CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Bố trí thí nghiệm
2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Biochar Khảo sát các yếu tố vật lý, hóa học Tăng sinh Xác định mật độ Dịch vi khuẩn Xử lí Cố định vi khuẩn
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩnBacillus velezensisz
cố định vào Biochar
Mật độ vi khuẩn Ảnh hưởng của
pH Tỷ lệ phối trộn Thời gian lắc
Tổng hợp và đánh giá kết quả
Khảo sát đặc điểm, hình thái
Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
Bacillus velezensisz
2.4.2. Khảo sát các yếu tố vật lý, hóa học của biochar 2.4.2.1. Chỉ tiêu vật lý
Tiến hành chọn các hạt biochar ngẫu nhiên và tiến hành xác định các yếu tố: pH, khối lượng, kích thước, hình dạng.
2.4.2.2. Chỉ tiêu hóa học
Các chỉ tiêu hóa học được phân tích tại Cơng ty TNHH phân tích kiểm nghiệm Việt Tín.
2.4.3. Xác định các đặc điểm hình thái củaB.velezensis
Vi khuẩn B.velezensis được cấy trang trên mơi trường BHIA quan sát hình thái khuẩn lạc bao gồm các đặc điểm: hình dạng, hình chiếu, rìa, màu sắc, đường kính.
2.4.4. Xử lí biochar
Mẫu biochar được mang về Phịng thí nghiệm. Trước khi sử dụng, biochar được rửa qua nước máy và được sàn qua rây có kích thước 2 x 2 mm. Sau đó, rửa sạch biochar với nước khử khoáng bằng cách cho biochar vào bình tam giác 500 ml chứa 250 ml nước khử khống, lắc trên máy lắc trịn với tốc độ 150 vịng/phút. Lặp lại quy trình rửa đến khi biochar sạch hồn tồn (khơng làm đen màu nước khử khoáng khi lắc trên máy lắc). Mục đích của việc rửa biochar trước khi bố trí thí nghiệm là nhằm loại bỏ màu đen của biochar khi cho vào trong nước và giúp cho việc quan sát sự phát triển vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng ở nghiệm thức bổ sung Biochar dễ dàng hơn. Biochar sau khi rửa sạch với nước khử khoáng đem khử trùng trong nồi hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút được sấy khơ ở 105oC.Biochar sau khi xử lí, được xác định giápH bằng cách cân 1g biochar rồi bổ sung vào đó là 5ml nước cất, trộn đều và nghiền nhuyễn hỗn hợp trên. Để yên trong 15 phút sau đó lọc, dịch thu được sau khi lọc sẽ xác định giá trị pH. Điều chỉnh pH cần khảo sát bằng HCl 0,1N hoặc NaOH 0,1N.
Hình 2.2.Biochar đã xử lí
2.4.5. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩnB.velezensis
Chủng vi khuẩn B.velezensis sau khi được phân lập và định danh sơ bộ được tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào. Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá khả năng sinh các enzyme amylase trên môi trường Starch Agar, cellulase trên môi trường CMC bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch.
2.4.6. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng sinh enzyme của vikhuẩnB.velezensiscố định vào biochar khuẩnB.velezensiscố định vào biochar
a. Mục đích của thử nghiệm
Thử nghiệm nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar ở các mật độ khác nhau theo thời gian khảo sát trên môi trường BHIB.
b. Cách thực hiện thử nghiệm
Vi khuẩn B.velezensis được tăng sinh trong môi trường BHIB bằng cách hút 1ml vi khuẩn cho vào erlen 100ml chứa 20ml môi trường BHIB trong điều kiện vô trùng ở 370C trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng. Sau 24 giờ ni cấy, đo OD600nm để xác định mật độ vi khuẩn sau tăng sinh. Tiến hành điều chỉnh về các mật độ vi khuẩn được chọn để khảo sát là 106,107,108,109 (cfu/ml). Các erlen môi trường ở các mật độ khác nhau sẽ được ni cấy lắc 150 vịng/ phút ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ. Sau thời gian 24 giờ nuôi cấy, tiến hành thu mẫu và đánh giá khả năng sinh enzyme của vi khuẩn
B.velezensis cố định vào biochar ở mỗi nghiệm thức bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
2.4.7. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn
B.velezensiscố định vào biochar a. Mục đích của thử nghiệm
Thử nghiệm nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩnB.velezensiscố định vào biochar ở các giá trị pH khác nhau theo thời gian khảo sát trên môi trường BHIB.
b. Cách thực hiện thử nghiệm
Vi khuẩnB.velezensis được chuẩn bị như trên. Tiến hành đưa pH môi trường về các giá trị pH được chọn khảo sát lần lượt là pH 4,0, pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0 và pH 8,0 bằng dung dịch HCl 0,1N hay NaOH 0,1N. Mật độ vi khuẩn theo thí nghiệm 2.4.6.Các erlen ở mỗi pH khác nhau sẽ được ni cấy lắc 150 vịng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng. Sau thời gian ni cấy, tiến hành thu mẫu và đánh giá khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar ở mỗi nghiệm thức bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
2.4.8. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn đến khả năng sinh enzyme của vikhuẩnB.velezensiscố định vào biochar khuẩnB.velezensiscố định vào biochar
a. Mục đích của thử nghiệm
Thử nghiệm nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar ở các tỷ lệ phối trộn khác nhau theo thời gian khảo sát trên môi trường BHIB.
b. Cách thực hiện thử nghiệm
Vi khuẩnB.velezensisđược chuẩn bị như trên. Sau đó, hút dịch vi khuẩn đã tăng sinh vào biochar đã xử lí theo tỉ lệ phối trộn: 1:5,1:10, 1:15, 1:20 theo trọng lượng/ thể tích. Điều chỉnh pH thích hợp theo thí nghiệm 2.4.7 ở mỗi erlen. Mật độ vi khuẩn theo thí nghiệm 2.4.6. Các erlen ở các tỷ lệ phối trộn khác nhau sẽ được ni cấy lắc 150 vịng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng. Sau 24 giờ ni cấy, tiến hành
thu mẫu và đánh giá khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar ở mỗi nghiệm thức bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
2.4.9. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩnB.velezensiscố định vào biochar
a. Mục đích của thử nghiệm
Thử nghiệm nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar ở các mốc thời gian khác nhau theo thời gian khảo sát trên môi trường BHIB.
b. Cách thực hiện thử nghiệm
Vi khuẩnB.velezensis được chuẩn bị như trên. Mật độ vi khuẩn theo thí nghiệm 2.4.6. Điều chỉnh pH thích hợp theo thí nhiệm 2.4.7 ở mỗi erlen. Lựa chọn tỉ lệ phối trộn thích hợp theo trọng lượng/ thể tích ở thí nghiệm 2.4.8 ở mỗi erlen. Ở mỗi erlen sẽ được ni cấy lắc 150 vịng/ phút ở nhiệt độ phòng ở các mốc thời gian khảo sát lần lượt là 24giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. Tại mỗi thời điểm, tiến hành thu mẫu và tiến hành khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩnB.velezensiskhi cố định vào biochar ở mỗi nghiệm thức bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN