 2ml - Skoog III (MS): 5ml - Vitamin Morel: 2ml - Glycine: 2ml - Sucrose: 30g - pH :5,8 - Agar:7g 64 * Nguyên liệu thực vật: - Các hạt cam chanh nguyên vẹn, không bị hư hại * Các bước thực + Chuẩn bị gốc ghép - Cho hạt vào bécher có chứa nước xà phịng lỗng, rửa hạt cho chất nhớt bám xung quanh hạt - Rửa hạt cho xà phòng nước cất Ngâm hạt 2phút cồn 70% - Rửa hạt etanol nước cất Sau ngâm hạt 10phút dung dịch hypochloride calcium 10% - Trong tủ cấy vô trùng, rửa hạt cho chất khử trùng cách lắc hạt nước cất vô trùng (3 lần) - Tiến hành tách áo hạt kẹp dao mổ vô trùng Cho hạt vừa tách bỏ vỏ áo vào đĩa petri vơ trùng có chứa giấy thấm vơ trùng làm ẩm giấy thấm nước cất vơ trùng - Gieo hạt: gieo 4-5 hạt vào bình tam giác chứa môi trường nuôi cấy hấp khử trùng - Đậy nắp bình cấy ghi rõ họ tên, ngày cấy, số nhóm, tên giống mơi trường - Sau 10 ngày mầm cao – 8cm lấy làm mắt ghép + Tách đỉnh sinh trưởng - Chọn mẹ trưởng thành có suất phẩm chất tốt, hái búp non dài 1,5 – 3cm, cho vào chai hay túi nilon kín, chuyển phịng thí nghiệm - Cắt bớt lá, khử trùng bắng NaOCl 0,5% phút - Dùng lim nhọn gạt bỏ phần non, sau dùng lưỡi dao mổ nhọn cắt đỉnh sinh tưởng 0,5mm để nguyên lưỡi dao để chuyển vào vị trí ghép + Tiến hành vi ghép Đối với gốc ghép dùng dao mổ cắt bỏ đầu rễ, trụ lên mầm hai mầm, đẻ lại phần rễ chừng khoảng – 3cm phần thân chừng 2cm Tùy theo kiểu ghép tiến hành xử ghép khác * Ghép lên mặt cắt: - Dùng dao mổ cắt ngang thân gốc ghép tạo thành mặt phẳng vuông gốc với trục thân gốc ghép - Dưới kính lúp, xác định vịng tượng tầng libe mộc Đặt mắt ghép trực tiếp lên bề mặt nhát ghép, vòng tượng tầng * Ghép chữ T ngược - Dùng đầu nhọn lưỡi dao mổ, cắt tạo thành chữ T ngược gốc ghép cách mặt cắt bên khoảng 0,1 – 0,3cm Vết cắt hết vunng2 vỏ gốc ghép Chân chữ T mặt cắt 65 - Dùng mũi kim hay đầu dao mổ đặt đỉnh sinh trưởng vừa tách vào mặt cắt chữ T (Chân chữ T ngược) cho mặt cắt đỉnh sinh trưởng tiếp xúc với vùng tượng tầng + Nuôi ghép Cây ghép đặt vào ống nghiệm lớn (200 x 25mm) chứa 6ml mơi trường MS lỏng có hàm lượng đường cao 7,5% Đặt ống nghiệm có chứa ghép nhiệt độ 250C, chiếu sáng 12 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng từ 3000 – 5000 lux 2.3.4 Báo cáo thực hành - Tóm tắt phương pháp thực ni cấy mơ hạt cam chanh - Giải thích chế liên kết gốc ghép mắt ghép - Quan sát ghi nhận thời gian tăng trưởng hoàn chỉnh 66 ... Huỳnh Thùy Dương, 20 02 Sinh học phân tử NXB Giáo dục 54 Nguyễn văn Ây, 20 11 Bài giảng công nghệ sinh học BVTV Phạm Thị Thùy, 20 04 Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật NXB Đại học quốc gia Hà Nội... Dương, 20 02 Sinh học phân tử NXB Giáo dục Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung, 20 06 Giáo trình cơng nghệ gen Nơng Nghiệp ĐH Huế Phạm Thị Thùy, 20 04 Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật NXB... cỏ? Thành tựu công nghệ sinh học diệt côn trùng? Thành tựu cơng nghệ sinh học phịng trừ bệnh nấm? Thành tựu công nghệ sinh học phòng trừ bệnh virus? Thành tựu cơng nghệ sinh học phịng trừ bệnh