Đang tải... (xem toàn văn)
Giáo trình Công nghệ sinh học trong Bảo vệ thực vật cung cấp cho người học những kiến thức như: Giới thiệu về công nghệ sinh học; Các kỹ thuật của Công nghệ sinh học hiện đại; Thành tựu của Công nghệ sinh học trong BVTV; Công nghệ chuyển gen. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 1 giáo trình.
UỶ BAN NHÂN DÂN TỈNH ĐỒNG THÁP TRƯỜNG CAO ĐẲNG CỘNG ĐỒNG ĐỒNG THÁP GIÁO TRÌNH MƠN HỌC: CƠNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT NGÀNH, NGHỀ: BẢO VỆ THỰC VẬT TRÌNH ĐỘ: CAO ĐẲNG (Ban hành kèm theo Quyết định Số:…./QĐ-CĐCĐ-ĐT ngày… tháng… năm 2017 Hiệu trưởng Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp) Đồng Tháp, năm 2017 TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN Tài liệu thuộc loại sách giáo trình nên nguồn thơng tin phép dùng nguyên trích dùng cho mục đích đào tạo tham khảo Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc sử dụng với mục đích kinh doanh thiếu lành mạnh bị nghiêm cấm i LỜI GIỚI THIỆU Giáo trình Cơng nghệ sinh học Bảo vệ thực vật môn học nói ứng dụng lĩnh vực cơng nghệ sinh học bảo vệ thực vật Do qua môn học giúp cho sinh viên nắm nguyên lý kỹ thuật sử dụng phổ biến CNSH thực vật, bước nhân dòng gen, thiết kế hệ thống vector biểu hiện, cải tiến định hướng gen chuyển gen vào vật chủ, số kỹ thuật công nghệ sinh học đại Môn học cung cấp cho sinh viên kiến thức loại dịch hại trồng tiến bảo vệ trồng nhờ ứng dụng biện pháp sinh học phân tử Sau kết thúc mơn học, sinh viên có khả suy luận đánh giá kết mối tương tác đa chiều tự nhiên dựa theo quan hệ ký sinh – ký chủ môi trường – người chọn lựa phương pháp tiếp cận nghiên cứu khía cạnh liên quan đến bảo vệ trồng Nội dung giáo trình biên soạn với thời gian đào tạo hai tín gồm: bốn chương Chương 1: Giới thiệu công nghệ sinh học Chương 2: Các kỹ thuật CNSH đại Chương 3: Thành tựu CNSH BVTV Chương 4: Công nghệ chuyển gen Chân thành cảm ơn! Tất thành viên hội đồng thẩm định phản biện, đóng góp điều chỉnh nội dung giáo trình hồn chỉnh Mặc dù cố gắng biên soạn để đáp ứng mục tiêu đào tạo không tránh khiếm khuyết Rất mong nhận đóng góp ý kiến thầy, giáo, bạn đọc để giáo trình hồn thiện Xin chân thành cảm ơn Đồng Tháp, ngày… tháng năm 2017 Chủ biên Phan Thị Thanh Tuyền ii MỤC LỤC Trang LỜI GIỚI THIỆU ii Chương GIỚI THIỆU VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC - 1.1 Khái niệm định nghĩa CNSH 1.2 Sơ lược lịch sử phát triển 1.2.1 Giai đoạn thứ 1.2.2 Giai đoạn thứ hai 1.2.3 Giai đoạn thứ ba 1.2.4 Giai đoạn thứ tư 1.3 Phân loại CNSH 1.4 Thành tựu xu phát triển 1.4.1 Công nghệ sinh học nông nghiệp 1.4.2 Công nghệ sinh học y dược 1.4.3 Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm 1.4.4 Công nghệ sinh học bảo vệ môi trường Chương CÁC KỸ THUẬT CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN Đ 2.1 Kỹ thuật chuẩn đoán tác nhân gây hại trồng 2.1.1 ELISA (Enzymee-Linked Immunosorbent Assay) 2.1.2 Kỹ thuật PCR 10 2.2 Các kỹ thuật công nghệ sinh học sử dụng nghiên cứu lĩnh vực bảo vệ thực vật 17 2.2.1 DNA tái tổ hợp 17 2.2.2 Kỹ thuật lai phân tử: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 23 2.2.3 Kĩ thuật RAPD (Randomly Amplified Polymosphic DNA) 26 2.2.4 Kỹ thuật SSR: Simple Sequence Repeats 27 2.2.5 Kỹ thuật AFLP 29 Chương THÀNH TỰU CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 33 3.1 Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ 33 iii 3.2 Kháng côn trùng gây hại 38 3.3 Kháng virus gây bệnh 41 3.4 Kháng vi khuẩn nấm 43 Chương CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN 46 4.1 Chuyển gen 46 4.2 Nguyên lý kỹ thuật chuyển gen 47 4.2.1 Nguyên lý 47 4.2.2 Cơ chế hợp DNA ngoại lai vào genome 47 4.3 Các phương pháp chuyển nạp gen kháng sâu bệnh 50 4.3.1 Chuyển gene vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 50 4.3.2 Chuyển gene phương pháp vật lý (súng bắn gen) 52 4.3.3 Chuyển gene phương pháp xung điện 56 PHẦN II: THỰC HÀNH Bài Nhân sinh khối nấm đối kháng 63 Bài Một số kỹ thuật công nghệ sinh học đại 64 Bài Tách đỉnh sinh trưởng vi ghép bệnh 65 iv GIÁO TRÌNH MƠN HỌC Tên mơn học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BVTV Mã mơn học: NN445 Vị trí, tính chất, ý nghĩa vai trị mơn học: - Vị trí: Là mơn học bắt buộc bố trí khung mơn học sở - Tính chất: Đây môn học kỹ quan trọng giúp cho sinh viên có kiến thức CNSH lĩnh vực BVTV Yêu cầu sinh viên cần phải đảm bảo đủ số lý thuyết thực hành - Ý nghĩa vai trị mơn học: Mơn học cung cấp cho sinh viên kiến thức công nghẹ sih học ứng dụng ngành BVTV Mục tiêu mơn học: - Về kiến thức: + Hiểu kiến thức công nghệ sinh học đại ứng dụng CNSH BVTV - Về kỹ năng: + Thành thạo thực số thao tác CNSH BVTV - Về lực tự chủ trách nhiệm: Học tập tích cực, chủ động trình học có ý thức vận dụng kiến thức vào thực tiễn Nội dung môn học: Thời gian (giờ) Kiểm tra Tên chương Số TT môn học Tổng số Chương 1: Giới thiệu CNSH Khái niệm định nghĩa CNSH (định Thực hành, thí Lý thuyết nghiệm, thảo luận, kỳ)/Ơn thi, Thi kết tập thúc môn học v 0 Sơ lược lịch sử phát triển Phân loại CNSH Thành tựu xu phát triển Chương 2: Các kỹ thuật CNSH đại Kỹ thuật chuẩn đoán tác nhân gây hại trồng Các kỹ thuật công nghệ sinh học sử dụng nghiên cứu lĩnh vực bảo vệ thực vật Thực hành 12 Kiểm tra Chương 3: Thành tựu CNSH BVTV Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ Kháng côn trùng gây hại Kháng virus gây bệnh Kháng vi khuẩn nấm 16 12 3 1LT Thực hành Chương 4: Công nghệ chuyển gen Chuyển gen Nguyên lý kỹ thuật chuyển gen Các phương pháp chuyển nạp gen kháng sâu bệnh Thực hành Kiểm tra Ôn thi Thi kết thúc môn học vi 1TH Cộng 40 19 vii 19 Chương GIỚI THIỆU VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NN405-1 Mục đích: giúp cho sinh viên biết khái niệm định nghĩa CNSH, phân loại CNSH, thành tựu giới xu phát triển 1.1 Khái niệm định nghĩa CNSH Có nhiều định nghĩa công nghệ sinh học (Biotechnology), tùy theo tác giả khác nhau, tất thống khái niệm sau đây: Công nghệ sinh học sản xuất sản phẩm quy mơ cơng nghiệp, nhân tố tham gia trực tiếp định tế bào sống (vi sinh vật, thực vật, động vật) Mỗi tế bào sống thể sinh vật hoạt động lĩnh vực sản xuất xem lò phản ứng nhỏ Vào năm 1980, công nghệ sinh học chuyển sang giai đoạn là giai đoạn công nghệ sinh học đại với việc sử dụng thành tựu kỹ thuật gen, lĩnh vực công nghiệp sử dụng hoạt động sinh học tế bào biến đổi di truyền Cơ sở sinh học áp dụng bao gồm sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh học, di truyền học, vi sinh vật học, miễn dịch học, ngun lý kỹ thuật máy tính Có hai cách định nghĩa công nghệ sinh học cách tổng quát nhất: - Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học công nghệ sử dụng phận hay tế bào riêng rẽ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm chúng - Do Trường Luật Stanford (1995) định nghĩa: Công nghệ sinh học công nghệ chuyển hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm chức gen Sự khác biệt rõ rệt hai định nghĩa thuộc đối tượng tác động công nghệ sinh học: UNESCO xem quan, phận, tế bào chức riêng rẽ sinh vật đối tượng, Trường Luật Stanford lại coi gen đối tượng tác động công nghệ 1.2 Sơ lược lịch sử phát triển Lịch sử hình thành phát triển cơng nghệ sinh học trải qua giai đoạn sau: 1.2.1 Giai đoạn thứ Đã hình thành từ lâu việc sử dụng phương pháp lên men vi sinh vật để chế biến bảo quản thực phẩm, ví dụ: sản xuất mát, dấm ăn, làm bánh mì, nước chấm, sản xuất rượu bia… Trong đó, nghề nấu bia có vai trị đáng kể Ngay từ cuối kỷ 19, Pasteur vi sinh vật đóng vai trị định q trình lên men Kết nghiên cứu Pasteur sở cho phát triển ngành công nghiệp lên men sản xuất dung môi hữu aceton, ethanol, butanol, isopropanol… vào cuối kỷ 19, đầu kỷ 20 1.2.2 Giai đoạn thứ hai Nổi bật trình phát triển cơng nghệ sinh học giai đoạn hình thành cơng nghiệp sản xuất thuốc kháng sinh penicillin, khởi đầu gắn liền với tên tuổi Fleming, Florey Chain (1940) Trong thời kỳ xuất số cải tiến mặt kỹ thuật thiết bị lên men vô trùng cho phép tăng đáng kể hiệu suất lên men Các thí nghiệm xử lý chất thải bùn hoạt tính cơng nghệ lên men yếm khí tạo biogas chứa chủ yếu khí methane, CO2 tạo nguồn phân bón hữu có giá trị tiến hành hoàn thiện 1.2.3 Giai đoạn thứ ba Bắt đầu từ năm 50 kỷ 20, song song với việc hồn thiện quy trình cơng nghệ sinh học truyền thống có từ trước, số hướng nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học hình thành phát triển mạnh mẽ nhờ loạt phát minh quan trọng ngành sinh học nói chung sinh học phân tử nói riêng Đó việc lần xác định cấu trúc protein (insulin), xây dựng mơ hình cấu trúc xoắn kép phân tử DNA (1953) Tiếp theo việc tổng hợp thành công protein (1963-1965) đặc biệt việc tổng hợp thành cơng gen buộc thể tế bào vi sinh vật (1980) Chính phát minh tạo tiền đề cho phát triển nhanh chóng nghiên cứu ứng dụng thực tế sau lĩnh vực cơng nghệ sinh học đại 1.2.4 Giai đoạn thứ tư Kể từ 1973, thí nghiệm khởi đầu dẫn đến đời kỹ thuật DNA tái tổ hợp thực xuất insulin-sản phẩm vào năm 1982, thí nghiệm chuyển gen vào trồng năm 1982 thành cơng đến cơng nghệ sinh học đại có bước tiến khổng lồ lĩnh vực nông nghiệp (cải thiện giống trồng ), y dược (liệu pháp gen, liệu pháp protein, chẩn đốn bệnh ), cơng nghiệp thực phẩm (cải thiện chủng vi sinh vật ) Công nghệ sinh học phát triển ngày chủ yếu dựa ba cơng nghệ là: - Công nghệ vi sinh - Công nghệ tế bào (nuôi cấy mô tế bào ) - Công nghệ sinh học đại, tức cơng nghệ gen Cũng có tác giả gắn q trình phát triển cơng nghệ sinh học với ba cách mạng sinh học - Cách mạng sinh học lần thứ (đầu kỷ 20): sử dụng trình lên men để sản xuất sản phẩm acetone, glycerine, citric acid, riboflavin - Cách mạng sinh học lần thứ hai (sau chiến thứ 2): sản xuất kháng sinh, sản phẩm lên men cơng nghiệp glutamic acid, polysaccharide, có thành tựu đột biến, tạo chủng vi sinh vật cho suất hiệu cao, phát triển trình lên men liên tục phát phương pháp bất động enzyme để sử dụng nhiều lần - Cách mạng sinh học lần thứ ba (bắt đầu từ thập niên 1970): với phát quan trọng enzyme hạn chế, enzyme gắn, sử dụng plasmid làm vector tạo dòng, đặt móng cho cơng nghệ sinh học hồn tồn cơng nghệ DNA tái tổ hợp Hai giai đoạn đầu, công nghệ vi sinh công nghệ tế bào, sử dụng hoạt động sinh học tế bào tách biệt, chưa biến đổi cấu trúc di truyền chúng, Nhiệt độ tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt Công việc DNA polymerase di chuyển dọc theo DNA sợi đơn sử dụng làm khn để tổng hợp sợi DNA bổ sung với DNA mẫu cách Hình 2.5: Ba giai đoạn chu kỳ phản ứng PCR Kéo dài phần đánh dấu mồi Thời gian giai đoạn phụ thuộc vào kích thước DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Hình 2.6: Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ thời gian nhiệt độ chu kày phản ứng PCR Ở giai đoạn chu kỳ cuối cùng, thời gian tăng thêm vài phút để sợi DNA chưa chép xong hồn thành q trình tổng hợp Sau chu kỳ, số DNA mẫu lại tăng gấp đôi Ðây nhân theo cấp số nhân Như phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ tạo thành 2n phân tử DNA (Hình 2.7 bảng 2.2) Bảng 2.2: Số phân tử DNA mẫu tạo thành qua chu kỳ phản ứng PCR Chu kỳ Số 21=2 22=4 14 24=16 10 210=1.024 15 215=32.768 20 220=1.048.576 25 225=33.554.432 30 230=1.073.741.824 n 2n Ưu điểm phương pháp PCR cần thời gian ngắn cho số lượng DNA theo mong muốn Sản phẩm phản ứng PCR phân tách gel agarose nhuộm ethimidium bromide quan sát máy chiếu tia UV Hình 2.7: Phản ứng PCR với lượng sản phẩm tăng theo cấp số nhân 15 2.2 Các kỹ thuật công nghệ sinh học sử dụng nghiên cứu lĩnh vực bảo vệ thực vật 2.2.1 DNA tái tổ hợp 2.2.1.1 Khái niệm a DNA DNA chữ viết tắt axit 2’-deoxyribonucleic, nhà sinh học người Thụy Điển Miescher tìm vào năm 1869 nhân tế bào bạch cầu (tế bào mủ) Đầu tiên ơng gọi nuclein có nghĩa hạch nhân Sau đó, ơng phát có chất axit gọi axit nucleic Sau 80 năm với tranh cãi nhiều nhà khoa học, đến năm 1952, người ta công nhận DNA vật chất di truyền DNA gồm thành phần chính: bazơ nitơ dạng purine pyrimidine (A,T,C,G), đường pentose (đường carbon) axit phosphoric (H3PO4) Ba thành phần có tỷ lệ 1:1:1 chúng liên kết với tạo thành nucleotide: Cấu trúc DNA Watson-Crick khám phá Đó chuỗi xoắn kép cong nhẹ nhàng, có cấu trúc khơng gian chiều, gồm hai sợi song song, đối xứng bổ sung cho theo qui luật nghiêm ngặt: A bắt cặp với T C bắt cặp với G nhờ liên kết hydro Cấu trúc xoắn kép Watson- Crick chìa khóa để mở kỹ thuật sống b DNA tái tổ hợp Với cấu trúc đặc biệt phân tử DNA bắt cặp nghiêm ngặt bazơ nitơ, nhiều nhà nghiên cứu nảy ý tưởng: tạo đuôi hai sợi phân tử DNA khác chúng nối lại với nhờ bắt cặp bổ sung Vào năm 70, phương pháp khác nhau, người ta tạo phân tử DNA tái tổ hợp Năm 1972, nhóm nghiên cứu trường đại học Stranford (Paul-Berg) đưa phương pháp đuôi để nối phân tử DNA khác Để tạo đầu dính, người ta sử dụng enzyme terminal transferase Dưới tác dụng enzyme này, người ta tạo đuôi poly nucleotide khoảng 50 đến 100 gốc adenine (polyA) đầu OH (3’) mạch đơn DNA SV 40 (Simian virus 40) đuôi polyT DNA plasmid mở enzyme Sau trộn lẫn hai loại DNA này, đuôi bổ sung adinine thymine bắt cặp lại với với có mặt enzyme ligase, hai DNA nối lại tạo plasmid tái tổ hợp vịng Vì an tồn cho cộng đồng nên sản phẩm tái tổ hợp không biến nạp tế bào chủ Tuy chưa hoàn tất, thực nghiệm Berg cho ta hai vấn đề mấu chốt DNA tái tổ hợp Ông cho rằng, dùng enzyme để cắt DNA cách định trước đoạn DNA lồi khác nối lại với Năm 1973, Staley Cohen Annie Chang tạo phân tử DNA tái tổ hợp từ loài khác nhau, có nhiều ưu điểm biến nạp tế bào chủ Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp đời Sau đó, nhiều nhà khoa học lao vào thí nghiệm lắp ghép gen nhanh chóng thu kết có ứng dụng thực tiễn 16 Kỹ thuật tái tổ hợp DNA Rerg, Chang, Boyer Cohen đề giúp nhà sinh học làm thay đổi tính di truyền thể sống theo chiều hướng định trước vượt qua hàng rào ngăn cản loài Mỗi tổ hợp DNA tạo nên đặc điểm sinh học kể mặt di truyền lẫn sinh hóa Vậy người ta gọi DNA tái tổ hợp DNA lai, tìm invitro (trong ống nghiệm) cách tổ hợp DNA thuộc lồi khác Ví dụ: Hai vector plasmid, phage λ cài mảnh DNA lạ để tạo DNA tái tổ hợp (Hình 6-2) Các DNA lạ gọi đoạn cài hay DNA ngoại lai Nó mảnh (đoạn) DNA gen mà người nghiên cứu quan tâm ghép vào DNA plasmid hay DNA virus 2.2.1.2 Mục đích tạo DNA tái tổ hợp DNA tái tổ hợp chế tác với mục đích để thực q trình gọi tách dòng Tách dòng tách lập thu nhận nhiều đồng gen hay mảnh đoạn DNA Tách dòng kèm khơng kèm với biểu protein Những áp dụng DNA tái tổ hợp dùng để thiết lập ngân hàng gen, cDNA tổng hợp protein, enzyme, hormone, 2.2.1.3 Những yêu cầu DNA tái tổ hợp - DNA tái tổ hợp phải đạt yêu cầu cần thiết vector chuyển gen - DNA tái tổ hợp phải có hoạt tính đưa vào tế bào chủ - DNA tái tổ hợp phải có dấu hiệu dễ phát quần thể vi khuẩn Và dễ quan sát hoạt động biểu gen tái tổ hợp 2.2.1.4 Các công đoạn tạo DNA tái tổ hợp a Chọn nguyên liệu DNA chọn làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường DNA plasmid DNA phage Chúng thu nhận chủ yếu từ tế bào vi sinh vật, tách làm theo phương pháp chiết tách DNA plasmid, DNA virus DNA chứa gen cần nghiên cứu (DNA lạ) thu nhận từ tế bào sinh vật chiết tách làm kiểm tra theo phương pháp chiết tách DNA Ngồi ra, người ta cịn sử dụng DNA tổng hợp phương pháp hóa học tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme chép ngược theo chế nuclease S1 kỹ thuật Gubler-Hoffman Các enzyme để cắt, nối đoạn DNA lại với enzyme ristriction, enzyme ligase với hợp tác số enzyme khác kinase alkanline phosphotase, b Công đoạn cắt với tham gia enzyme RE kiểu II RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: enzyme cắt hạn chế vị trí xác định dùng công nghệ DNA tái tổ hợp chúng có số ưu điểm: Hầu có kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc cải biên Mỗi enzyme cắt vị trí phù hợp định trước bên hay cạnh trình tự nhận biết Chúng cần ion Mg+2 không cần lượng ATP 17 Các enzyme gặp chuỗi đích phân tử DNA cắt DNA thành hai mảnh dạng đầu hay đầu dính Hiệu cắt enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác hàm lượng enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH độ tinh khiết DNA c.Công đoạn nối với có mặt DNA ligase Bước kĩ thuật di truyền nối đoạn DNA vào vector chuyển gen để tạo plasmid có mang DNA lạ Phản ứng nối thực nhờ enzyme DNA ligase DNA ligase enzyme xúc tác phản ứng nối hai mảnh DNA cách tạo cầu nối phosphodiester đầu 5’(P) đầu 3’(OH) hai nucleotide đứng cạnh Trong sinh học phân tử, người ta coi DNA ligase chất keo phân tử để kết dính mẫu DNA lại với * Nối đầu Nối đầu xảy hai đoạn DNA đầu đứng cạnh Dưới tác dụng enzyme ligase, liên kết phosphodiester đầu 5’(P) đầu 3’(OH) hình thành hai nucleotide nối lại với Khả nối hai đoạn DNA đầu thấp Để tăng hiệu suất phản ứng, thường người ta phải tăng nồng độ đoạn DNA * Nối đầu lệch Đầu tiên, hai mảnh DNA đầu lệch có bazơ bổ sung nên chúng tiến gần lại để tạo liên kết hydro bazơ nitơ bổ sung Sau đó, hai nucleotide hai đầu nối tạo liên kết este OH(3’) P(5’) tác dụng enzyme DNA ligase Phản ứng nối thực theo sơ đồ biểu diễn Plasmid tách từ tế bào E Coli tế bào nấm men theo phương pháp chiết tách DNA plasmid Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo plasmid hở có hai đầu lệch 18 2.2.1.5 Các phương pháp tạo AND tái tổ hợp a Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch - Chọn xử lý AND plasmid: Plasmid tách từ tế bào E coli tế bào nấm men theo phương pháp chiết tách AND plasmid Sau dùng enzym RE II cắt để tạo plasmid hở có hai đầu lệch - Chọn xử lí đoạn cài:DNA đoạn cài thu nhận lựa chọn, tinh chế theo mục đích nghiên cứu Cắt DNA enzyme RE loại II loại với enzyme cắt plasmid (EcoRI) để tạo vết cắt giống - Tạo plasmid tái tổ hợp: Ghép đoạn cài vào plasmid cách ủ DNA đoạn cài với plasmid với có mặt enzyme DNA ligase, ta thu DNA tái tổ hợp Phản ứng nối xảy theo sơ đồ biểu diễn Hình 2-4 b Các phương pháp sử dụng đoạn nối - Chọn xử lí vector plasmid: (tương tự trên) - Chọn xử lí đoạn cài: Linker đoạn DNA dài 10 đến 15 nucleotide, tổng hợp phương pháp hóa học, cho linker phải có trình tự nhận biết enzyme cắt hạn chế loại II Ví dụ EcoRI có chuỗi đích G/AATTC cDNA đầu tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme chép ngược theo chế nuclease S1 Metyl hóa vùng hạn chế có đoạn cDNA sợi đơi nhận biết enzyme EcoRI Ủ linker có chứa chuỗi đích G/AATTC với cDNA enzyme DNA ligase để tạo phân tử lai Cắt phân tử DNA lai enzyme EcoRI, ta phân tử lai có hai đầu lệch - Tạo vector tái tổ hợp: Để tạo vector tái tổ hợp, người ta ghép phân tử DNA lai đầu lệch vào plasmid mà cắt enzyme EcoRI Nhờ tác dụng enzyme DNA ligase mà vector tái tổ hợp tạo thành c Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase (ETT) Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính enzyme terminal transferase có khả gắn loại nucleotide vào đầu 3’(OH) phân tử DNA Cách tạo DNA tái tổ hợp phương pháp tiến hành theo bước sau: - Bước 1:Chọn phân lập DNA lạ đầu plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có chứa chuỗi đích nhận biết enzyme BamHI (G/GATCC) Cắt plasmid enzyme BamHI để tạo plasmid hở có hai đầu dính Cắt DNA lạ enzyme exonuclease theo hướng 5’→ 3’ để tạo DNA có hai đầu lệch - Bước 2: Ủ DNA lạ với loại nucleotide dCTP với có mặt enzyme terminal transferase để tạo polyC đầu 3’(OH) DNA lạ Ủ plasmid với loại nucleotide dGTP với có mặt enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyG đầu 3’(OH) plasmid hở - Bước 3: Đưa DNA lạ vào plasmid với có mặt enzyme DNA ligase, đầu mút homopolymer có trình tự bổ sung ( -GGGG 3’/3’CCCC -) bắt cặp với 19 - Bước 4: Bổ sung enzyme DNA-polymerase I để gắn nucleotide tương ứng vào chỗ trống theo nguyên tắc bổ sung Enzyme ligase nối liên kết phosphodiester cuối tạo plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích nhận biết enzyme BamHI Ưu điểm phương pháp ghép DNA lạ đầu vào plasmid để tạo DNA tái tổ hợp chế tác DNA đầu lệch từ DNA đầu 2.2.1.6 Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ * Hóa biến nạp Hiện tượng biến nạp chìa khóa giúp ta hiểu biết sở phân tử gen, công cụ để thực thao tác tạo tính di truyền vật sống Theo Mandel Higa cho thấy rằng, E Coli trở nên dễ bị biến nạp DNA ngoại lai tế bào vi khuẩn xử lí mơi trường có CaCl2 trước sốc nhiệt 42°C Hóa biến nạp phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ Quá trình thực theo hai buớc sau: Xử lí tế bào chủ dung dịch CaCl2 nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào ủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ xử lí Hiệu suất phương pháp hóa biến nạp vào khoảng 105 đến 106 tế bào biến nạp 1mg DNA tái tổ hợp Qua kết thực nghiệm, người ta thấy rằng, tế bào phát triển pha sớm đến pha dễ biến nạp Những nghiên cứu sau cho thấy việc xử lí tế bào ion kim loại hóa trị hai Mg+2, Mn+2 Ba+2 cho khả biến nạp lớn Ngoài ra, hiệu suất biến nạp cịn phụ thuộc vào kích thước plasmid, plasmid nhỏ hiệu suất biến nạp cao * Điện biến nạp Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao cục theo xung để tạo lỗ nhỏ màng sinh học tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp dễ dàng Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều có lên tới 70% Hiệu suất phương pháp phụ thuộc vào yếu tố sau: - Độ mạnh điện trường tác động khác loại tế bào khác nhau, - Độ dài số thời gian (thời gian ngắt xung - ms) Theo nhiều nghiên cứu, hầu hết loại tế bào sinh vật, hiệu biến nạp cao số thời gian đạt khoảng 6ms, - Nồng độ tế bào chủ, - Nồng độ DNA tái tổ hợp, - Giai đoạn phát triển tế bào (tế bào q già q non khơng thích hợp), - Môi trường dung dịch đệm, - Cấu trúc màng tế bào * Biến nạp tế bào trần (p rotoplast) Là phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ xử lí polyetylen glycol (PEG) Để tạo tế bào trần, người ta ủ tế bào với PEG nồng độ 30% đến 40% Đây phương pháp chuyển gen có hiệu cao tế bào thực vật Bằng 20 phương pháp này, người ta nhận mang gen biến nạp ổn định di truyền qua nhiều hệ (Potrykus cộng - 1995) Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen thị gen cần biến nạp cao Có thể chuyển gen vào tế bào protoplast loại Đặc biệt loại có giá trị kinh tế cao lúa, ngơ, đại mạch Nhược điểm: Việc tái sinh protoplast khó khăn số lồi * Phương pháp bắn gen Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng bao bọc DNA bắn trực tiếp vào tế bào Ưu điểm: Phương pháp biến nạp cho tất loại tế bào thực vật Thao tác dễ dàng, bắn lần nhiều tế bào Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận biến nạp khảm (cây có tế bào biến nạp tế bào không biến nạp) Một số thành tựu đạt phương pháp bắn gen: Năm 1988, Mc Cabe cộng nhận đậu tương biến nạp phương pháp bắn gen Năm 1990, Promm, Gordon, Kamm cộng nhận ngô biến nạp nhiều phịng thí nghiệm Những năm gần có hàng loạt công bố biến nạp thành công lúa Năm 1996, Zthang cộng biến nạp đu đủ, mía bơng Điều khẳng định tính ưu việt phương pháp * Phương pháp vi tiêm Phương pháp vi tiêm phương pháp sử dụng vi kim kính hiển vi để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào định Đây trình lai ghép cho tế bào bậc cao tế bào hợp tử Tùy thuộc trường hợp cụ thể, người ta chọn phương pháp cho việc đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào có hiệu cao Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào định đưa DNA vào loại tế bào Đưa xác chí vào tận nhân tế bào quan sát Các tế bào có cấu trúc nhỏ hạt phấn, tế bào tiền phôi tiến hành cách xác Có thể biến nạp cho giống Nhược điểm: Một phát tiêm tế bào thao tác cần phải khéo léo tỉ mỉ * Tải nạp Tải nạp tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, có q trình chuyển gen tái tổ hợp gen vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage) Thực nghiệm chứng minh tải nạp E Coli qua phage λ, phage P1 Bacillus subtilis qua phage SP10 So với phương pháp trên, tải nạp cho hiệu suất cao Như vậy, đến có nhiều phương pháp hóa học, hóa lý, học sinh học để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ Tùy đối tượng yêu cầu cụ thể, phương pháp hay phương pháp khác có hiệu sử dụng nhiều 21 2.2.2 Kỹ thuật lai phân tử: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) a Giới thiệu Kỹ thuật RFLP kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài phân đoạn DNA dựa điểm cắt enzim giới hạn (Restriction Enzyme, RE) Khi ủ DNA với enzim giới hạn dung dịch đệm thích hợp pH, nhiệt độ thích hợp sẽ tạo phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ lập nên đồ gen Kỹ thuật sử dụng phổ biến từ thập niên 80 đến b Nguyên tắc chung Nguyên tắc kỹ thuật dựa độ đặc hiệu enzim cắt giới hạn (restriction enzim-RE) vị trí nhận biết chúng DNA gen Sự khác biệt vị trí cắt hai cá thể tạo phân đoạn cắt khác c Các enzim giới hạn (RE) * Giới thiệu Enzim giới hạn Werner Arber tìm thấy vi khuẩn vào năm 1962 Ông cho RE có khả đặc biệt khả nhận biết DNA chủ DNA lạ Enzim hạn chế nhân lên DNA lạ chúng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn cách cắt chúng thành đoạn cách đặc hiệu, ơng gọi restriction có nghĩa hạn chế Với phát minh ông cộng (Daniel Nathans Hamilton O Smith) giành giải thưởng Nobel vào năm 1978 Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ tế bào sơ hạch (procaryote), câu hỏi đặt RE cắt DNA phage mà không cắt DNA tế bào vi khuẩn? Câu trả lời nhờ Methylase enzim giúp vi khuẩn có khả này, enzim chịu trách nhiệm gắn nhóm metyl (CH3) vào nucleotides vị trí cắt RE DNA vi khuẩn bảo vệ DNA vi khuẩn khỏi phân cắt RE Tuy đơi lúc methylase lại gắn nhằm nhóm metyl vào DNA phage, điều giải thích dịng vi khuẩn kháng phage có tế bào bị phân hủy Enzim cắt giới hạn phân lập vào năm 1968, có hoảng 3.400 RE khám phá Trong số có khoảng 540 RE thương mại hóa * Tên gọi enzim cắt giới hạn Chữ đầu viết hoa chữ đầu tên vi khuẩn từ RE ly trích Hai chữ kế khơng viết hoa tương đương với tên loài vi khuẩn Cả chữ nầy viết in nghiêng Kế đến chữ số la mã thứ tự RE phát trường hợp nhiều RE tìm thấy vi khuẩn Đơi cịn có thêm chữ viết hoa (viết thẳng) để chủng vi khuẩn sử dụng VD : Escherichia coli Ry13 chi loài chủng EcoRI: enzym tìm thấy vi khuẩn E coli EcoRV: enzym thứ tìm thấy vi khuẩn E.coli * Các loại enzim cắt giới hạn Loại I: enzym nhận biết trình tự di chuyển phân tử DNA cách 1000-5000 nu giải phóng độ vài chục nu 22 Loại II: enzym nhận biết trình tự cắt vị trí Loại III: enzym nhận biết trình tự cắt DNA vị trí cách 20 nu d Quy trình thực RFLP bao gồm bước: + Tách chiết tinh DNA + Cắt mẫu DNA cần phân tích RE + Phân tách DNA gel agarose + Southern Blotting + Tách chiết tinh DNA + Cắt mẫu DNA cần phân tích RE + Phân tách DNA gel agarose + Southern blotting Chuyển DNA sang màng nylon Chọn đoạn dò (probes), đánh dấu đoạn dò Lai ghép gen (Hybridization) Lập đồ gen (phân tích đa hình) * Ưu điểm khuyết điểm kỹ thuật RFLP - RFLP có ưu điểm marker đồng trội cho phép phân biệt cá thể đồng hợp dị hợp Do kích thước DNA khảo sát RFLP lớn số lượng dấu phân tử (marker) tạo nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu - Tuy nhiên qui trình thực phức tạp, nguy hiểm sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lượng cao làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật Hơn nay, nước ta nhà nước chưa cho phép nhập chất phóng xạ - Cùng với phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản Một cặp mồi oligonucleotide dùng khuếch đại vùng DNA cần khảo sát, sau đoạn DNA khuếch đại cắt RE, điện di phân tích gel nhuộm ethidium bromide bạc PCR-RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ nguy hiểm phương pháp RFLP 2.2.3 Kĩ thuật RAPD (Randomly Amplified Polymosphic DNA) Kĩ thuật gọi kĩ thuật phát tính đa hình DNA nhân ngẫu nhiên Đây kĩ thuật phân tích đánh giá genom thực vật đơn giản Sự đa hình sản phẩm RAPD kết thay đổi điểm gắn primer thay đổi NST vùng nhân gây thay đổi kiến trúc hay ngăn cản nhân DNA mẫu Kĩ thuật RAPD thực chất trình nhân đoạn DNA kĩ thuật PCR sử dụng mồi thiết kế ngẫu nhiên Các mồi bắt cặp cách ngẫu nhiên vào DNA khn vị trí đó, mà có trình tự bổ sung với * Ngun lí: 23 Sử dụng mồi đơn có trình tự ngẫu nhiên, chiều dài khoảng 10 nucleotit để nhân đoạn DNA nằm hai mồi bắt cặp ngẫu nhiên xếp chiều có khoảng cách phù hợp (150 – 3000 bp) Kết cho tranh tổng thể đa dạng DNA gen cá thể nghiên cứu Kĩ thuật RAPD gồm bước sau: Tách chất, tinh sạch, đánh giá độ tinh DNA hệ gen Thực phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên Điện di sản phẩm PCR Xác định mức độ da hình DNA mẫu Phân tích kết Những khác biệt RAPD với PCR: - Do tính chất ghép cặp ngẫu nhiên nên primer vừa primer xuôi vừa primer ngược - RAPD không cho băng nhân nếu: + Khơng có trình tự nu giống trình tự primer genom đối tượng nghiên cứu + Có trình tự lại nằm sợi hay trình tự nằm hai sợi xa hay ghép cặp primer không hướng vào Phải sử dụng nhiều primer khác phát đa hình hay khác biệt genom đối tượng nghiên cứu Có thể dùng phối hợp vài primer phản ứng để tăng số băng nhân Ưu điểm: Khơng cần biết trước trình tự DNA để thiết kế đoạn mồi Đơn giản, dễ sử dụng, tốn Bộ mồi sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền cho nhiều loài khác Nhược điểm: Khó lặp lại thí nghiệm độ lặp lại không cao Cùng băng DNA gel điện li có trình tự hay khơng khơng thể phát Ứng dụng: Được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền cá thể loài loài khác Lập phát sinh chủng loại Lập đồ di truyền + Được ứng dụng việc xác định gen cần tìm, đoạn DNA liên kết chặt chẽ với gen cần tìm (chỉ thị phân tử DNA) 2.2.4 Kỹ thuật SSR: Simple Sequence Repeats 24 Trong cấu trúc genome SVNC có đoạn DNA bao gồm đoạn trình tự giống lặp lặp lại nhiều lần gọi đoạn trình tự lặp lại Trình tự cấu trúc đoạn lặp lại gọi đơn vị lặp lại Có hai loại trình tự lặp lại: + Trình tự lặp lại phân tán + Trình tự lặp lại liền kề - tendem repeat Số base đơn vị lặp lại từ hai đến hàng trăm base Dựa vào số base đơn vị lặp lại chia thành đoạn thị sau: + Số base đơn vị lặp lại nhỏ gọi thị SSR (Simple Tendem Repeats) + Số base đơn vị lặp lại từ đến 25 gọi thị STR (Short Tendem Repeats) + Số base đơn vị lặp lại lớn 25 gọi thị VNTR (Variable Number Tendem Repeats) SSR marker: + Nguyên lí: Dựa vào hai đầu (vùng sườn) đoạn lặp lại có trình tự đặc biệt thống chung cho đoạn DNA gen không phân biệt cá thể loài, cá thể loài số lần lặp lại đơn vị lặp lại khác Từ đó, thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân cặp DNA gen chứa trình tự lặp lại Điện di sản phẩm PCR cho phép phân biệt giống khác cá thể lồi + Ưu điểm: Nhóm thị đặc hiệu, có độ xác cao Tương đối đơn giản, dễ thực Có độ lặp lại cao + Nhược điểm: Nhóm kĩ thuật cần nhiều bước tiến hành, cần thiết kế cặp mồi xác tương ứng với hai đàu đoạn DNA chứa trình tự lặp lại + Ứng dụng: Sử dụng để xác định huyết thống, giám định cá thể (xác định tội phạm), nhóm cá thể, dịng giống Sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, phân loại giống vật ni với lồi động vật hay thực vật Đây thị đồng trội nên cho phép phát cá thể đồng hợp tử hay dị hợp tử gen phân tích – chẩn đoán cặp lai cho ưu lai Xây dựng đồ liên kết, phân lập gen để xác định dịng, giống trồng, vật ni 25 2.2.5 Kỹ thuật AFLP a Giới thiệu Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) hiểu đa dạng đoạn DNA nhân lên có định hướng sau bị cắt enzim giới hạn, sử dụng phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR AFLP kỹ thuật in dấu DNA phát triển Vos cộng năm 1995 Kỹ thuật cơng cụ hữu ích để xác nhận nhiều loci đa hình DNA mà khơng cần phải biết trước thơng tin trình tự DNA chúng (Michelmore ctv., 1998), phương pháp đưa nhanh chóng ước lượng độ đa dạng di truyền quần thể với (Breyen ctv., 1997; Cervera ctv.,1996) b Nguyên tắc Nguyên tắc phương pháp AFLP giống RFLP, điểm khác biệt AFLP không cần tiến hành lai phân tử (lai Southern blot ), thực nhanh Kỹ thuật AFLP gồm hai nội dung là: - Cắt DNA enzim giới hạn có bổ sung adaptor đặc hiệu tạo nên đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho mồi chọn trước Cặp enzyme thường dùng EcoRI - MseI Đoạn adaptor gồm phần: phần trình tự lõi phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme - Khuếch đại đoạn DNA kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi khác Mồi phản ứng PCR thiết kế dựa trình tự adaptor chứa trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide Chỉ phân đoạn DNA chứa trình tự adaptor trình tự nucleotide chọn lọc khuếch đại, trình tự chọn lọc làm giảm xuất sản phẩm PCR làm đơn giản q trình phân tích c Qui trình Qui trình thực AFLP gồm bốn bước: Bước 1: Cắt (Digestion) Dùng enzim giới hạn EcoRI (ít có = 4096 bases) có trình tự nhận biết base MseI (thường có = 256 bases) có trình tự nhận biết base, cắt DNA khuôn thành phân đoạn Hai enzym giới hạn dùng để xếp lại DNA nhờ kết hợp với adaptor có cấu trúc làm cho dây DNA khơng trở lại hình dạng ban đầu Vị trí cắt enzim EcoRI = 5’-G AATT C-3’ 3’-C TTAA G-5’ MseI = 5’-T TA A-3’ 3’-A AT T-5’ 26 Bước : Nối (Ligation) Nối với EcoRI adaptor MseI adaptor, oligonucleotide sợi đôi gắn vào đầu phân đoạn DNA Cấu trúc adaptor sau : EcoRI-adaptor 5'CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGTTAA-5' MseI-adaptor 5'GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5' Bước : Tiền khuếch đại - Chạy PCR với mồi (primer) chọn lọc, mồi cấu tạo gồm phần : trình tự nồng cốt (CORE) + trình tự theo enzim (ENZ) + trình tự chọn lọc (EXT) (theo định hướng người nghiên cứu ký hiệu NNN, TGA AAC CTG ) Nhờ vậy, phân đoạn có nu bổ sung với nu chọn lọc nhân lên Sự khuếch đại chọn lọc làm giảm số lượng phân đoạn hàng ngàn lần Chỉ đoạn DNA ngắn có đầu primer MseI đầu primer EcoRI khuếch đại đáng kể, đoạn có hai đầu EcoRI bị số lượng hai đầu MseI tự tạo thành vòng nhỏ DNA cạnh tranh với primer Sản phẩm tiền phản ứng pha loãng dùng làm vật liệu để khuếch đại với đoạn mồi chọn lọc màu huỳnh quang Bước : Khuếch đại Sản phẩm PCR bước tiền khuếch đại dùng làm khuôn cho bước khuếch đại sau đó, sử dụng primer có gắn nu chọn lọc đầu 3’ EcoRI primer đánh dấu huỳnh quang đầu 5’ Vì vậy, sợi chứa EcoRI phát máy ABI 310 PCR xảy với thông số miêu tả Cervera ctv (1996) Phản ứng bắt đầu với nhiệt độ cao gắn mồi tối hảo cho mồi chọn lọc Nhiệt độ giảm dần làm tăng kết hợp Sử dụng primer gắn với nu chọn lọc giúp hạn chế việc bắt cặp sai (mismatch), nhân lên số lượng lớn băng chuyên biệt Ngoài ra, việc khuếch đại qua bước có thuận lợi khuếch đại trực tiếp như: - Phổ diện rõ khơng có q nhiều loại marker - Qua bước tiền khuếch đại, tạo lượng lớn DNA khuôn cho khuếch đại dễ dàng hiệu Sau xong phản ứng, mẫu biến tính cách thêm lượng tương đương thể tích 15µl dung dịch đệm Formamide đun nóng 5’ 95oC 1ml mẫu nạp tự động vào ống mao quản (capilary) polymer ABI 310 d Ưu nhược điểm kỹ thuật AFLP * Ưu điểm kỹ thuật AFLP - AFLP không phức tạp RFLP khảo sát tồn gen - Có tính lặp lại cao RAPD cần sử dụng lượng nhỏ DNA ban đầu (2.5pg25ng) - Khuếch đại có chọn lọc lượng lớn đoạn DNA đa hình (polymorphism) phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng quần thể có quan hệ gần - Khơng cần biết trước trình tự DNA gen cần nghiên cứu, không cần sử dụng nhiều loại primer 27 - Là kỹ thuật in dấu DNA cịn lạ hiệu quả, in dấu DNA nguồn gốc phức tạp từ sinh vật sơ hạch, thực vật, động vật đến người * Nhược điểm - Tuy nhiên AFLP marker trội, điều làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp dị hợp - Qui trình dài, phức tạp, tốn nhiều thời gian thực - Lệ thuộc nhiều vào thao tác bước đầu để có phổ diện phân đoạn DNA lý tưởng e Ứng dụng - In dấu DNA, lập đồ DNA marker có hiệu so với marker khác (Vos ctv., 1995) - Tạo nhóm liên kết di truyền giống - Đánh giá mức độ liên hệ di truyền khác giống - Là công cụ hiệu để phát tính chất đa hình nên dễ dàng nhận biết khác biệt cá thể CÂU HỎI ÔN TẬP Kỹ thuật ELISA gì? PCR ? RFLP ? RAPD ? AFLP ? SSR ? Kỹ thuật DNA tái tổ hợp ứng dụng ? Ưu nhược điểm phương pháp công nghệ sinh học đại ? TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002 Sinh học phân tử NXB Giáo dục Phạm Thị Thùy, 2004 Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật NXB Đại học quốc gia Hà Nội Trần Thị Thanh, 2003 Công nghệ vi sinh NXB Giáo dục 28 ... Engineering) công nghệ gen (Gen Engineering) Công nghệ Protein công nghệ gen xun suốt trở thành cơng nghệ chìa khóa nằm công nghệ sinh học thực vật, công nghệ sinh học động vật công nghệ sinh học vi sinh. .. nhân sinh học tham gia vào q trình cơng nghệ, chia thành nhóm sau: - Cơng nghệ sinh học thực vật (Plant Biotechnology) - Công nghệ sinh học động vật (Animal Biotechnology) - Công nghệ sinh học. .. Giáo trình Cơng nghệ sinh học Bảo vệ thực vật mơn học nói ứng dụng lĩnh vực công nghệ sinh học bảo vệ thực vật Do qua mơn học giúp cho sinh viên nắm nguyên lý kỹ thuật sử dụng phổ biến CNSH thực