Khảo sát năng sinh enzymes ngoại bào của vi khuẩn bacillus velezensis cố định vào biochar

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO CỦA VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS CỐ ĐỊNH VÀO BIOCHAR Ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn Th S PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực hiện NGUYỄN ĐỖ MẪN KIỀU MSSV 1611100117 Lớp 16DSHA2 TP Hồ Chí Minh, 2020 Đồ án tốt nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của Trường, đ.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO CỦA VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS CỐ ĐỊNH VÀO BIOCHAR Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực MSSV: 1611100117 : NGUYỄN ĐỖ MẪN KIỀU Lớp: 16DSHA2 TP Hồ Chí Minh, 2020 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc thầy cô Trường, đặc biệt thầy cô Viện Khoa học Ứng dụng Hutech Trường Đại Học Công Nghệ TpHCM giúp đỡ em tài liệu tham khảo để em hồn thành tốt Báo cáo tốt nghiệp Và em xin chân thành cảm ơn Th.S Phạm Minh Nhựt nhiệt tình hướng dẫn em việc lựa chọn đề tài nghiên cứu, hướng tiếp cận giúp em chỉnh sửa thiếu sót trình nghiên cứu Trong trình nghiên cứu, khó tránh khỏi sai sót, mong q thầy bỏ qua giúp em hoàn thiện Báo cáo tốt nghiệp Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, người thân bạn bè em, quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn q trình học tập hồn thành báo cáo thật tốt Em xin chân thành cảm ơn! Tp Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2020 Sinh viên thực NGUYỄN ĐỖ MẪN KIỀU ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG ix LỜI MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu .2 Nhiệm vụ nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu ngành nuôi trồng thủy sản khó khăn ni trồng thủy sản 1.1.1 Ngành nuôi trồng thủy sản 1.1.2 Khó khăn ngành nuôi trồng thủy sản 1.2 Vai trò vi sinh vật ni trịng thủy sản .6 1.2.1 Các chủng vi sinh vật nuôi trồng thủy sản 1.2.2 Lợi ích vi sinh vật 1.3 Tổng quan biochar 1.3.1 Khái niệm .7 1.3.2 Lịch sử phát biochar 1.3.3 Nguyên liệu sản xuất biochar 1.3.4 Sản xuất biochar 11 1.3.5 Tiềm sản xuất biochar Việt Nam 13 iii Đồ án tốt nghiệp 1.3.6 Vai trò biochar 14 1.3.7 Ưu nhược điểm biochar 15 1.3.8 Đặc tính biochar bón vào đất 16 1.3.9 Tính chất hóa - lý biochar 17 1.3.10 Ứng dụng biochar 19 1.4 Tổng quan vi khuẩn B.velezensis 21 1.4.1 Đặc điểm phân bố 21 1.4.2 Bào tử vi khuẩn B.velezensis 21 1.4.3 Cấu tạo bào tử 22 1.4.4 Bộ gen B.velezensis .23 1.4.5 Tính chất đối kháng 23 1.4.6 Phân loại 24 1.4.7 Đặc điểm nuôi cấy 24 1.4.8 Cấu trúc kháng nguyên 24 1.4.9 Tính đối kháng B.velezensis với số vi sinh vật gây bệnh 25 1.4.10 Đặc điểm có lợi vi khuẩn B.velezensis 25 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 27 2.1.2 Địa điểm .27 2.2 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ thiết bị 27 2.2.1 Vật liệu 27 2.2.2 Hóa chất 27 iv Đồ án tốt nghiệp 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Phương pháp nhuộm gram 28 2.3.2 Phương pháp nhuộm bào tử 29 2.3.3 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 29 2.3.4 Phương pháp tăng sinh xác định mật độ vi khuẩn 30 2.3.5 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 30 2.3.6 Phương pháp đánh giá khả sinh enzyme amylase 31 2.3.7 Phương pháp đánh giá khả sinh enzyme cellulase .32 2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 33 2.4 Bố trí thí nghiệm .34 2.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 34 2.4.2.2 Chỉ tiêu hóa học 35 2.4.4 Xử lí biochar 35 2.4.5 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn B.velezensis .36 2.4.6 Khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến khả sinh enzyme vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar 36 2.4.7 Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar 37 2.4.8 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn đến khả sinh enzyme vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar 37 2.4.9 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lắcđến khả sinh enzyme vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar 38 3.1 Kết xác định đặc điểm, hình thái khuẩn lạc vi khuẩn B.velezensis 39 v Đồ án tốt nghiệp 3.2 Kết khảo sát yếu tố vật lý, hóa học biochar 40 3.2.1 Chỉ tiêu vật lí 41 3.2.2 Chỉ tiêu hóa học 41 3.3 Kết đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar 43 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến khả sinh enzyme vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar 44 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar 45 3.6 Kết khảo ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn đến khả sinh enzyme vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar 46 3.7 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian lắc đến khả sinh enzyme vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1.Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC .52 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BHIB Brain Heart Ìnusion Broth BHIA Brain Heart Ìnusion Agar CMC Carboxymethyl cellulose vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Biochar từ vỏ trấu Hình 1.2: Đất qua cải bạo biochar Hình 1.3: Cấu trúc lị làm thủ công sản phẩm biochar 12 Hình 1.4: Quá trình hình thành bào tử 23 Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35 Hình 2.2: Biochar xử lí 37 Hình 3.1: Hình thái vi khuẩn B.velezensis 40 Hình 3.2: Kết khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào 44 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số thành phần loại nguyên liệu 10 Bảng 1.2: Hàm lượng thành phần biochar 13 Bảng 1.3: Tỷ lệ tương đối bốn thành phần B.velezensis 18 Bảng 3.1: Thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn B.velezensis 41 Bảng 3.2: B.velezensis sinh enzyme ngoại bào 41 Bảng 3.3: Kết thử nghiệm B.velezensis 43 Bảng 3.4: Khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn B.velezensis 44 Bảng 3.5: Đường kính vịng phân giải tinh bột cellulose cố định vào biochar mật độ vi khuẩn khác 45 Bảng 3.6: Đường kính vịng phân giải tinh bột cellulose cố định vào biochar pH khác 46 Bảng 3.7: Đường kính vịng phân giải tinh bột cellulose cố định vào biochar tỷ lệ phối trộn khác 47 Bảng 3.8: Đường kính vịng phân giải tinh bột cellulose cố định vào biochar thời gian lắc khác 48 ix Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Enzyme sử dụng từ lâu Khoảng 5.000 năm trước công nguyên, Jerico người ta biết đến kĩ thuật làm bánh mì Trong thành phố Babylon, việc nấu rượu vang, sản xuất giấm, tương, chao,… thực Ở mức độ khác nhau, trình sinh học xưa lịch sử phát triển văn minh nhân loại Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế,…Hằng năm, khối lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 3.000 với giá trị 500 triệu USD , phân phối lĩnh vực khác Phần lớn enzyme sản xuất quy mô công nghiệp thuộc loại enzyme đơn cấu từ, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm enzyme thủy phân sử dụng cho việc thủy phân chất tự nhiên So với nguồn enzyme từ động vật thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp từ vi sinh vật ngắn, nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, sản xuất theo quy mô công nghiệp Qua nhiều năm,việc sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp enzyme cải thiện đáng kể hiệu sản xuất, sản phẩm tạo nhiều với giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng kể giảm tác động xấu đến môi trường Trong vi sinh vật phải kể đến loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus Các ứng dụng Bacillus có liên quan đến enzyme ngày tăng hiệu ngày cao Các ứng dụng chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công nghiệp truyền thống đến công nghệ lên men đại, đến sinh học phân tử, y-dược học chữa bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, xử lí mơi trường nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ phế liệu Hệ enzyme Bacillus phong phú đa dạng gồm protease, amylase, cellulase, glucoamylase, glucanase, pectinase Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1.96916667 0.65638889 Error 6.88000000 0.86000000 0.76 Corrected Total 11 8.84916667 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.222526 4.705430 0.927362 Source DF Anova SS T 19.70833 Mean Square F Value Pr > F 1.96916667 0.65638889 0.76 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.86 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 1.7461 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 20.1667 a 57 0.5457 0.5457 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T 20.0000 c 19.5333 b 19.1333 d A A A A A A Ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme amylase DATA; INPUT T $ N @@; CARDS; ph4 18 ph4 16.5 ph4 17 ph5 18 ph5 17.25 ph5 17.5 ph6 17 ph6 17 ph6 17 ph7 15.25 ph7 14.5 58 Đồ án tốt nghiệp ph7 14.25 ph8 18 ph8 15.25 ph8 17 ; PROC ANOVA; CLASS T; MODEL N = T; MEANS T / LSD ; TITLE ‘ph enzyme amylase’; RUN; ph enzyme amylase The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values T ph4 ph5 ph6 ph7 ph8 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 ph enzyme amylase The ANOVA Procedure Dependent Variable: N 59 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model Error 10 5.87500000 15.60833333 3.90208333 6.64 0.0071 0.58750000 Corrected Total 14 21.48333333 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.726532 4.608129 0.766485 Source DF Anova SS T 16.63333 Mean Square F Value Pr > F 15.60833333 3.90208333 6.64 ph enzyme amylase The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.5875 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.3944 Means with the same letter are not significantly different 60 0.0071 Đồ án tốt nghiệp t Grouping Mean A N T 17.5833 ph5 A A 17.1667 ph4 A A 17.0000 ph6 A A 16.7500 ph8 B 14.6667 ph7 Ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme cellulase DATA; INPUT T $ N @@; CARDS; ph4 20.25 ph5 20.5 ph6 21.5 ph7 18.5 ph8 18.5 ph4 20 ph5 19.25 ph6 21 ph7 17 61 Đồ án tốt nghiệp ph8 18.5 ph4 19.8 ph5 18 ph6 21 ph7 16.8 ph8 17.25 ; PROC ANOVA; CLASS T; MODEL N = T; MEANS T / LSD ; TITLE ‘ph enzyme cellulase’; RUN; ph enzyme cellulase The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values T ph4 ph5 ph6 ph7 ph8 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 ph enzyme cellulase 62 Đồ án tốt nghiệp The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model Error 10 6.16166667 26.71433333 6.67858333 10.84 0.0012 0.61616667 Corrected Total 14 32.87600000 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.812579 4.090479 0.784963 Source DF Anova SS T 19.19000 Mean Square F Value Pr > F 26.71433333 6.67858333 10.84 ph enzyme cellulase The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.616167 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.4281 63 0.0012 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean A N T 21.1667 ph6 A 20.0167 ph4 C 19.2500 ph5 18.0833 ph8 17.4333 ph7 A B B B C D C D D Ảnh hưởng thời gian lắc đến khả sinh enzyme amylase DATA; INPUT T $ N @@; CARDS; 24 20.4 48 21.4 72 17.2 96 19.4 120 20.8 24 19 48 22 64 Đồ án tốt nghiệp 72 15.2 96 16.4 120 19.8 24 18.25 48 19.5 72 17.4 96 19.25 120 19.2 ; PROC ANOVA; CLASS T; MODEL N = T; MEANS T / LSD ; TITLE ‘time lac enzyme emylase’; RUN; time lac enzyme emylase The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values T 120 24 48 72 96 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 time lac enzyme emylase 65 Đồ án tốt nghiệp The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 32.90233333 8.22558333 Error 10 15.77000000 1.57700000 5.22 0.0156 Corrected Total 14 48.67233333 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.675997 6.604768 1.255787 Source DF Anova SS T 19.01333 Mean Square F Value Pr > F 32.90233333 8.22558333 5.22 time lac enzyme emylase The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.577 Critical Value of t 2.22814 66 0.0156 Đồ án tốt nghiệp Least Significant Difference 2.2846 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean A N T 20.967 48 19.933 120 A B A B A B A 19.217 24 C 18.350 96 16.600 72 B B C C Ảnh hưởng thời gian lắc đến khả sinh enzyme cellulase DATA; INPUT T $ N @@; CARDS; 24 23 48 23.6 72 22.4 96 21.8 120 22.2 67 Đồ án tốt nghiệp 24 22.8 48 20.5 72 19.7 96 19.5 120 21.9 24 24 48 22 72 20.6 96 19.5 120 22 ; PROC ANOVA; CLASS T; MODEL N = T; MEANS T / LSD ; TITLE ‘time lac enzyme cellulase’; RUN; time lac enzyme cellulase The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values T 120 24 48 72 96 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 68 Đồ án tốt nghiệp 69 Đồ án tốt nghiệp time lac enzyme cellulase The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 16.11333333 4.02833333 Error 10 12.98666667 1.29866667 3.10 0.0667 Corrected Total 14 29.10000000 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.553723 5.251569 1.139591 Source DF Anova SS T 21.70000 Mean Square F Value Pr > F 16.11333333 4.02833333 3.10 time lac enzyme cellulase The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 70 0.0667 Đồ án tốt nghiệp Error Mean Square 1.298667 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 2.0732 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean A N T 23.2667 24 22.0333 120 22.0333 48 20.9000 72 20.2667 96 A B A B A B A B B B B 71 ... lí biochar 35 2.4.5 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn B .velezensis .36 2.4.6 Khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến khả sinh enzyme vi khuẩn B .velezensis cố định vào biochar. .. khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn B .velezensis cố định vào biochar 43 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến khả sinh enzyme vi khuẩn B .velezensis cố định vào biochar ... nghiệm Biochar Bacillus velezensisz Khảo sát đặc điểm, hình thái Khảo sát yếu tố vật lý, hóa học Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào Tăng sinh Xử lí Xác định mật độ Cố định vi khuẩn Dịch vi khuẩn Khảo