Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa

Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa

 ………

VŨ NGỌC LAN

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ðIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG

VÀ MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG

HAI LOÀI LAN BẢN ðỊA (DENDROBIUM NOBILE LINDL., DENDROBIUM CHRYSANTHUM LINDL.) TẠI HÀ NỘI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Trồng trọt

Mã số : 62 62 01 01

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

2 TS NGUYỄN VĂN GIANG

HÀ NỘI - 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, hình ảnh, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ học vị nào Các tài liệu trích dẫn ñược chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cám ơn

Tác giả

Vũ Ngọc Lan

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ựến PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh và TS Nguyễn Văn Giang, là thầy cô ựã tận tình dìu dắt, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện ựề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo cùng toàn thể ựồng nghiệp Viện Sinh học Nông nghiệp, Bộ môn Sinh lý Thực Vật, Khoa Nông học, Khoa Công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ Sinh học, Viện đào tạo Sau ựại học, Phòng Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã tạo ựiều kiện giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ựề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến ban lãnh ựạo cùng các chuyên viên Vụ Khoa học Công nghệ và Môi trường Bộ Giáo dục và đào tạo ựã tạo ựiều kiện, hướng dẫn tận tình ựể tôi ựược thực hiện 01 ựề tài trọng ựiểm cấp

Bộ, cũng chắnh là nguồn kinh phắ chủ yếu ựể tôi ựủ khả năng triển khai nghiên cứu và thu ựược các kết quả trong bản luận văn này

Tôi xin ựược bày tỏ tỏ lòng biết ơn và tình cảm yêu thương nhất của mình tới bô mẹ, chồng, anh chị em và bạn bè ựã cho tôi ựộng lực và tạo ựiều kiện trong quá trình học tập và nghiên cứu

1.1 Giới thiệu chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) và hai loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl (D.nobile) và Dendrobium

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố của chi Hoàng Thảo (Dendrobium) 21 1.1.2 Phân bố của chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) tại Việt Nam 21 1.1.3 ðặc ñiểm thực vật học chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) 24 1.1.4 Một số ñặc ñiểm chính về 2 loài lan bản ñịa Dendrobium

nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl 27 1.1.5 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác một số loài lan Hoàng

1.2 Cơ sở khoa học của các kỹ thuật nuôi cấy nhân giống trong ñề tài 32 1.2.1 Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 32

1.2.2 Nhân giống bằng bioreactor 35

1.2.3 Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro 38

1.3.4 Ảnh hưởng của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên 46

1.3.6 Nhân giống in vitro Dendrobium nobile và Dendrobium

1.4.1 Các ñiều kiện cơ bản ñể trồng lan Dendrobium 53

1.4.2 Nghiên cứu về nuôi trồng cây lan Dendrobium sau nuôi cấy mô 57 Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 60

2.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp ñánh giá 72

3.1 Xác ñịnh lựa chọn phương pháp khử trùng, cơ quan nuôi cấy ñể

tạo nguồn vật liệu in vitro với hai loài lan D.nobile và

3.1.1 Xác ñịnh hiệu quả khử trùng ñối với chồi mầm trong H2O2

3.1.2 Xác ñịnh phương pháp khử trùng ñối với quả lan 76 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố ñến khả năng nhân nhanh,

tạo cây hoàn chỉnh in vitro ñối với hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum theo phương pháp nuôi cấy mô truyền thống 78 3.2.1 Ảnh hưởng của nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân

3.2.2 Ảnh hưởng của các hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân

3.2.3 Ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả năng nhân

3.2.4 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến khả năng nhân

nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan rừng D.nobile 92 3.2.5 Ảnh hưởng của các hàm lượng chuối chín ñến khả năng

nhân nhanh cụm chồi của 2 loài lan D.nobile và

3.2.6 Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến sinh trưởng

của chồi lan với 2 loài lan D.nobile và D.chrysanthum 99 3.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng tới khả năng

sinh trưởng của chồi lan D.nobile và D.chrysanthum 100 3.2.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) ñến khả

năng sinh rễ của chồi loài lan D.nobile và D.chrysanthum 102

3.3 Nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro ñối với hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum theo phương pháp nuôi cấy cải tiến 105

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử

dụng nút bông ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử

dụng nút màng thoáng khí ñến khả năng nhân nhanh

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến quá

trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy

3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến quá

trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy

lỏng lắc thoáng khí ñối với loài lan D.nobile 108 3.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương thức nuôi cấy ñến

khả năng nhân nhanh cụm chồi ñối với loài lan

3.4 ðặc ñiểm sinh trưởng của cây con in vitro hai loài lan D.nobile

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ra cây ñến tỷ lệ sống và

chất lượng cây con ngoài vườn ươm của 02 loài lan D.nobile

Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống và chất lượng cây

con ngoài vườn ươm của 02 loài lan D.nobile và

3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng ñến

chiều cao, số lá cây in vitro trên 02 loài lan (D.nobile và

3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số tác nhân trong giai ñoạn nuôi

trồng cây thu thập của hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum 121

3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng ñến sinh trưởng trên

2 loài lan rừng thu thập D.nobile và D.chrysanthum ở vườn

3.5.2 Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến sinh trưởng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

D.chrysanthum Dendrobium chrysanthum Lindl

CV(%) Hệ số biến ñộng (Correlation of Variants)

α NAA α Naphtyl acetic axit

LSD Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.05

(Least Significant Difference)

DANH MỤC BẢNG

1.2 Thực trạng phân bố, giá trị sử dụng làm dược liệu của chi Hoàng

1.3 Phân hạng mức ñộ bị ñe dọa của một số loài chi lan Hoàng thảo

1.4 Một số loại mô cấy và kết quả ñạt ñượctrong nhân giống vô tính

3.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng ñến khả năng sống của

3.2 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng ñến khả năng sống của

3.3 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng ñến tỷ lệ mẫu sống và

nẩy mầm của 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum 76 3.4 Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân

nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile(Sau 8 tuần

3.5 Ảnh hưởng của nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân nhanh

3.6 Ảnh hưởng của các hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân

nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan rừng D.nobile (Sau

3.7 Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh

3.8 Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả

năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan rừng

3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến khả năng nhân nhanh

thể sinh chồi (protocorm) loài lan D.nobile(Sau 8 tuần nuôi cấy) 93 3.10 Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả

năng nhân nhanh cụm chồi 02 loài lan D.nobile và

3.11 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến khả năng nhân nhanh

3.12 Ảnh hưởng của các loại nền môi trường cơ bản ñến sinh trưởng

của chồi lan của 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum (Sau 6

3.13 Ảnh hưởng của cường ñộ chiếu sáng ñến sinh trưởng chồi của 02

loài lan D.nobile và D.chrysanthum(Sau 30 ngày nuôi cấy) 101 3.14 Ảnh hưởng của than hoạt tính ñến khả năng tạo rễ của chồi 02

3.15 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh

thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài lan D.nobile (Sau 3 tuần

3.16 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh

thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài lan D.nobile (Sau 3 tuần

3.17 Ảnh hưởng của hàm lượng ñường saccaroza ñến khả năng nhân

nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile trong nuôi

3.18 Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh

thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile trong nuôi cấy lỏng

3.19 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh

cụm chồi của loài lan D.chrysanthum(Sau 4 tuần nuôi cấy) 110

3.20 Ảnh hưởng của thời vụ trồng ñến tỷ lệ sống và hình thái câycon

in vitro ngoài vườn ươm của 02 loài lan D.nobile và

3.21 Ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống và hình thái cây con in

vitro 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum ngoài vườn ươm 112

3.22 Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng chiều

cao cây và số lá trên cây in vitro của 02 loài lan D.nobile và

3.23 Ảnh hưởng của giá thể ñến ñộng thái tăng chiều dài cành, ñường

kính thân và số chồi của loài lan rừng thu thập D.nobile 121

3.24 Ảnh hưởng của giá thể ñến ñộng thái tăng chiều dài cành, ñường

kính thân và số chồi của loài lan rừng thu thập D.chrysanthum

3.25 Ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñộng thái

tăng trưởng chiều dài cành, ñường kính thân, số lá, số chồi của

3.26 Ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng qua láñến tỷ lệ ra hoa

và kích thước hoa của loài lan rừng thu thập D.nobile 131

3.27 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡngñến ñộng thái tăng

chiều cao, ñường kính thân, số lá và số chồi TB/cây của loài lan

DANH MỤC HÌNH

3.4 Ảnh hưởng của nền môi trường ñến ñộng thái tăng ñường kính

3.5 Ảnh hưởng của nền môi trường cơ ñến ñộng thái nhân nhanh

3.6 Ảnh hưởng của nền môi trường ñến ñộng thái nhân nhanh cụm

3.7 Minh họa nền môi trường cơ bản ñến nhân nhanh cụm chồi loài

3.8 Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến ñộng thái tăng ñường

kính cụm thể sinh chồi của loài lan rừng D.nobile 85 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến ñộng thái tăng chồi loài

3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến ñộng thái tăng chồi loài

3.11 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến ñộng thái tăng ñường

3.12 Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến ñộng

3.13 Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến ñộng

3.14 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến ñộng thái nhân nhanh

3.15 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến ñộng thái nhân nhanh

3.16 Ảnh hưởng của cường ñộ chiếu sáng ñến khả năng sinh trưởng

3.17 Ảnh hưởng của hàm lượng THT ñến khả năng ra rễ của cây lan

3.18 Nuôi cấy lỏng lắc nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) loài lan

3.19 Nuôi cấy thoáng khí trong môi trường ñặc với loài D.nobile 108

3.21 Nhân nhanh cụm chồi của loài D.chrysanthum bằng nuôi cấy

3.23 Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng chiều

3.24 Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng chiều

cao cây in vitro của loài lan rừng D.chrysanthum 116 3.25 Ảnh hưởng của chế phẩm sinh dưỡng ñến ñộng thái tăng số lá

3.26 Ảnh hưởng của chế phẩm sinh dưỡng ñến ñộng thái tăng số lá

trên cây in vitro của loài lan rừng D.chrysanthum 117

3.28 Ảnh hưởng của giá thể ñến ñộng thái tăng chiều dài cành của loài

3.29 Ảnh hưởng của giá thể ñến ñộng thái tăng ñường kính thân của

3.30 Ảnh hưởng của giá thể ñến ñộng thái tăng số chồi của loài lan

3.31 Cây D.nobile trồng trên giá thể than củi ngoài vườn sản xuất 123 3.32 Ảnh hưởng của giá thể ñến ñộng thái tăng chiều dài cành của loài

3.33 Ảnh hưởng của giá thể ñến ñộng thái tăng ñường kính thân của

3.34 Ảnh hưởng của giá thể ñến ñộng thái tăng số chồi của loài lan

3.35 Ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñộng thái

tăng chiều dài cành của loài lan rừng thu thập D.nobile 128 3.36 Ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñộng thái

tăng ñường kính thân của loài lan rừng thu thập D.nobile 128 3.37 Ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñộng thái

3.38 Ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñộng thái

tăng số chồi của loài lan rừng thu thập D.nobile 129 3.39 Ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñường kính,

3.40 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng

3.41 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng

3.42 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng

3.43 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng

MỞ đẦU

1 Tắnh cấp thiết của ựề tài

Trong thế giới các loài hoa có thể nói hoa lan là loài hoa có vẻ ựẹp quyến rũ mê hồn về mầu sắc và hương thơm, ựặc biệt là các ựường nét của hoa thật cầu kỳ, sắc sảo, thêm vào ựó hoa lan có ựặc tắnh bền và tươi lâu (Trần Hợp, 1989) [9] và (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006) [46] Ngoài các giá trị làm cảnh và trang trắ, hoa lan còn ựược sử dụng với nhiều mục ựắch

khác nhau như: Dùng làm thực phẩm (giống Orchis), rau xanh (giống Anoetochilus), trà uống (loài Jumellea fragrans), hương liệu (Vannila plannifolia) và ựặc biệt lan còn ựược dùng làm dược liệu, có tác dụng chữa bệnh như một số loài thuộc chi Orchis, Platanthera, Gymnadenda, Dactylorhiza và ựặc biệt là chi Hoàng thảo (Dendrobium nobile, Caulis Dendrobium, Dendrobium loddgesii, Dendrobium chrysanthum, Dendrobium fimbriatum, Dendrobium nobile Lindi), (Lê Trần đức, 1977) [7], (đỗ Huy

Bắch, 2004) [3] và (Dương đức Huyến, 2007) [17]

Hoàng Thảo là một trong những chi lớn nhất của của họ Lan (Orchidaceae) Theo A Takhajan (1966) chi Hoàng Thảo trên thế giới có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố ở lục ựịa đông Nam Á và các ựảo thuộc Philippin, Malaixia, Inựonêxia, Niu Ghinê, đông Bắc Ôxtrâylia Ở Việt Nam hiện biết 107 loài và 1 thứ thuộc chi Hoàng Thảo phân bố chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc vào Nam và trên một số ựảo ven biển (đào Thị Thanh Vân, đặng Thị Tố Nga, 2008) [55]

Tuy nhiên, trong quá trình phát triển kinh tế xã hội, do những nguyên nhân khác nhau, nhiều loài Hoàng Thảo ở nước ta ựã bị tuyệt chủng hoặc bị ựe dọa tuyệt chủng (Nguyễn Xuân Linh, 2002) [23] Năm 2004, một số loài lan thuộc chi lan Hoàng Thảo ựã có trong danh lục đỏ của ỘSách ựỏ Việt NamỢ như: Kim điệp

(Dendrobium fimbriatum Hook 1823), Ngọc Vạn Vàng (Dendrobium chrysanthum Lindl 1830), Thuỷ Tiên Hường (Dendrobium amabile (Lour.)

O’Brien, 1909), Hạc Vĩ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) C Fisch 1928), Hoàng Thảo hoa trắng - vàng (Dendrobium nobile var albolu-teum) (Huyen & Aver 1989)[67], (Phan Thúc Huân, 1989) [14] và Dương ðức Huyến, 2007) [17]

Do vừa có giá trị làm cây hoa cảnh vừa làm cây dược liệu nên hai loài

lan bản ñịa của vùng núi và trung du phía Bắc là Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.) và Ngọc vạn vàng (Dendrobium chrysanthum Lindl.) thuộc chi

Hoàng thảo ñã bị khai thác kiệt quệ với số lượng hàng trăm nghìn giò khai thác/năm ðặc biệt, hai loài lan rừng này còn ñược xuất khẩu tiểu ngạch sang Trung Quốc với giá rất cao nên tốc ñộ khai thác ngày càng tăng và dẫn ñến nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên Như vậy, ñể có thể bảo tồn và phát triển hai loài lan quý hiếm này nhằm phục vụ ñược nhu cầu tiêu dùng thì không còn ñường nào khác là phải tiến hành nhân giống và nuôi trồng chúng ở quy

mô lớn (Trần Hợp, 1989) [11], (Nguyễn Tiến Bân, 1990a) [2] và Dương ðức Huyến, 2007) [17]

Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt nam, phương pháp nuôi cấy mô

là phương pháp duy nhất có thể nhân giống cây lan cho hệ số nhân cao, số lượng cây giống lớn và giá thành cây giống hợp lý (Lê Văn Hòa, 2008) [9] và (Trần Hợp, 1990) [12] Tuy nhiên, cho ñến nay ở nước ta, nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng lan Hoàng thảo chủ yếu trên các giống lan lai nhập nội nhằm sản xuất hoa cắt cành hay trồng chậu làm cây cảnh Việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô ñặc biệt sử dụng nuôi cấy mô cải tiến hai loài lan

bản ñịa: Dendrobium nobile Lindl (D.nobile) và Dendrobium chrysanthum Lindl (D.chrysanthum) chưa có ñề tài nghiên cứu nào ñề cập ñến (Trần Văn

Huân, Văn Tích Lượm, 2007) [16]

Xuất phát từ những vấn ñề nêu trên, chúng tôi ñã tiến hành ñề tài:

“Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng hai loài lan bản ñịa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội” với mong muốn góp

phần làm cơ sở cho việc tạo ñược nguồn cây giống không chứa các chất ñiều tiết

sinh trưởng thực vật tổng hợp phục vụ cho sản xuất nguyên liệu dược

2 Mục tiêu và yêu cầu của ñề tài

2.1 Mục tiêu của ñề tài

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết

sinh trưởng thực vật tổng hợp ñể góp phần làm cơ sở duy trì, phát triển nguồn

gen ñồng thời thúc ñẩy việc nuôi trồng cây lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl như một nghề sản xuất

nguyên liệu dược mang lại hiệu quả kinh tế

2.2 Yêu cầu của ñề tài

+ Xác ñịnh ñược phương pháp thích hợp ñể tạo nguồn vật liệu in vitro ñối với loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl

+ Xác ñịnh ñược các bước kỹ thuật nhân nhanh in vitro theo hướng

không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng tổng hợp ñối với loài lan bản ñịa

Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl

+ Xác ñịnh ñược một số khâu kỹ thuật cải tiến trong nhân giống loài

lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl ñể

có hệ số nhân giống cao và chất lượng cây in vitro tốt

+ Xác ñịnh ñược một số khâu kỹ thuật nuôi trồng loài lan bản ñịa

Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl trong giai ñoạn

- Kết quả nghiên cứu của ñề tài là dẫn liệu khoa học có giá trị về khả

năng nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng và những

chỉ dẫn ảnh hưởng của giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ựến sinh trưởng của hai

loài lan bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum

Lindl thuộc chi Hoàng Thảo ựang có nguy cơ tuyệt chủng ở Việt Nam

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Góp phần bảo tồn và phát triển loài lan rừng bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl

- đề tài ựã ựề xuất ựược quy trình nhân giống in vitro không sử dụng

chất ựiều tiết sinh trưởng và bước ựầu ựưa ra kỹ thuật chăm sóc cây thu thập

của loài lan rừng bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl tại Gia Lâm - Hà Nội

4 đối tượng và phạm vị nghiên cứu của ựề tài

4.1 đối tượng nghiên cứu của ựề tài

- Hai loài lan rừng bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl thuộc chi Hoàng thảo

- Các nền môi trường nuôi cấy cơ bản của Vacin and Went, 1949 (VW); KnudsonC, 1965 (KC), Murashige-Skoog, 1962 (MS), Robert Ernst, 1979 (RE)

- Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: khoai tây, cà rốt, táo, chuối chắn

- Các yếu tố ảnh hưởng ựến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tắnh,

- Hệ thống bioreactor do hãng Sartorius sản xuất, mã hiệu máy Biostat Bplus có thể tắch tối ựa 10 lắt

- Các giá thể: Bột dừa, xơ dừa, than củi, gỗ nhãn, dương xỉ

- Các chế phẩm dinh dưỡng: Antonic, Yogen, Komix, Growmore, đầu trâu

4.2 Phạm vi nghiên cứu của ựề tài

Các nghiên cứu ựược tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội; Học viện Hậu Cần - Ngọc Thụy - Long Biên - Hà Nội

5 đóng góp mới luận án về học thuật và lý luận

- đã xây dựng ựược quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan bản

ựịa D.nobile Lindl và D.chrysanthum Lindl có nguy cơ tuyệt chủng không

sử dụng chất ựiều tiết sinh trưởng

- đã sử dụng thành công kỹ thuật cải tiến trong nhân nhanh hai loài lan bản ựịa bằng kỹ thuật thoáng khắ và biorector ựạt hệ số nhân cao

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) và hai loài lan bản ựịa

Dendrobium nobile Lindl (D.nobile) và Dendrobium chrysanthum

Lindl (D.chrysanthum)

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố của chi Hoàng Thảo (Dendrobium)

Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) ựược ựặt tên vào năm 1799, Dendrobium ựược hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là chi lan

Hoàng Thảo Lan Hoàng Thảo có nhiều màu sắc và hình thái khác nhau (Nguyễn Tiến Bân, 1990a) [1] và Trần Duy Quý, 2005 [36]

Lan Hoàng Thảo là chi lan phong phú nhất, trong họ lan có 1600 loài nguyên thủy ựược phân chia thành 40 nhóm, phân bố ở các vùng nhiệt ựới

châu Á, tập trung nhiều nhất ở đông Nam Á và châu Á Dendrobium không

có kiểu hoa chung, mà rất ựa dạng Chúng phân bố ở cả ba vùng khắ hậu như: nóng, lạnh và trung gian (Võ đức Tri, Dương đức Tiến, 1978a) [4], Võ đức Tri, 1978b) [5] và (Chu Ngọc Mỹ và cs, 2009) [28]

1.1.2 Phân bố của chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) tại Việt Nam

Theo các tác giả Nguyễn Tiến Bân (1990 a) [1], Trần Hợp (1990) [12]

cây lan Hoàng Thảo thuộc chi Dendrobium, phân loại như sau:

Chi Hoàng Thảo (Dendrobium) là một chi lan lớn nhất trong họ lan Chi

lan này ựa dạng và phong phú có hơn 1000 loài, xuất xứ từ Ấn độ ựến Á Châu, Hàn Quốc rồi Nhật Bản xuống tới châu Úc nhưng nhiều nhất vẫn là khu vực đông Nam Á Số lượng các loài lan Hoàng Thảo Việt Nam ựược ghi nhận là

107 loài (đào Thị Thanh Vân, đặng Thị Tố Nga, 2008) [55] Gần ựây nhiều loài lan Hoàng Thảo mới ựược phát hiện và mô tả mới

Các loài lan Hoàng Thảo có mặt ở tất cả các vùng sinh thái trong cả nước, phân bố chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc vào Nam và trên một số ựảo ven biển nước ta Các ựại diện của chi Hoàng Thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên ựá, thường ở nơi ẩm, thường mọc ở ựộ cao 500 Ờ 1500m so với mực nước biển nhưng có khi gặp chúng mọc ở ựộ cao 200m hoặc tới 2000m Sự phân bố của các loài lan Hoàng thảo theo các vùng ựịa lý của Việt nam như sau (Dương

đức Huyến, 2007) [17] và dẫn theo nguồn: (caycanhvietnam.com) [107]

* Khu đông Bắc Bộ: Là trung tâm phân bố của các chi, loài phong lan

á nhiệt ựới, cũng như nhiệt ựới chịu ảnh hưởng rất lớn về thành phần loài từ khu vực Hymalaya, Nam Trung Hoa có các loài chịu ựược lạnh của chi

Dendrobium (Hoàng Thảo): Dendrobium salaccense Lind., Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium loddigesii Rolfe

* Vùng Tây Bắc: Từ hữu ngạn sông Hồng (chân núi Con Voi) ựến các

vùng núi giáp nước Lào, ắt ảnh hưởng gió mùa đông Bắc nên ở ựây ắt lạnh hơn ngược lại mùa hạ lại nóng sớm và có kèm theo gió Lào Các chi loài phong lan ở

ựây có khả năng chịu nóng hơn như các loài trong chi Dendrobium (lan Hoàng Thảo) Dendrobium fimbriatum Hook., Dendrobium chryseum, Dendrobium peru latum, Dendrobium chrysanthum Lind và gần gũi với hệ thực vật họ phong

lan vùng thượng Lào (Khuất Hữu Trung và cs, 2007) [51]

* Trung du Bắc Bộ: Vùng này có rất nhiều loài của chi lan Hoàng thảo

như: Dendrobium longicornu Lind., Dendrobium williamsonii, Dendrobium

brymerianum, Dendrobium chrysanthum Lind., Dendrobium evaginatum, Dendrobium wardiannum, Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium pendulum Roxb, Dendrobium parishii, Dendrobium devonianum, Dendrobium loddigesii Rolfe.Ầ

* Vùng Bắc Trung Bộ: Thường gặp các loài như: Dendrobium

ellipsophyllum, Dendrobium delacourii, Dendrobium chrysotoxum, Dendrobium thyrsiflorum, Dendrobium amabile, Dendrobium podagraria Hook, Dendrobium parciflorum,Ầ

* Vùng cao Tây nguyên: Là vùng có cao ựộ trên 1.000m, ựịa hình ựồi

núi, khắ hậu lạnh ẩm, là nơi ưu thế phát triển của rừng cây thông 3 lá, dẻ, sồi

Loài lan Nhất điểm Hoàng (Dendrobium flavum) xuất hiện ở các thung lũng,

sườn núi, ựèo Prenn ựường vào đà Lạt, trên các cây sồi cây dẻ

* Vùng trung Tây nguyên: đây là vùng có cao ựộ trung bình 700 -

1.000m, ựịa hình nhiều ựồi núi, nhiệt ựộ thấp, khắ hậu ẩm mát Ở ựây còn là

vùng tập trung nhiều loại Dendrobium có hoa ựẹp nhất Việt Nam Một tập ựoàn Dendrobium gồm các loài: Lụa Vàng (D.heterocarpum), Hoàng Phi Hạc (D.signatum), Thủy Tiên các loại (D.densiflorum, D.haveynum, D.farmeri, D.thyrsiflorum, Long Tu (D.primulinum), Kim điệp

(D.capillipes) mọc xen kẽ nhau trên các cây dẻ, cây sồi trong các quần thể rừng diệp loại dọc theo triền núi, khe suối Nhất điểm Hồng (D.draconis)

sống trên các cây Dầu trà beng, Dầu ựồng, Dẻ trong các rừng hỗn giao Loài

Giả Hạc (D.anosum) nhiều nhất trên cây Cà chắ, ựôi khi trên các cây Giẻ sồi, một số ắt mọc trên ựá Loài Long Nhãn Kim điệp (Dendrobium fimbriatum) hầu như chỉ mọc trên ựá dọc suối ở Di Linh Loài Ý Thảo (D.gratiosissimum)

mọc trên các cây Dẻ về phắa đông hướng về Phan Rang, Phan Thiết Loài đại

Ý Thảo (D.aphyllum) chưa bao giờ ựược tìm thấy trên ựộ cao khỏi ựèo Bảo Lộc Loài Vảy Cá (D.Lindleyi) có ở Liên Kháng và Phi vàng Loại Thạch Hoa (D.linguella) hiếm gặp mọc trên các cây dẻ, cây sồi gần bờ suối hoặc trên

vách ựá lưng chừng xuống chân núi Một loài ựặc biệt chỉ mọc trên cây

thông là loài Bạch Hỏa Hoàng (Dendrobium bellatulum)

* Vùng Nam và Trung Trung bộ: đây là vùng tập trung nhiều loài lan quắ

và ựặc hữu của Việt Nam Ở Dục Mỹ, vùng Hòn Tre, Hòn Ngang có loài Giả

Hạc Vùng Khánh Dương có các loài Thủy Tiên Tắm (Dendrobium amabile), Hoàng Thảo Xuân (Dendrobium tortile), Tắm Huế (Dendrobium hercoglossum)

Tại vùng giáp ranh giữa Ninh Thuận - Khánh Hòa và đắk Lắk còn có các loài

lan ựặc hữu và quý hiếm như: Thái Bình (Dendrobium pulchellum), đơn Cam (Dendrobiunl unicum) (Nguyễn Văn Chương và Trịnh Văn Thịnh, 1991) [6]

* Vùng miền đông Nam Bộ: ở ựây có một số loài Hoàng thảo như: Bạch Câu (Dendrobium crumenatum), Nhất điểm Hồng (Dendrobium draconis), Tép Dẹp (Dendrobium flabellum), Ý Thảo (Dendrobium gratiosissimum), Vảy Rùa (Dendrobium nathanielis), Báo Hỉ (Dendrobium secundum)

Như vậy, dù các loài của chi lan Hoàng thảo ở Việt nam rất ựa dạng và phong phú nhưng sự phân bố của chúng khá ựặc thù cho các vùng ựịa lý khác

nhau Hai loài lan Thạch hộc (D.nobile) và Ngọc vạn vàng (D.chrysanthum)

chỉ ựược tìm thấy ở vùng Tây bắc, đông bắc và trung du Bắc bộ nước ta

Miền chóp rễ có chứa chất màu diệp lục nên rễ cũng làm một phần chức năng quang hợp cho cây

Các sợi rễ không bấu víu vào các vật xung quanh nên chúng có thể hút sương sớm chiều và làm chức năng quang hợp Rễ có hình trụ nhưng khi bám vào các vật cứng rễ bị bẹp ñi trên vết bám

Nói chung rễ của các loài lan dù phát triển thành nhánh cấp I và cấp II,

có khi cấp III nhưng không có rễ tóc nhỏ li ti như các loài thực vật khác Nếu tính về diện tích bề mặt của cả bộ rễ một cây lan thì quá nhỏ so với bề mặt rễ của các loài thực vật khác (Nguyễn Xuân Linh, 1998) [22] và (Nguyễn Công

Nghiệp, 2002) [29]

1.1.3.2 Thân

Có hai nhóm chính là ñơn thân và ña thân Thân lan có thể ngắn hay kéo dài, ñôi khi phân nhánh, mang lá hay không mang lá Ở nhóm ña thân thì cây vừa có thân vừa mang giả hành (Phạm Hoàng Hộ, 2000) [10]

Lan ña thân có các chi lan Kiếm (Cymbidium), Lan Hài (Paphiopendium), lan Vũ Nữ (Oncidium), Cát lan (Cattleya), lan Hoàng Thảo (Dendrobium) (Khuất Hữu Trung và cs, 2007) [52]

Thông thường, phần của cây lan nhìn thấy ñược chỉ có lá, hoa và cuống, chúng ñược mọc lên từ một ñoạn phình to, giống như củ hành nên người ta thường gọi là giả hành Giả hành là nơi dự trữ chất dinh dưỡng và nước ñể nuôi cây Giả hành có nhiều hình dạng tuỳ từng loại lan như dạng dẹt

thấy có ở Dendrobium nobile Lind Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa

ñầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng, bảo vệ tránh sự mất nước khi gặp ñiều kiện bất lợi (Trần Duy Quý, 2005) [36]

1.1.3.3 Lá

Lá mọc ñơn ñộc hoặc xếp dày ñặc ở gốc hay xếp ñều ñặn trên thân, trên

củ giả… Hình dạng lá thay ñổi rất nhiều, từ loại lá mọng nước, nạc, dài, hình kim, hình trụ dài, tiết diện dài hay có rãnh ñến loại lá phiến mỏng, dài, màu

xanh bóng ñậm hay nhạt tuỳ theo vị trí sống của cây, ñặc biệt rất hiếm loại lá hình tròn thuôn dài thành bẹ ôm lấy thân (Dương ðức Huyến, 2007) [17]

Lá thường có hai dạng: Dạng vảy ñính theo một ñoạn căn hành và dạng thực ñính trên giả hành Lá thường có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầng phân cách Khi phiến lá rụng vẫn còn ñoạn bẹ lá ôm lấy giả hành Vài loài lan không có cuống lá (Trần Duy Quý, 2005) [36]

Lá nguyên, mép nhẵn, màu xanh có các gân hình cung Lá thường hình mác, bầu dục, ñôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc ít khi lá hình thoi dài, hình nêm ðỉnh lá nhọn hoặc tù, rất nhiều trường hợp lá xẻ 2 thùy nhọn, tù hoặc là tròn lệch nhau Chiều dài của lá thay ñổi từ 1-19 cm và chiều rộng từ 0,3-3,5cm

Lá hình trụ thường có bề dày (từ 0,2-0,4cm) (Dương ðức Huyến, 2007) [17]

1.1.3.4 Cụm hoa

Cụm hoa chùm thường nhiều hoa, ñôi khi ít hoa hoặc ñơn ñộc Cụm hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài có cụm hoa ñẹp có giá trị làm cảnh (Dương ðức Huyến, 2007) [17]

1.1.3.5 Hoa

Cấu tạo hoa lan cực kì phong phú và hấp dẫn ða số các loài lan ñều nở

rộ nhiều hoa, tập hợp lại thành chùm phân bố ở ñỉnh thân hay nách lá Hoa lan

có cấu trúc cơ bản là hoa mẫu ba (hoa lan có 7 bộ phận gồm 3 cánh ñài bên ngoài, 3 cánh hoa và trụ của bông hoa ðoạn cuống tiếp giáp bông hoa, lá bầu hoa có 3 tâm bì chính là 3 ô của quả lan chứa ñầy các hạt nhỏ li ti gọi là tiểu noãn) kiểu hoa ñặc trưng của lớp một lá mầm nhưng ñã biến ñổi rất nhiều ñể hoa có ñối xứng qua một mặt phẳng Hoa lan thuộc hoa lưỡng tính, rất hiếm gặp loài ñơn tính, bao hoa có dạng cánh xếp thành 2 vòng (Nguyễn Tiến Bân, 1990a) [1] và (Trần Duy Quý, 2005) [36]

Hoa lưỡng tính, ñối xứng hai bên Màu sắc hoa ña dạng, sặc sỡ Hoa ña

số các loài có hương thơm, Bao hoa chia 2 vòng Vòng ngoài gồm 1 lá ñài giữa và 2 lá ñài bên Vòng trong gồm có 2 cánh hoa và một cánh môi (Dương ðức Huyến, 2007) [17]

1.1.3.6 Quả

Quả lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3 – 6 ñường nứt dọc Có dạng

từ quả cải dài ñến dạng hình trụ ngắn, phình ở giữa Khi chín, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía ñỉnh và gốc Ở một số loài khi quả chín nứt theo 1 – 2 khía dọc, thậm chí không nứt ra mà hạt chỉ ra khỏi vỏ khi vỏ này bị mục nát (ðỗ Tất Lợi, 1968) [24] và (ðỗ Huy Bích, 2004) [3]

So với những chi gần cận là Flickingeria, Epigeneium, Eria thì chi Dendrobium có những ñiểm phân biệt căn bản sau ñây:

- Các ñại diện Dendrobium luôn mọc thành cụm, thân phân ñốt, không mọc ñơn thân và có một lóng như các ñại diện của Flickingeria

- Dendrobium luôn có số lượng khối phấn là 4, không phải là 2 như ở chi Epigeneium hoặc là 8 ở chi Eria

- Chi Dendrobium không có lông mềm mịn trên lá và các bộ phận của hoa như ở chi Eria (Dương ðức Huyến, 2007) [17]

1.1.4 Một số ñặc ñiểm chính về 2 loài lan bản ñịa Dendrobium nobile

Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl

Một số ñặc ñiểm chính về 02 loài lan rừng D.nobile và D.chrysanthum (bảng 1.1)

Hình 1.1.Cấu tạo hoa

D.nobile Lindl

Hình 1.2.Cấu tạo hoa

D.chrysanthum Lindl

Bảng 1.1 ðặc ñiểm chính của hai loài lan nghiên cứu

Lai Châu (Bình Lư), Bắc Cạn (Na Rì), Lào Cai

Tên thông

thường

Hoàng thảo ñùi gà, Phi ñiệp kép, Hoàng phi hạc, Kim thoa thạch hộc, Hoàng thảo dẹt, Thạch hộc [2], [4]

Hoàng thảo vàng ánh, Hoàng thảo hoa vàng, Khô mộc hoa vàng, Trúc hoa thạch hộc, Ngọc Vạn Vàng Ánh [4], [17]

kính thân 1,5-1,8 cm, hình chùy, lóng dài 2,5 - 3,6 cm

Thân dài 70 - 120 cm, ñường kính thân 0,6 - 0,8 cm, hình trụ, thõng xuống, lóng dài 2 - 3,5 cm

thùy tù lệch, dài 6-10cm, rộng 2,5-4 cm

Lá hình mác nhọn, dài 10 - 16

cm, rộng 3-4 cm

trên thân còn lá Hoa màu trắng tím trắng, có ñường kính 5- 6 cm Cánh môi hình phễu, viền trắng, giữa môi có 1 ñốm lớn màu tím, khi trải phẳng có hình bầu dục; dài 2,8- 3 cm, rộng2,4- 2,5 cm Nở hoa tháng

1 – 5 [14], [17], [55]

Cụm hoa bên ngắn, 2- 4 hoa, mọc trên thân còn lá Hoa màu vàng tươi, ñường kính 3,5- 4 cm Cánh môi màu vàng hình phễu, khi trải phẳng có hình bán nguyệt hoặc gần tròn, dài 2,4- 2,6 cm, rộng 2,1- 2,3 cm; ở giữa

có 2 ñốm màu tím ñỏ; bề mặt phủ lông mịn Nở hoa tháng 7- 8

vừa phải, quả có 4 khối phấn, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh

Quả nang hình chùy, vỏ quả dày, quả có 4 khối phấn, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh

Công dụng Dùng trị ho khan, khô cổ;

ñau lưng mỏi gối, thiểu năng sinh dục

Dùng trị khô miệng, phổi kết hạch; dạ dày thiếu vị chua; di tinh, ra mồ hôi trộm, thắt lưng ñau mỏi

dụng

Toàn bộ cây do hoạt chất thường phân bố trong cây trồng là 0,58% (ở thân), 0,6%

1.1.5 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác một số loài lan Hoàng Thảo

bản ñịa tại miền Bắc Việt Nam

Với ñặc ñiểm rất ña dạng về kiểu dáng, sặc sỡ về màu sắc hoa và nở hoa vào nhiều thời ñiểm khác nhau nên các loài lan Hoàng thảo bản ñịa ở nước ta bị khai thác triệt ñể phục vụ nhu cầu trang trí, thưởng lãm Hơn thế nữa, một số loài thuộc chi Hoàng Thảo cũng là vị thuốc dân tộc cổ truyền dùng ñể chữa bệnh

Nhiều loài ñược sử dụng làm thuốc như: D.loddigesii Rolfe., D fimbriatum Hook Var.oculatum Hook., D.candidum Wall Ex Lindl., D.chrysanthum Wall ex Lindl., D.nobile Lindl (ðỗ Huy Bích, 2004) [3]

Theo Vũ Ngọc Lan và cộng sự, năm 2011, kết quả ñược trích dẫn từ báo

cáo tổng kết ñề tài: “Nghiên cứu thu thập, ñánh giá, nhân giống in vitro và nuôi

trồng một số giống lan chi Hoàng Thảo (Dendrobium) làm cây thuốc” ñược thể

hiện tại bảng 1.2 cho thấy: cũng giống như nguồn tài liệu cung cấp trong từñiển cây thuốc và trong cuốn những cây thuốc và ñộng vật làm thuốc ñã chỉ rõ có trên

11 loài lan chi Hoàng thảo thường ñược người dân vùng Tây Bắc, trung du phía

Bắc khai thác buôn bán, sử dụng trong số ñó Lan Thạch hộc (D.nobile Lindl.) là

nguyên liệu làm thuốc dùng phổ biến trong y học cổ truyền Nó có chứa các alcaloid như: sesquiterpen, dendrobin (alcaloid chính), nobilin, dendroxin, dendramin, dendrin, 8-hydroxydendroxin, 3-hydroxy-2 oxydendrobin, 6-hydroxydendroxin Hàm lượng dendrobin ở cây trồng là 0,58% (ở thân), 0,6% (lá)

và ở cây rừng là 3,2% (thân), 0,8% (lá), 0,08% (rễ) Thạch Hộc còn có một số alcaloid bậc 4, polysaccharid với hiệu suất 22,7%, tinh dầu chứa 54 thành phần, chủ yếu là manool (Lê Trần ðức, 1997) [7], (ðỗ Huy Bích, 2004) [3]

Lan Ngọc vạn vàng ánh (D.chysanthum Lindl.) cũng ñược coi là một loại

dược liệu quý Các nhà Khoa học thuộc Trường ðH Dược Nam Ninh - Trung

Quốc ñã chiết xuất ñược 2 loại alkaloid từ thân cây lan Dendrobium chysanthum,

ñó là: trans- và cis- dendrochysanines và cấu trúc của chúng ñược nhận biết là (2S)-N-trans-cinnamoyl-2-oxopropyrrolidine và (2S)-N-cis-cinnamoyl-2-oxopropyrrolidine dựa trên phương pháp quang phổ Các loại alkaloid này có tác

dụng ngăn cản mức ñộ mRNA của TNF-α, IL8, IL10 và iNOS trong ñại thực bào

(http://everything-orchids.com/Dendrobium-orchid.html) [110]

Bảng 1.2 Thực trạng phân bố, giá trị sử dụng làm dược liệu

của chi Hoàng Thảo (Dendrobium) ở phía Bắc Việt Nam

TT Tên khoa học Tên gọi theo

ñịa phương Giá trị sử dụng

ðịa phương phân bố

1 D.longicornu

Lindl

ðại giác Dùng trị nhiệt bệnh thương tổn

ñến tân dịch, miệng khô phiền khát, bị hư nhiệt sau khi khỏi

bệnh

Lào cai,

Hà Giang, Cao Bằng, Vĩnh Phúc

2 D.fimbriatum

Hook

Hoàng thảo long nhãn, Kim ñiệp

Dùng chữa ho khan, ñau lưng mỏi gối, thiểu năng sinh dục

Lai Châu, Lào Cai,

Hà Giang, Cao Bằng, Vĩnh Phúc

3 D.chryseum Rolfe Hoàng thảo

vàng tuyền

Dùng chữa ho khan, ñau lưng mỏi gối, thiểu năng sinh dục

Lai Châu, Lào Cai, Sơn La

4 D.chrysanthum

Lindl

Ngọc vạn vàng Dùng trị miệng khô, táo khát,

phổi kết hach, dạ dày thiếu vị chua, di tinh, ra mồ hôi trộm, thắt lưng ñau mỏi, bệnh nhiệt gây tổn tân dịch

Lai Châu,

Hà Giang, Cao Bằng

5 D.nobile Lindl Hoàng Thảo

ñùi gà, Thạch hộc

Dùng trị ho khan, khô cổ, chữa ñau lưng mỏi gối, thiểu năng sinh dục

Hà Giang, Vĩnh Phúc, Hòa Bình

6 D.devonianum

Paxt

Phương dung Dùng chữa bệnh sốt cao, thương

tổn bên trong cơ thể, miệng khô phiền khát, hư nhiệt, sau khi bị bệnh

Lào Cai, Vĩnh Phúc

7 D.loddigesii

Rolfe

Nghệ tâm Dùng trị bệnh nhiệt hại ñến tân

dịch, miệng khô phiền khát, hư nhiệt sau khi bị bệnh

Hồng câu Dùng chữa ho khan, ñau lưng

mỏi gối, thiểu năng sinh dục

Lào Cai

10 D.Lindleyi Steud Vảy rồng Dùng trị phổi nóng sinh to, hen

khan lao phổi, bệnh nhiệt sinh tân dịch

Hòa Bình

11 D.acinaciforme

Roxb

Chân rết lá xanh

Toàn cây làm thuốc bồi bổ cơ thể, chữa liệt dương, ra mồ hôi trộm

Sơn La,

Hà Giang

(Nguồn: Từ ñiển cây thuốc, những cây thuốc và ñộng vật làm thuốc và báo cáo tổng kết ñề tài

KH-CN cấp Bộ B2009-11-142Tð)

Bộ phận ñược sử dụng làm dựơc liệu của hai loài lan trên chủ yếu là thân lá Chúng không chỉ ñược tiêu thụ trong nước mà còn ñược các thương lái người Trung Quốc thu gom và xuất khẩu tiểu ngạch Giá bán của các cây lan rừng ñược thu gom cho các ñại lý thường từ 200.000ñ ñến 300.000ñ/kg tươi (Phan Thúc Huân, 1989) [14]

Do có giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao nên nhiều loài lan Hoàng thảo ñã bị khai thác ồ ạt, bừa bãi dẫn ñến nguy cơ bị tuyệt chủng hoặc bị ñe dọa tuyệt chủng Năm 2004, một số loài lan thuộc chi Hoàng Thảo ñã có

trong danh mục ðỏ của “Sách ñỏ Việt Nam” như: Kim ðiệp (Dendrobium fimbriatum Hook 1823), Ngọc Vạn Vàng (Dendrobium chrysanthum Lindl 1830), Thuỷ Tiên Hường (Dendrobium amabile (Lour.) O’Brien, 1909), Hạc

Vĩ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) C Fisch 1928), Hoàng Thảo hoa trắng - hồng (Dendrobium nobile var albolu-teum) (Huyen & Aver 1989)[67]

Tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUNC) có văn phòng ñóng tại Vạn Bảo - Hà Nội ñã phối hợp cùng các nhà Khoa học, các chuyên gia ñầu ngành trong nhiều lĩnh vực ñã thể theo tình trạng thực tế ñánh giá, phân tích với chi lan Hoàng Thảo nói riêng, ñể phân chia ra các loài lan với các cấp ñộ

sẽ nguy cấp, nguy cấp, nguy cấp - hiếm Từ ñó, tổ chức ñề xuất các loài ñưa vào danh mục cần ưu tiên, bảo vệ, nhân giống

Theo Dương ðức Huyến, 2007 [17] các loài lan ñang có nguy cơ tuyệt chủng hoặc bị ñe dọa tuyệt chủng do chúng mang lại giá trị làm cảnh, làm dược liệu nên lan ñã bị người dân khai thác bừa bãi, kiệt quệ ðể cảnh báo, ưu tiên cùng chung tay ñối với toàn thể cộng ñồng nhằm bảo vệ, nhân giống các

loài lan này, Dương ðức Huyến ñã tổng hợp ở bảng 1.3 sau:

Hai loài lan D.nobile, D.chrysanthum vừa có giá trị thẩm mỹ, ñặc biệt là

giá trị làm dược liệu cao và chúng ñều ở mức ñộ nguy cấp tuyệt chủng trong tự

nhiên Các loài lan rừng Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum

Lindl rất cần ựược ưu tiên nghiên cứu nhân giống, nuôi trồng nhằm bảo tồn phát triển ựược nguồn tài nguyên thực vật quý giá của Việt Nam

Bảng 1.3 Phân hạng mức ựộ bị ựe dọa của một số loài chi lan Hoàng thảo

tại Việt Nam (Dương đức Huyến, 2007) [17]

Tên khoa học Tên thông thường Mức ựộ ựe dọa

Loài hiếm (R)

Hoàng thảo long nhãn

VU - sẽ nguy cấp

1.2 Cơ sở khoa học của các kỹ thuật nuôi cấy nhân giống trong ựề tài

1.2.1 Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô, tế bào (nhân giống in vitro)

dựa trên cơ sở về tắnh toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào,

mô thực vật đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật ựã thực sự mang lại hiệu quả kinh tế to lớn (Vũ Văn Vụ và cs, 2001) [57], (Hoàng Minh

Tấn và cs, 2006) [37] Tắnh ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là

việc sử dụng các mô nuôi cấy có kắch thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ ựơn giản hơn, mô nuôi cấy dễ phân hóa và sau ựó dễ tái sinh hơn

Ngoài ra, nhân giống vô tắnh in vitro cho phép nhân giống cây trồng ở quy

mô công nghiệp (kể cả trên các ựối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), hệ số nhân cao và cho ra các cá thể sạch bệnh, hoàn toàn ựồng nhất

về mặt di truyền đó là ưu việt mà các phương pháp nhân giống khác không

có ựược (Razan MK , 1994) [89], (Hoàng Thị Lan Hương và cs, 2004) [18]

và (Võ Hà Giang, Ngô Xuân Bình, 2010) [8]

Kỹ thuật vi nhân giống ñược ứng dụng hiệu quả vào những mục ñích sau:

- Nhân nhanh kết hợp với làm sạnh virut, tạo hàng loạt cây giống có chất lượng cao cung cấp cho sản xuất

- Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác giống

- Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai ñể tạo hạt giống cây rau, cây hoa và các cây trồng khác

Theo Georger (1993) [62] quá trình nhân giống vô tính in vitro bao

gồm các bước sau:

Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây

mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh, ñặc biệt

là bệnh virus và ở giai ñoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong ñiều kiện môi trường thích hợp với chế ñộ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng

sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro

Bước 1: Nuôi cấy khởi ñộng

Là giai ñoạn khử trùng ñưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai ñoạn này

cần ñảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn ñúng loại mô, ñúng giai ñoạn phát triển của cây Quan trọng nhất là ñỉnh chồi ngọn, ñỉnh chồi nách và sau ñó là ñỉnh chồi hoa và cuối cùng là ñoạn thân, mảnh lá Chồi ngọn, chồi nách ñược sử dụng ñể nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…Ở súp lơ thì dùng hoa tự non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là nguyên liệu nuôi cấy thích hợp ñể

nhân nhanh in vitro Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể ñược sử dụng làm

mẫu cấy ban ñầu

Bước 2: Nhân nhanh

Là giai ựoạn kắch thắch mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con ựường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất ựịnh và tạo phôi vô tắnh Vấn ựề là phải xác ựịnh ựược môi trường và ựiều kiện ngoại cảnh thắch hợp ựể có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kắch thắch tạo chồi Chế ựộ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường ựộ ánh sáng 2000-4000 lux Tuy nhiên ựối với mỗi loại ựối tượng nuôi cấy ựòi hỏi có chế ựộ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ

cần quang chu kì chiếu sáng 9giờ/ngày, nhân nhanh phong lan Phaleanopsis ở

giai ựoạn ựầu cần che tối

Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường ựược bổ sung một lượng nhỏ auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất ựiều tiết sinh trưởng Theo Murashige, giai ựoạn này là giai ựoạn ưu tiên cho sự tạo rễ của chồi ựể sau ựấy có thể chuyển chúng sang môi trường trồng trọt tự nhiên Tạo

rễ cho chồi là một phần rất quan trọng của bất kỳ quy trình nhân in vitro nào

đôi khi một số chồi cần ựược kéo dài trước khi tạo rễ để giảm chi phắ nhân

giống, nhiều phòng thắ nghiệm chuyển chồi không rễ từ môi trường in vitro và

tạo rễ ở bên ngoài phòng nuôi cấy

Theo Debergh và Maene (1981) giai ựoạn này thường ựược chia thành: + Giai ựoạn a: kéo dài mầm hoặc chồi tạo thành ựể cung cấp chồi có kắch thước thắch hợp cho giai ựoạn tiếp theo

+ Giai ựoạn b: tạo rễ cho chồi in vitro hoặc ngoài tự nhiên (extra vitrum) Bước 4: Thắch ứng cây in vitro ngoài ựiều kiện tự nhiên

ðể ñưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần ñảm bảo một số yêu cầu:

+ Cây trong ống nghiệm ñã ñạt những tiêu chuẩn hình thái nhất ñịnh (số lá, số rễ, chiều cao cây)

+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp,

thoát nước

+ Phải chủ ñộng ñiều chỉnh ñược ẩm ñộ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế ñộ dinh dưỡng phù hợp

Có hai lý do chính gây khó khăn cho giai ñoạn này mà cần phải khắc phục là:

+ Chồi in vitro ñược tạo ra trong môi trường có ñộ ẩm cao và cường ñộ

ánh sáng thấp ðiều này làm cho lá có ít lớp sáp hơn hoặc sáp có thành phần hóa

học thay ñổi so với những cây mọc trong tự nhiên hay nhà kính Một số cây in vitro, khí khổng của lá có thể không bình thường, không có khả năng ñóng hoàn toàn trong ñiều kiện ñộ ẩm tương ñối thấp Do ñó cây in vitro mất nước nhanh

hơn khi ñưa ra môi trường bên ngoài (Sutter và Langhans, 1979, 1980)

+ Cây con in vitro là các cơ thể dị dưỡng, nguồn dinh dưỡng và năng

lượng ñều do môi trường nuôi cấy cung cấp Khi ñưa ra ñiều kiện tự dưỡng, ñiều này ñòi hỏi thời gian và ñiều kiện phù hợp ñể cây làm quen (Marin và Gella, 1987) Sự chuyển sang trạng thái tự dưỡng chỉ xảy ra sau khi cây ñó làm quen với ñiều kiện tự nhiên một thời gian (Trigiano RN and Gray DJ., 2000) [102]

1.2.2 Nhân giống bằng bioreactor

Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô truyền thống, thường ñược sử dụng trên môi trường có agar (thạch) phải trải qua nhiều công ñoạn nuôi cấy,

tỷ lệ mẫu nhiễm tăng, nhân công lao ñộng nhiều qua các khâu trong quá trình nhân giống, do ñó cần có một hệ thống nhân giống hiện ñại có thể nâng tần suất nhân giống lên quy mô công nghiệp là cần thiết ñể giảm thấp chi phí sản

xuất, giảm giá thành cây giống (Trần Văn Minh, 1999) [3] và (Nguyễn ðức Lương và cs, 2002) [26]

Sau ñó ñã có nhiều nghiên cứu cải tiến ñược sử dụng phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng có hay không có lắc, kết quả bước ñầu ñã nâng cao ñược hệ số nhân, giảm ñược giá thành cây giống nhưng phát sinh khi nuôi cấy trong môi trường lỏng có hay không có lắc thì mẫu cấy bị trương dẫn ñến hiện tượng thủy tinh thể do ngập quá lâu trong môi trường lỏng hoặc mẫu còn

bị những tổn thương trong quá trình lắc

Nhân giống trên quy mô lớn thực vật qua nuôi cấy phôi, mô, tế bào bằng kỹ thuật bioreactor ñang có nhiều triển vọng trong nhân giống cây trồng quy mô công nghiệp Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ñược cải tiến từ các loại bioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh Những bioreator chuyên biệt với môi trường lỏng thích hợp ñã ñược nghiên cứu và phát triển trên quy mô công nghiệp, hạn chế thấp nhất những vấn ñề hoại tử do

chồi in vitro bị thủy tinh thể và chi phí giảm thấp (Preil, 1991), (Ziv, 1999)

Ứng dụng công nghệ Bioreator trong nhân giống cho việc tái sinh chồi cao tránh các bệnh sinh lý và chủ ñộng sản xuất giống quanh năm trên những cây trồng có giá trị Trong bioreactor có hệ thống cung cấp, xả môi trường; hệ thống cấp, thoát khí vô trùng ñược thiết kế khoa học tạo ra một môi trường nuôi cấy vô trùng và kiểm soát ñược các yếu tố lý, hóa ở môi trường bên trong thùng nuôi cấy như ñiều chỉnh tốc ñộ lắc, mật ñộ thoáng khí, nhiệt ñộ dung dịch nuôi cấy, lượng oxy hòa tan, pH ) (Kozai et al., 1986) [75] và (Nguyễn

Cữ Thành Nhân và cs, 2007) [30] Hệ thống bioreactor có ba loại chính ñược phân biệt như sau:

- Loại dùng ñể sản xuất sinh khối (nhân nhanh khối tế bào, các ñơn vị phát sinh phôi, phát sinh cơ quan, chồi, rễ)

- Loại dùng ñể sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, enzyme

- Loại dùng cho việc chuyển hoá sinh học các chất chuyển hóa ngoại sinh (là các chất tiền thân trong quá trình trao ñổi chất)

Một số loại bioreactor hiện ñang ñược sử dụng trong nhân giống in vitro:

+ Bioreacter sục khí và sủi bọt hình trụ: cả 2 hình thức này ñều sử dụng khí vô trùng nhưng khác nhau về sự luân chuyển môi trường lỏng và thủy ñộng học Trở ngại khi sử dụng Bioreacter sục khí là sự tạo bọt và sinh trưởng trên thành bình, ñể chống tạo bọt phải sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc silicon, nhưng ảnh hưởng của silicon ñến sinh trưởng, trao ñổi chất của tế bào thì còn chưa ñược làm rõ (Leathers và cs, 1995; Lee,1997)

+ Bioreacter sủi bọt hình cầu: giải quyết ñược những hạn chế của bioreacter sủi bọt hình trụ, do hạn chế ñược thấp nhất sự tạo bọt, giảm sinh trưởng thành tế bào, thích hợp cho nuôi cấy và thu nhận rễ, nuôi cấy tế bào liên tục và thu nhận hoạt chất Thể tích thiết kế hiện nay từ 300 - 500 lit (Seon

và cs, 1998)

+ Bioreacter cánh khuấy: Hệ thống này thuận lợi cho việc trộn và phá vỡ

sự liên kết thể khí, ngăn chặn sự liên kết tế bào trên thành bình và gia tăng trao ñổi oxigen (Hooker và Lee, 1990) Tuy nhiên hệ thống ñiều khiển phức tạp, cần ñiều chỉnh tốc ñộ cánh khuấy, nuôi cấy tế bào và thể nhân giống dễ bị tác ñộng của lực nước (Leathers và cs, 1995)

+ Bioreacter bán chìm nổi: Hệ thống này làm thời gian tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, các chất kích thích sinh trưởng thích ứng với giai ñoạn nuôi cấy phát sinh phôi và các cơ quan khác, thích hợp với nhiều loại cây trồng Hệ thống này có thể thay thế trong giai ñoạn cấy truyền trong nhân giống truyền thống, hạn chế chi phí lao ñộng

Việc lựa chọn hệ thống bioreacter phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loại tế bào, quy mô nuôi cấy, phương pháp khuấy trộn, phương pháp thổi khí, khả

năng sinh trưởng và trao ñổi chất của tế bào trong môi trường nhân in vitro

Mỗi chủng loại bioreacter thường chỉ thích ứng với một số cây trồng và dòng

tế bào nuôi nhất ñịnh Quy trình nhân giống trong bioreactor ñược làm rõ về: môi trường nuôi cấy, EC, pH, ánh sáng, nhiệt ñộ, nhịp ñiệu chìm nổi, lưu lượng hỗn hợp khí vô trùng (Russell GE., 1988) [93], (Stewart L.Scott and Kane E Michael, 2006)[98] và (Thorpe TA, Stasolla C, Yeung EC, de Klerk G-J, Roberts, George EF, 2008) [100]

1.2.3 Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro

Môi trường nuôi cấy là ñiều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết ñịnh cho

sự phân hóa tế bào và cơ quan trong nuôi cấy Có nhiều loại môi trường nuôi cấy cho các loại thực vật khác nhau và mục ñích nuôi cấy khác nhau Dựa vào thành phần và hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các môi

trường nuôi cấy thành bốn nhóm sau (Trigiano R.N và GrayD.J., 1999) [101]

và (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [43]:

- Nhóm môi trường giàu dinh dưỡng: ðại diện là môi trường MS (Murashige - Skoogs, 1962) Nhóm môi trường này có hàm lượng muối khoáng cao, nhất là muối nitrat, amon, kali, các nguyên tố vi lượng ñầy ñủ Môi trường thuộc nhóm này thích hợp hầu hết các loại và ñối tượng nuôi cấy

- Nhóm môi trường ñủ dinh dưỡng: ñại diện là các môi trường N6, B5,

SH Nhóm này có hàm lượng dinh dưỡng ña lượng và vi lượng thấp hơn môi trường MS nhưng ñặc biệt có hàm lượng natri kali cao

- Nhóm môi trường nghèo dinh dưỡng: ñại diện cho nhóm này là môi trường Nitsch, Knop, KnudsonC

- Nhóm môi trường thích hợp ñể nuôi cấy các cây thân gỗ: môi trường WPM, DKW…

Trong các loại môi trường nuôi cấy nêu trên thì việc bổ sung thêm các hỗn hợp chất tự nhiên: là thành phần thường ñược sử dụng nhưng không phải

là bắt buộc trong tất cả các môi trường nuôi cấy Chúng làm gia tăng thành

phần dinh dưỡng và chất có hoạt tính sinh lý cho môi trường nên kích thích sự sinh trưởng và phân hoá của mẫu cây ðiều này ñặc biệt có ý nghĩa ñối với

nuôi cấy in vitro các cây dễ bị biến dị dưới tác ñộng của các chất ñiều tiết sinh

trưởng tổng hợp như cây lan Các hỗn hợp chất tự nhiên thường ñược sử dụng

bao gồm:

* Nước dừa: thường chứa các axit amin, axit hữu cơ, ñường, ARN,

ADN ðặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi

cấy in vitro ñó là: myoinositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosit

của cytokinin Do vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy nước dừa kích thích sự phân chia, sinh trưởng và phát sinh hình thái của tế bào, mô nuôi cấy Nước dừa thường ñược sử dụng rất hiệu quả trong việc thay thế các hợp chất ñiều tiết sinh trưởng tổng hợp nhân tạo khi nuôi cấy hoa lan (Mamoru Kusomoto, 1980) [81]

Nước dừa ñược sử dụng như là một chất truyền thống trong nuôi cấy

mô nhân giống cây trồng, trong nước dừa có nhiều các thành phần ñộc ñáo của các loại ñường, vitamins, khoáng chất, axit amin và chất ñiều tiết sinh trưởng Các loại ñường có trong nước dừa như: saccaroza, glucoza, fructoza, mannitol, sorbitol, myo-inositol, scyllo-inositol…; các vitamins như: C, B1, B2, B3, B5, B6, Folate, Folic axít, Biotin, Niacin…; khoáng chất như: Ca, Fe,

Mg, P, K, Na, Zn, Cu, Mn, Se, Cl, S, Al,…; axít amin như: alanin, ß-alanin, arginine, asparagine, glutamine, aspartic acid, cystine, glutamine acid, glycine, homoserine, histidine, isoleucine, lysine, methionine, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, praline, serine, tyrosine, tryptophan, threonine, valine, dihydroxyphenylaline, hydroxyproline, pipecolic acid,…; acid hữu cơ như: tartaric, malic, citric, acetic, pyridoline, succinic, shilinic, quinic acids…; chất ñiều tiết sinh trưởng thuộc nhóm: auxin; 1,3- diphenylurea; cytokinin Nhóm auxin có trong nước dừa chủ yếu là indole-3-acetic acid