Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)

Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội (luận văn tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ……… VŨ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ðIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG VÀ MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG HAI LOÀI LAN BẢN ðỊA (DENDROBIUM NOBILE LINDL., DENDROBIUM CHRYSANTHUM LINDL.) TẠI HÀ NỘI LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Trồng trọt Mã số : 62 62 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH TS NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI - 2012 i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, hình ảnh, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ học vị Các tài liệu trích dẫn ñược rõ nguồn gốc giúp ñỡ ñã ñược cám ơn Tác giả Vũ Ngọc Lan ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh TS Nguyễn Văn Giang, thầy cô ñã tận tình dìu dắt, hướng dẫn trình thực ñề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo toàn thể ñồng nghiệp Viện Sinh học Nông nghiệp, Bộ môn Sinh lý Thực Vật, Khoa Nông học, Khoa Công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ Sinh học, Viện ðào tạo Sau ñại học, Phòng Khoa học Hợp tác Quốc tế, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ suốt trình thực ñề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến ban lãnh ñạo chuyên viên Vụ Khoa học Công nghệ Môi trường Bộ Giáo dục ðào tạo ñã tạo ñiều kiện, hướng dẫn tận tình ñể ñược thực 01 ñề tài trọng ñiểm cấp Bộ, nguồn kinh phí chủ yếu ñể ñủ khả triển khai nghiên cứu thu ñược kết luận văn Tôi xin ñược bày tỏ tỏ lòng biết ơn tình cảm yêu thương tới bô mẹ, chồng, anh chị em bạn bè ñã cho ñộng lực tạo ñiều kiện trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Vũ Ngọc Lan năm 2011 iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt viii Danh mục bảng ix Danh mục hình xii MỞ ðẦU 16 Tính cấp thiết ñề tài 16 Mục tiêu yêu cầu ñề tài 18 Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài 18 ðối tượng phạm vị nghiên cứu ñề tài 19 ðóng góp luận án học thuật lý luận 19 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 21 Giới thiệu chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) hai loài lan ñịa Dendrobium nobile Lindl (D.nobile) Dendrobium chrysanthum Lindl (D.chrysanthum) 21 1.1.1 Nguồn gốc phân bố chi Hoàng Thảo (Dendrobium) 21 1.1.2 Phân bố chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) Việt Nam 21 1.1.3 ðặc ñiểm thực vật học chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) 24 1.1.4 Một số ñặc ñiểm loài lan ñịa Dendrobium nobile Lindl Dendrobium chrysanthum Lindl 1.1.5 Giá trị sử dụng thực trạng khai thác số loài lan Hoàng Thảo ñịa miền Bắc Việt Nam 1.2 Cơ sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy nhân giống ñề tài 1.2.1 27 Kỹ thuật nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật 29 32 32 iv 1.2.2 Nhân giống bioreactor 35 1.2.3 Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy in vitro 38 1.3 Các nghiên cứu nhân giống in vitro lan 42 1.3.1 Nghiên cứu lựa chọn mẫu nuôi cấy 43 1.3.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 44 1.3.3 Ảnh hưởng nguồn bon hữu 45 1.3.4 Ảnh hưởng hỗn hợp chất hữu tự nhiên 46 1.3.5 Ảnh hưởng phương thức nuôi cấy 47 1.3.6 Nhân giống in vitro Dendrobium nobile Dendrobium chrysanthum 1.4 Các nghiên cứu nuôi trồng lan Hoàng Thảo 1.4.1 Các ñiều kiện ñể trồng lan Dendrobium 1.4.2 Nghiên cứu nuôi trồng lan Dendrobium sau nuôi cấy mô 51 53 53 57 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 60 2.1 Vật liệu nghiên cứu 60 2.2 Nội dung nghiên cứu 61 2.3 Phương pháp nghiên cứu 62 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 62 2.3.2 Các tiêu theo dõi phương pháp ñánh giá 72 2.3.3 ðiều kiện thí nghiệm 73 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 73 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 74 3.1 Xác ñịnh lựa chọn phương pháp khử trùng, quan nuôi cấy ñể tạo nguồn vật liệu in vitro với hai loài lan D.nobile D.chrysanthum 3.1.1 74 Xác ñịnh hiệu khử trùng ñối với chồi mầm H2O2 2% HgCl2 0,1% 74 v 3.1.2 3.2 Xác ñịnh phương pháp khử trùng ñối với lan 76 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố ñến khả nhân nhanh, tạo hoàn chỉnh in vitro ñối với hai loài lan D.nobile D.chrysanthum theo phương pháp nuôi cấy mô truyền thống 3.2.1 Ảnh hưởng môi trường ñến khả nhân nhanh loài lan D.nobile D.chrysanthum 3.2.2 89 Ảnh hưởng hàm lượng khoai tây ñến khả nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) loài lan rừng D.nobile 3.2.5 84 Ảnh hưởng hợp chất hữu tự nhiên ñến khả nhân nhanh loài lan D.nobile D.chrysanthum 3.2.4 78 Ảnh hưởng hàm lượng saccaroza ñến khả nhân nhanh loài lan D.nobile D.chrysanthum 3.2.3 78 92 Ảnh hưởng hàm lượng chuối chín ñến khả nhân nhanh cụm chồi loài lan D.nobile D.chrysanthum 3.2.6 Ảnh hưởng môi trường ñến sinh trưởng chồi lan với loài lan D.nobile D.chrysanthum 3.2.7 100 Nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính (THT) ñến khả sinh rễ chồi loài lan D.nobile D.chrysanthum 3.3 99 Nghiên cứu ảnh hưởng cường ñộ ánh sáng tới khả sinh trưởng chồi lan D.nobile D.chrysanthum 3.2.8 96 102 Nghiên cứu khả nhân nhanh in vitro ñối với hai loài lan D.nobile D.chrysanthum theo phương pháp nuôi cấy cải tiến 3.3.1 105 Nghiên cứu ảnh hưởng phương thức nuôi cấy sử dụng nút ñến khả nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài lan D.nobile 105 vi 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng phương thức nuôi cấy sử dụng nút màng thoáng khí ñến khả nhân nhanh protocorm ñối với loài lan D.nobile 3.3.3 106 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng saccaroza ñến trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) nuôi cấy ñặc thoáng khí ñối với loài lan D.nobile 3.3.4 107 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng saccaroza ñến trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) nuôi cấy lỏng lắc thoáng khí ñối với loài lan D.nobile 3.3.5 108 Nghiên cứu ảnh hưởng phương thức nuôi cấy ñến khả nhân nhanh cụm chồi ñối với loài lan D.chrysanthum 3.4 110 ðặc ñiểm sinh trưởng in vitro hai loài lan D.nobile D.chrysanthum vườn ươm, vườn sản xuất 3.4.1 111 Nghiên cứu ảnh hưởng thời vụ ñến tỷ lệ sống chất lượng vườn ươm 02 loài lan D.nobile D.chrysanthum 111 Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể ñến tỷ lệ sống chất lượng vườn ươm 02 loài lan D.nobile D.chrysanthum 3.4.3 112 Nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng ñến chiều cao, số in vitro 02 loài lan (D.nobile D.chrysanthum) vườn ươm 3.5 114 Nghiên cứu ảnh hưởng số tác nhân giai ñoạn nuôi trồng thu thập hai loài lan D.nobile D.chrysanthum 121 vii 3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể trồng ñến sinh trưởng loài lan rừng thu thập D.nobile D.chrysanthum vườn sản xuất 3.5.2 121 Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng qua ñến sinh trưởng 02 loài lan D.nobile D.chrysanthum KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 126 137 Kết luận 137 ðề nghị 139 Các công trình ñã công bố có liên quan ñến luận án 140 Tài liệu tham khảo 141 Phụ lục 154 16 MỞ ðẦU Tính cấp thiết ñề tài Trong giới loài hoa nói hoa lan loài hoa ñẹp quyến rũ mê hồn mầu sắc hương thơm, ñặc biệt ñường nét hoa thật cầu kỳ, sắc sảo, thêm vào ñó hoa lan có ñặc tính bền tươi lâu (Trần Hợp, 1989) [9] (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006) [46] Ngoài giá trị làm cảnh trang trí, hoa lan ñược sử dụng với nhiều mục ñích khác như: Dùng làm thực phẩm (giống Orchis), rau xanh (giống Anoetochilus), trà uống (loài Jumellea fragrans), hương liệu (Vannila plannifolia) ñặc biệt lan ñược dùng làm dược liệu, có tác dụng chữa bệnh số loài thuộc chi Orchis, Platanthera, Gymnadenda, Dactylorhiza ñặc biệt chi Hoàng thảo (Dendrobium nobile, Caulis Dendrobium, Dendrobium loddgesii, Dendrobium chrysanthum, Dendrobium fimbriatum, Dendrobium nobile Lindi), (Lê Trần ðức, 1977) [7], (ðỗ Huy Bích, 2004) [3] (Dương ðức Huyến, 2007) [17] Hoàng Thảo chi lớn của họ Lan (Orchidaceae) Theo A Takhajan (1966) chi Hoàng Thảo giới có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố lục ñịa ðông Nam Á ñảo thuộc Philippin, Malaixia, Inñonêxia, Niu Ghinê, ðông Bắc Ôxtrâylia Ở Việt Nam biết 107 loài thứ thuộc chi Hoàng Thảo phân bố chủ yếu vùng núi suốt từ Bắc vào Nam số ñảo ven biển (ðào Thị Thanh Vân, ðặng Thị Tố Nga, 2008) [55] Tuy nhiên, trình phát triển kinh tế xã hội, nguyên nhân khác nhau, nhiều loài Hoàng Thảo nước ta ñã bị tuyệt chủng bị ñe dọa tuyệt chủng (Nguyễn Xuân Linh, 2002) [23] Năm 2004, số loài lan thuộc chi lan Hoàng Thảo ñã có danh lục ðỏ “Sách ñỏ Việt Nam” như: Kim ðiệp (Dendrobium fimbriatum Hook 1823), Ngọc Vạn Vàng (Dendrobium chrysanthum Lindl 1830), Thuỷ Tiên Hường (Dendrobium amabile (Lour.) 17 O’Brien, 1909), Hạc Vĩ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) C Fisch 1928), Hoàng Thảo hoa trắng - vàng (Dendrobium nobile var albolu-teum) (Huyen & Aver 1989)[67], (Phan Thúc Huân, 1989) [14] Dương ðức Huyến, 2007) [17] Do vừa có giá trị làm hoa cảnh vừa làm dược liệu nên hai loài lan ñịa vùng núi trung du phía Bắc Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.) Ngọc vạn vàng (Dendrobium chrysanthum Lindl.) thuộc chi Hoàng thảo ñã bị khai thác kiệt quệ với số lượng hàng trăm nghìn giò khai thác/năm ðặc biệt, hai loài lan rừng ñược xuất tiểu ngạch sang Trung Quốc với giá cao nên tốc ñộ khai thác ngày tăng dẫn ñến nguy tuyệt chủng tự nhiên Như vậy, ñể bảo tồn phát triển hai loài lan quý nhằm phục vụ ñược nhu cầu tiêu dùng không ñường khác phải tiến hành nhân giống nuôi trồng chúng quy mô lớn (Trần Hợp, 1989) [11], (Nguyễn Tiến Bân, 1990a) [2] Dương ðức Huyến, 2007) [17] Hiện nay, giới Việt nam, phương pháp nuôi cấy mô phương pháp nhân giống lan cho hệ số nhân cao, số lượng giống lớn giá thành giống hợp lý (Lê Văn Hòa, 2008) [9] (Trần Hợp, 1990) [12] Tuy nhiên, cho ñến nước ta, nghiên cứu nhân giống nuôi trồng lan Hoàng thảo chủ yếu giống lan lai nhập nội nhằm sản xuất hoa cắt cành hay trồng chậu làm cảnh Việc nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô ñặc biệt sử dụng nuôi cấy mô cải tiến hai loài lan ñịa: Dendrobium nobile Lindl (D.nobile) Dendrobium chrysanthum Lindl (D.chrysanthum) chưa có ñề tài nghiên cứu ñề cập ñến (Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm, 2007) [16] Xuất phát từ vấn ñề nêu trên, ñã tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng hai loài lan ñịa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) Hà Nội” với mong muốn góp 129 14 12 SốláTB/cây 10 Antonik Yogen Grow more ðầu Trâu 0 30 Ngày quan sát 60 90 Hình 3.37 Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng qua ñến ñộng thái tăng số loài lan rừng thu thập D.nobile Sốchồi TB/cây Antonik Yogen Grow more ðầu Trâu 0 30 Ngày quan sát 60 90 Hình 3.38 Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng qua ñến ñộng thái tăng số chồi loài lan rừng thu thập D.nobile Hiệu chế phẩm dinh dưỡng qua tác ñộng ñến tiêu số TB/cây ñược xếp theo thứ tự sau: công thức phun Antonik > nhóm công thức phun Yogen, phun Gromore phun ðầu trâu 130 Như vậy, chế phẩm dinh dưỡng có ảnh hưởng ñến khả sinh trưởng thân loài lan rừng D.nobile, có chế phẩm dinh dưỡng Antonik thích hợp Theo Lê Thanh Nhuận, Phạm Thị Liên, Nguyễn Trung Hưng cộng sự, 2009 ñối với lan nên sử dụng dinh dưỡng Growmore, phân chậm tan 30:10:10, 20:20:20 ñều cho hiệu Công bố gần tương tự kết thực nghiệm sai khác yếu tố giống Theo tác giả Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm, 2007 [17] loại phân bón thường sử dụng cho phong lan Growmore, Yogen, Miracrle, HVP, Phân bón ñầu trâu, Dynamic, phân cá (Fish emulsion), sử dụng nguồn phân hữu sẵn có ñã qua ngâm ủ Kết gần tương tự thực nghiệm chúng tôi, có sai khác giống không trùng hợp Hoàng thảo Thạch hộc thuộc nhóm lan ña thân (Minh Trí Xuân Giao, 2010) Thân Hoàng thảo Thạch hộc phận ñược sử dụng làm thuốc (ðỗ Tất Lợi, 1977, 1995; ðỗ Huy Bích, 2004) [3] Chính số chồi/ tiêu quan trọng cần ñược quan tâm theo dõi Một tiêu quan trọng số chồi/ cây: Sau 90 ngày sinh trưởng phun Yogen giúp lan tăng số thân nhanh, nhiều ñộ sai khác tin cậy 95% so với công thức khác, cụ thể phun Yogen trung bình lan ñã có 6,26 chồi sau 90 ngày nuôi trồng, Antonik Growmore ñạt 4,25 3,78 chồi, thấp lan ñược phun ðầu trâu 2,05 chồi / 90 ngày Như sử dụng phun Yogen phun cho lan ñã làm tăng số chồi nhiều Ngoài theo dõi diễn biến ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng qua ñến trình hoa chất lượng hoa loài lan rừng 131 D.nobile loài lan ñã hoa, cho thu 03 vụ liên tục vườn thực nghiệm - Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Hoa yếu tố ñịnh giá trị thẩm mỹ lan loại dinh dưỡng có ñịnh nhiều ñến số tiêu số lượng, chất lượng hoa Bảng 3.26 Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng qua ñến tỷ lệ hoa kích thước hoa loài lan rừng thu thập D.nobile Chỉ tiêu Tỷ lệ hoa (%) CT Dài Số hoa cuống TB/cành hoa (cm) ðường kính hoa (cm) Dài cánh môi (cm) Rộng cánh môi (cm) Antonic 89,9 11,4 4,82 7,4 2,77 1,96 Yogen 95,7 12,7 5,22 9,1 3,27 2,29 Growmore 86,2 10,2 4,44 7,15 2,68 1,98 ðầu trâu 90,1 12,1 5,05 7,55 2,4 1,92 LSD0,05 CV% CT1: phun Antonik 0,48 0,42 2,2 2,8 CT2: phun Yogen CT3: phun Growmore CT4:phun ðầu trâu Hình 3.39: Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng qua ñến ñường kính, màu sắc hoa loài D.nobile Các công thức sử dụng loại chế phẩm dinh dưỡng khác ñều có sai khác ñáng kể tiêu hoa/ Trong chế phẩm dinh dưỡng ñược sử dụng thí nghiệm 132 Yogen (CT2) có hiệu cao tỷ lệ hoa, số hoa trung bình/cành, ñường kính hoa so với công thức sử dụng loại chế phẩm dinh dưỡng khác, ñộ sai khác tin cậy 95% Sử dụng Yogen (CT2) làm tăng tiêu ñể ñánh giá chất lượng hoa/ (bảng 3.26, hình 3.39) Theo Bùi Thị Thu Huyền, 2009 sử dụng phân Pomior P399 không cần bổ sung Mg++ Ca++,nồng ñộ 0,4% tốt cho trình phân hóa mầm hoa chất lượng hoa giống lan Hoàng Thảo lai Trắng tím nhập nội từ Thái Lan Kết không trùng lặp với kết luận công bố loài lan lai nhập nội ðối với lan rừng, yếu tố quan trọng ñiều kiện sống ñộ ẩm, ánh sáng thông thoáng Tuy nhiên, ñiều kiện trồng nhà không kể ñến yếu tố dinh dưỡng, dinh dưỡng ñóng vai trò quan trọng việc sinh trưởng phát triển thân Cũng giống D.nobile ñã tiến hành thí nghiệm với loại dinh dưỡng khác cho D.chrysanthum Bảng 3.27 Ảnh hưởng loại chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng chiều cao, ñường kính thân, số số chồi TB/cây loài lan rừng thu thập D.chrysanthum (Sau tháng nuôi trồng) Chỉ tiêu Chiều dài cành ðường kính Số TB/cây Số chồi TB/cây Công thức (cm) thân (mm) Antonik 45,59 6,92 17,36 3,6 Yogen 47,34 6,69 15,26 2,4 Growmore 45,77 6,63 14,82 2,4 ðầu Trâu 45,89 6,67 16,57 2,6 LSD0,05 2,44 0,38 0,39 0,42 CV% 2,8 3,3 1,3 8,1 133 50 45 40 Chiều dài cành (cm) 35 30 Antonik 25 Yogen 20 Grow more 15 ðầu Trâu 10 0 30 Ngày quan sát 60 90 Hình 3.40 Ảnh hưởng loại chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng chiều dài cành loài D.chrysanthum thu thập ðườngkínhthân(mm) Antonik Yogen Grow more ðầu Trâu 0 30 Ngày quan sát 60 90 Hình 3.41 Ảnh hưởng loại chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng ñường kính thân loài D.chrysanthum thu thập 134 20 18 16 SốláTB/cây 14 12 10 Antonik Yogen Grow more ðầu Trâu 0 30 Ngày quan sát 60 90 Hình 3.42 Ảnh hưởng loại chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng số loài D.chrysanthum thu thập 3.5 Sốchồi TB/cây 2.5 Antonik Yogen 1.5 Grow more ðầu Trâu 0.5 0 30 Ngày quan sát 60 90 Hình 3.43 Ảnh hưởng loại chế phẩm dinh dưỡng ñến ñộng thái tăng số chồi loài D.chrysanthum thu thập 135 Sau 90 ngày sinh trưởng, công thức phun Yogen (CT2) có chiều dài cành lớn mặt số liệu ñạt 47,34cm so với công thức lại, sai khác không ñáng kể ðối với tiêu ñường kính thân sai khác công thức thí nghiệm không mức có ý nghĩa Chỉ tiêu số TB/cây tiêu quan trọng ñịnh khả quang hợp cây: Các công thức có sai khác với nhau, phun Antonik (CT1) hẳn công thức khác ñạt 17,36 lá/ cây/ sau 90 ngày, ñộ sai khác tin cậy 95% Hiệu chế phẩm dinh dưỡng qua ñược xếp theo thứ tự sau: công thức phun Antonik > nhóm công thức phun ðầu trâu, Yogen, Gromore Chỉ tiêu số chồi trung bình/ cây, ñánh giá khả phát triển cây: mức ñộ sai khác có ý nghĩa 95% cho công thức phun Antonik cho ñạt 3,6 chồi/ cây/ 90 ngày sinh trưởng tốt (bảng 3.27, hình 3.40, hình 3.41, hình 3.42, hình 3.43) Như vậy, chế phẩm dinh dưỡng có ảnh hưởng ñến khả sinh trưởng thân loài lan rừng D.chrysanthum chế phẩm dinh dưỡng Antonik thích hợp với loài lan Loài D.chrysanthum ñược thu thập nuôi trồng vườn thực nghiệm - Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, tính ñến ñã ñược năm không hình thành hoa, loài lan hoàn toàn không hoa khu vực Gia Lâm, Hà Nội Về chế phẩm dinh dưỡng chăm sóc cho 02 loài lan thu thập, vườn sản xuất, rút kết luận: - Phun Antonik ðược xác ñịnh chế phẩm dinh dưỡng thích hợp ñối với lan D.nobile, góp phần làm tăng nhanh tiêu: chiều dài cành, số TB/cây Là chế phẩm dinh dưỡng thích hợp ñối với lan D.chrysanthum, 136 thúc ñẩy tăng tiêu: số TB/cây, số chồi TB/cây - Phân bón Yogen chế phẩm dinh dưỡng thích hợp với lan D.nobile tiêu số chồi TB/cây, nâng cao số lượng chất lượng hoa 137 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Nguồn vật liệu ban ñầu cho nhân giống in vitro với 02 loài lan nghiên cứu D.nobile, D.chrysanthum thích hợp lan, cách khử trùng tốt cho lan là: nhúng cồn 960 ñốt lửa ñèn cồn Môi trường gieo hạt thích hợp cho hai loài lan nghiên cứu là: môi trường (MS + 100ml nước dừa + 10g saccaroza + 6g agar)/lít môi trường, loài lan D.nobile có 97% hạt phát sinh thể sinh chồi (protocorm), 3% nẩy cụm chồi với loài lan D.chrysanthum 100% hạt nẩy mầm tạo chồi, cụm chồi hoàn toàn không hình thành thể sinh chồi (protocorm) 1.2 Phương pháp nhân nhanh nuôi cấy mô kinh ñiển: Môi trường nhân nhanh protocorm tốt cho loài D.nobile là: môi trường (KC + 100ml nước dừa + 10g saccaroza + 60g khoai tây)/lít môi trường, ñạt hệ số nhân 4,47 lần/sau tuần nuôi cấy Môi trường nhân nhanh cụm chồi tốt cho loài D.nobile là: môi trường (MS + 100ml nước dừa + 30g sacchoroza + 60g chuối chín)/lít môi trường, ñạt hệ số nhân chồi 3,30 lần/sau tuần nuôi cấy Với loài D.chrysanthum môi trường nhân nhanh cụm chồi tốt là: môi trường (MS + 100ml nước dừa + 20g saccaroza + 60g chuối chín)/lít môi trường, ñạt hệ số nhân 3,19 lần/ sau tuần nuôi cấy 1.3 Phương pháp nhân nhanh nhờ nuôi cấy mô cải tiến: Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lỏng lắc nút nuôi cấy lỏng lắc thoáng khí ñã tăng hệ số nhân thể sinh chồi lan D.nobile ñạt 1,9 2,3 lần so với ñối chứng Nuôi cấy ñặc, màng lọc thoáng khí ñã làm giảm 25% lượng saccaroza cần phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm tăng hệ số nhân thể sinh chồi D.nobile lên gấp 1,4 lần so với môi trường nuôi cấy mô kinh ñiển 138 Nhân nhanh cụm chồi D.chrysanthum kỹ thuật bioreactor ñã giảm ñược ½ thời gian nhân giống cải thiện ñược chất lượng chồi 1.4 Môi trường tạo hoàn chỉnh cho loài D.nobile là: môi trường (RE + 10g saccaroza + 0,5g than hoạt tính)/lít môi trường, sau tháng nuôi cấy ñiều kiện cường ñộ ánh sáng 2.300lux, in vitro có chiều cao trung bình 4,5cm; số 4,0; số rễ 3,0 ðối với loài D.chrysanthum môi trường (RE + 10g saccaroza + 1g than hoạt tính)/lít môi trường, sau tháng nuôi cấy ñiều kiện cường ñộ ánh sáng 1.300 lux, in vitro có chiều cao trung bình 5,0cm; số 4,0; số rễ 5,0 1.5 Giai ñoạn vườn ươm: Mùa vụ ñưa vườn ươm thích hợp vụ xuân cho 02 loài lan nghiên cứu ñạt tỷ lệ sống 89,6% ñối với loài D.nobile 92,25% ñối với loài D.chrysanthum Giá thể phù hợp 02 loài D.nobile D.chrysanthum bột xơ dừa Sử dụng chế phẩm dinh dưỡng Komix với nồng ñộ 2ml/lít, tưới phun - 10 ngày/lần sau in vitro ñưa vườn ươm tháng ñã giúp sinh trưởng tốt, sau tháng ñối với loài D.nobile ñạt chiều cao TB 7,96cm, số TB 7,2 ñối với loài D.chrysanthum có chiều cao TB 8,64cm, số TB 7,6 1.6 Giai ñoạn vườn sản xuất ñối với thu thập từ tự nhiên hai loài lan rừng nghiên cứu ñược trồng vùng Gia Lâm - Hà nội: - Giá thể thích hợp ñể trồng chậu ñất nung (KT: 25cm x 18cm x 22cm) cho loài lan D.nobile than củi, loài lan D.chrysanthum xơ dừa - Chế phẩm dinh dưỡng thích hợp cho lan D.nobile D.chrysanthum Antonik Yogen Chế phẩm Antonik kích thích sinh trưởng thân, hai loài nêu trên, chế phẩm Yogen làm tăng tỷ lệ hoa chất lượng hoa loài lan D.nobile 139 ðề nghị Trên sở kết nghiên cứu thu ñược, bước ñầu ñề xuất ứng dụng kết thu ñược nhân giống in vitro cho hai loài lan rừng D.nobile, D.chrysanthum, ñồng thời làm tiền ñề cho nghiên cứu nhân giống loài lan Dendrobium dược liệu khác Tiếp tục nghiên cứu tiếp từ khâu vườn ươm, giai ñoạn vườn sản xuất cho ñến giai ñoạn tạo sản phẩm cuối từ nuôi cấy mô 140 CÁC CÔNG TRÌNH ðà CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ðẾN LUẬN ÁN Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Văn Giang (2010), “Ảnh hưởng giá thể trồng ñến trình sinh trưởng lan Hoàng thảo trúc ñen (Dendrobium hancockii Rolfe)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 8, số 5, trang 757-764 Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai, Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Thị Lý Anh (2011), “Ảnh hưởng dinh dưỡng qua ñến trình sinh trưởng phát phát triển lan Hoàng thảo Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 9, số 6, trang 903-911 Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai, Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Thị Lý Anh (2012), “Ảnh hưởng số chế phẩm dinh dưỡng qua ñến sinh trưởng lan Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng Ánh (Dendrobium chrysanthum Lindl.) Gia Lâm - Hà Nội”, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 10, số 2, trang 229-237 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (1990a), “Các hạt kín Việt Nam” Tuyển tập công trình nghiên cứu sinh thái tài nguyên sinh vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Tiến Bân (1990b), “Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín (Magno liophyta angios permae)”, Tuyển tập công trình nghiên cứu sinh thái tài nguyên sinh vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội ðỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc ñộng vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 803-806 Võ Văn Chi (1978a), Phân loại thực vật, NXB Giáo dục ðào tạo, Hà Nội Võ Văn Chi, Dương ðức Tiến (1978b), Phân loại thực vật – thực vật bậc cao, NXB ðại học Trung học chuyên nghiệp Nguyễn Văn Chương, Trịnh Văn Thịnh (1991), Từ ñiển bách khoa nông nghiệp, Trung tâm Quốc gia biên soạn, Hà Nội Lê Trần ðức (1997), Cây thuốc Việt Nam, NXB Nông nghiệp Võ Hà Giang, Ngô Xuân Bình (2010), “Nghiên cứu nhân giống phong lan ðuôi Chồn (Rhynchotylis rotunda (L.) Blume) phương pháp nuôi cấy mô tế bào”, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn số 5/ 2010, tr 25-30 Lê Văn Hoàng (2008), Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật, ðại học ðà Nẵng 10 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB thành phố Hồ Chí Minh 142 11 Trần Hợp (1989), Hoa lan, cảnh vấn ñề phát triển sản xuất, kinh doanh, xuất khẩu, NXB thành phố Hồ Chí Minh 12 Trần Hợp (1990), Phong lan Việt Nam, NXB khoa học kỹ thuật 13 Trần Hợp (2001), Phong lan Việt Nam, NXB khoa học kỹ thuật 14 Phan Thúc Huân (1989), Hoa lan cảnh vấn ñề phát triển sản xuất kinh doanh xuất khẩu, NXB Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, tr.12-14-34 15 Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm (2002), Kỹ thuật nuôi trồng lan, NXB thành phố Hồ Chí Minh 16 Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm (2007), Kỹ thuật nuôi trồng lan, NXB thành phố Hồ Chí Minh 17 Dương ðức Huyến (2007), Thực vật chí Việt Nam, – Họ lan (Orchidceae), NXB khoa học kỹ thuật 18 Hoàng Thị Lan Hương, Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Liên (2004), “Nghiên cứu quy trình nhân giống Lan Hồ ðiệp Moscow phương pháp nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, số tháng 3, tr 355-356 19 Hoàng Thị Lan Hương (2010), Nghiên cứu chọn tạo biện pháp kỹ thuật nhân giống số giống lan Hồ ðiệp miền Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ Nông nghiệp 20 Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, NXB ðại học quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh 21 Nguyễn Thị Lang (2002), Phương pháp czơ nghiên cứu công nghệ sinh học, NXB Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh 22 Nguyễn Xuân Linh (1998), Hoa kỹ thuật trồng hoa cảnh, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr.92-108 143 23 Nguyễn Xuân Linh (2002), ðiều tra thu thập ñánh giá bảo tồn nguồn gen hoa cảnh khu vực miền Bắc Việt Nam, NXB Nông nghiệp, tr.9-15 24 ðỗ Tất Lợi (1968), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật 25 Vũ Quốc Luận, Dương Tấn Nhật (2007), "Bước ñầu nghiên cứu khả tạo chồi hoa Dendrobium Mild Yumi Trong nuôi cấy in vitro", Hội nghị khoa học công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa, NXB Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh, tr.63-70 26 Nguyễn ðức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB ðại học quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh 27 Trần Văn Minh (1999), Giáo trình công nghệ sinh học Thực vật, NXB Viện Sinh học Nhiệt ñới 28 Chu Thị Ngọc Mỹ, ðặng Văn ðông, Trần Duy Quý (2009), “ðiều tra phân bố hoa lan Việt nam kết lưu giữ, ñánh giá số giống lan quý Gia Lâm – Hà Nội”, Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, số (12)/2009, tr.96-101 29 Nguyễn Công Nghiệp (2000), Trồng hoa lan, NXB Trẻ, thành phố Hồ Chí Minh 30 Nguyễn Cửu Thành Nhân, Nguyễn Thành Hải, Dương Tấn Nhựt (2007), “Nhân nhanh phôi protocorm-like body lan Hồ ðiệp Phalaenopsis amabilis hệ thống Bioreator, Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa, NXB Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, tr.16-27 31 Lê Thanh Nhuận, Phạm Thị Liên, Nguyễn Trung Hưng cộng (2009), Chuyên ñề nghiên cứu ảnh hưởng chế ñộ dinh dưỡng [...]... lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl + Xác ñịnh ñược một số khâu kỹ thuật cải tiến trong nhân giống loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl ñể có hệ số nhân giống cao và chất lượng cây in vitro tốt + Xác ñịnh ñược một số khâu kỹ thuật nuôi trồng loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl trong giai ñoạn vườn... nghiệp Hà Nội; Học viện Hậu Cần - Ngọc Thụy - Long Biên - Hà Nội 5 ðóng góp mới luận án về học thuật và lý luận - ðã xây dựng ñược quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan bản 20 ñịa D .nobile Lindl và D .chrysanthum Lindl có nguy cơ tuyệt chủng không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng - ðã sử dụng thành công kỹ thuật cải tiến trong nhân nhanh hai loài lan bản ñịa bằng kỹ thuật thoáng khí và biorector... sinh trưởng của hai loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl thuộc chi Hoàng Thảo ñang có nguy cơ tuyệt chủng ở Việt Nam 3 .2 Ý nghĩa thực tiễn - Góp phần bảo tồn và phát triển loài lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl - ðề tài ñã ñề xuất ñược quy trình nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng và bước ñầu ñưa ra kỹ thuật. .. Dendrobium chrysanthum Lindl như một nghề sản xuất nguyên liệu dược mang lại hiệu quả kinh tế 2. 2 Yêu cầu của ñề tài + Xác ñịnh ñược phương pháp thích hợp ñể tạo nguồn vật liệu in vitro ñối với loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl + Xác ñịnh ñược các bước kỹ thuật nhân nhanh in vitro theo hướng không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng tổng hợp ñối với loài lan bản ñịa Dendrobium. .. của loài lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl tại Gia Lâm - Hà Nội 4 ðối tượng và phạm vị nghiên cứu của ñề tài 4.1 ðối tượng nghiên cứu của ñề tài - Hai loài lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl thuộc chi Hoàng thảo - Các nền môi trường nuôi cấy cơ bản của Vacin and Went, 1949 (VW); KnudsonC, 1965 (KC), Murashige-Skoog, 19 62 (MS),... số nhân cao 21 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) và hai loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl (D .nobile) và Dendrobium chrysanthum Lindl (D .chrysanthum) 1.1.1 Nguồn gốc và phân bố của chi Hoàng Thảo (Dendrobium) Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) ñược ñặt tên vào năm 1799, Dendrobium ñược hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là chi lan Hoàng Thảo Lan. .. lượng lớn và giá thành cây giống hạ 1.3.1 Nghiên cứu lựa chọn mẫu nuôi cấy Kết quả mô phân sinh ngọn và mô phân sinh bên ở phần cuối thân hình thành protocorm tốt, còn mô nuôi cấy từ cuống non không tạo protocorm (Trịnh Cẩm Tú và cs, 20 06) [53], và (Bùi Thị Tường Thu và cs, 20 07) [47] Bảng 1.4 Một số loại mô cấy và kết quả ñạt ñược trong nhân giống vô tính in vitro một số loài Dendrobium Tên loài D.bigibbum... cây giống không chứa các chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật tổng hợp phục vụ cho sản xuất nguyên liệu dược 2 Mục tiêu và yêu cầu của ñề tài 2. 1 Mục tiêu của ñề tài Xây dựng quy trình nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật tổng hợp ñể góp phần làm cơ sở duy trì, phát triển nguồn gen ñồng thời thúc ñẩy việc nuôi trồng cây lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium. .. myo-inositol, scyllo-inositol…; các vitamins như: C, B1, B2, B3, B5, B6, Folate, Folic axít, Biotin, Niacin…; khoáng chất như: Ca, Fe, Mg, P, K, Na, Zn, Cu, Mn, Se, Cl, S, Al,…; axít amin như: alanin, ß-alanin, arginine, asparagine, glutamine, aspartic acid, cystine, glutamine acid, glycine, homoserine, histidine, isoleucine, lysine, methionine, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, praline, serine,... phấn là 4, không phải là 2 như ở chi Epigeneium hoặc là 8 ở chi Eria - Chi Dendrobium không có lông mềm mịn trên lá và các bộ phận của hoa như ở chi Eria (Dương ðức Huyến, 20 07) [17] 1.1.4 Một số ñặc ñiểm chính về 2 loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl Một số ñặc ñiểm chính về 02 loài lan rừng D .nobile và D .chrysanthum (bảng 1.1) Hình 1.1.Cấu tạo hoa Hình 1 .2. Cấu tạo ... Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng hai loài lan ñịa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) Hà Nội với... 1 .2 Cơ sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy nhân giống ñề tài 1 .2. 1 27 Kỹ thuật nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật 29 32 32 iv 1 .2. 2 Nhân giống bioreactor 35 1 .2. 3 Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy in. .. ñể trồng lan Dendrobium 1.4 .2 Nghiên cứu nuôi trồng lan Dendrobium sau nuôi cấy mô 51 53 53 57 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 60 2. 1 Vật liệu nghiên cứu 60 2. 2 Nội dung nghiên