Khả năng sinh enzyme ngoại bào Đường kính (mm)
Enzyme amylase 20 Enzyme cellulase 22
Như vậy chủng B.velezensis này có đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh hóa và khả năng sinh enzyme ngoại bào phù hợp với kết quả: “Nghiên cứu, phân lập, sàng lọc các chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng sinh enzyme ngoại bào” được thực hiện bởi tác giả Trần Hữu Thành. Sau đó chủng này được giữ giống và bảo quản để tiến hành thử nghiệm tiếp theo.
3.2.1. Chỉ tiêu vật lí
Các chỉ tiêu vật lí khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩnB.velezensiscố định vào biochar bao gồm giá trị về pH, khối lượng, kích thước, hình dạng. Kết quả thu được như sau:
－Về giá trị pH: biochar có pH=9.89
－Khối lượng: 0.1÷0.25 gram
－Kích thước: chiều dài 8-9mm; chiều rộng 2.5-3mm
－Hình dạng: dạng hạt, có màu đen, hình bầu dục và 2 đầu nhọn
3.2.2. Chỉ tiêu hóa học
Sau khi mẫu được gửi đến trung tâm cơng nghệ sinh học Tp.Hồ Chí Minh thì dưới đây là kết quả thử nghiệm biochar về chỉ tiêu hóa học được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3.Kết quả phân tích biochar
STT/
No. Chỉ tiêu thử nghiệm/Parameters Phương pháp phân tích/Testing method Kết quả/Result
Đơn vị tính/ Unit
1 Chất hữu cơ(*) TCVN 9294 : 2012 12,3 %
2 Tổng N(*) TCVN 8557 : 2010 0,87 %
3 K2O hữu hiệu(*) TCVN 8560 : 2010 3 053 mg/kg
4 P2O5hữu hiệu(*) TCVN 8559 : 2010 0,054 %
5 Arsen (As)(*) TCVN 11403 : 2016 Không phát hiện(LOD=0,07) mg/kg
6 Cadimi (Cd)(*) TCVN 9291 : 2012 0,038 mg/kg
7 Chì (Pb)(*) TCVN 9290 : 2012 0,45 mg/kg
8 Thủy ngân(Hg)(*) TCVN 10676 : 2015 Không phát hiện(LOD=0,035) mg/kg
9 Crom (Cr) TCVN 10674 : 2015 Không phát hiện(LOD=4,8) mg/kg
10 Nikel (Ni) TCVN 10675 : 2015 Không phát hiện(LOD=2,2) mg/kg
11 Canxi (Ca)(*) TCVN 9284 : 2012 2 491 mg/kg 12 Magie (Mg)(*) TCVN 9285 : 2012 557 mg/kg 13 Đồng (Cu)(*) TCVN 9286 : 2012 10,7 mg/kg 14 Sắt (Fe)(*) TCVN 9283 : 2012 817 mg/kg 15 Kẽm (Zn)(*) TCVN 9289 : 2012 61,0 mg/kg 16 Mangan (Mn)(*) TCVN 9288 : 2012 173 mg/kg 17 Độ ẩm(*) TCVN 9297 : 2012 3,59 % 18 SiO2(s/c) TCVN 5815 : 2001 25,8 % (w/w)
3.3. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn B.velezensis
khi cố định vào biochar
Việc khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và cellulase của vi khuẩn
B.velezensis khi cố định vào biochar được xác định thơng qua đường kính vịng phân giải tinh bột và cellulose trên các đĩa mơi trường agar có bổ sung có chất thích hợp. Kết quả của thử nghiệm được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4:Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩnB.velezensis
Enzyme Amylase Cellulase
B.velezensis tự do 18mm 22mm
B.velezensis cố định vào biochar
20mm 22mm
Từ bảng 3.4, vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar và vi khuẩnB.velezensis
tự do có khả năng tiết enzyme amylase và cellulase để thủy phân tinh bột và cellulose. Khả năng sinh enzyme cellulase của vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar và vi khuẩnB.velezensis tự do trong thử nghiệm ở mức cao nhất với đường kính vịng phân giải là 22mm. Khả năng sinh enzyme amylase của vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar và vi khuẩnB.velezensis tự do cũng khá cao với đường kính vịng phân giải là 18mm và 20mm. Nhìn chung, vi khuẩnB.velezensiscó khả năng sinh enzyme rất mạnh dù ở dạng tự do hay dạng cố định vào biochar vì điều kiện mơi trường ni cấy thích hợp và khả năng tăng trưởng nhanh.
Hình 3.2.Kết quả khảo sát sinh enzyme ngoại bào
A: Đường kính vịng phân giải enzyme amylase B: Đường kính vịng phân giải enzyme cellulase
3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng sinh enzymecủa vi khuẩnB.velezensiscố định vào biochar của vi khuẩnB.velezensiscố định vào biochar
Nhằm mục đích khảo sát mức độ ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B.velezensis q trình ni cấy và sinh trưởng. Kết quả ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar được trình bày như bảng 3.5.
Bảng 3.5:Đường kính vịng phân giải tinh bột và cellulose cố định vào biochar ở các mật độ vi khuẩn khác nhau
Mật độ vi khuẩn ( cfu/ml )
B.velezensistự do B.velezensiscố định vào biochar
Amylase Cellulase Amylase Cellulase
106 18mm 22mm 17,8mm 20,2mm
107 21,8mm 20mm
108 20mm 20mm
109 16,6mm 18,4mm
Nhìn chung, mật độ vi khuẩn ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn
B.velezensiskhi cố định vào biochar tăng giảm không đều từ 106cfu/ml đến 109 cfu/ml ở các mật độ khảo sát khác nhau và ở tất cả các mật độ khảo sát vi khuẩn đều sinh enzyme tốt nhất. Vi khuẩn sinh enzyme mạnh nhất ở mật độ 107sau đó, giảm dần theo các mật độ khảo sát và thấp nhất ở 106 cfu/ml và 109 cfu/ml. Vì ở 106 cfu/ml mật độ tương đối ít đồng thời lượng mơi trường ni cấy nhiều nên tốc độ sinh enzyme không tốt bằng 107 cfu/ml và ở 109 cfu/ml mật độ tương đối cao đồng thời lượng mơi trường
ni cấy ít nên với mật độ 109 cfu/ml chúng ức chế nhau nên không sinh enzyme tốt nhất. Vì vậy, ở mật độ 107 cfu/ml thích hợp để vi khuẩn sinh enzyme mạnh nhất. Với kết quả thí nghiệm này tơi tiến hành chọn mật độ 107cfu/ml cho thí nghiệm tiếp theo.
3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn
B.velezensiscố định vào biochar
pH là yếu tố rất quan trọng nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn. Trong q trình ni cấy, các sản phẩm của q trình trao đổi chất có thể làm thay đổi pH của mơi trường, làm ảnh hưởng đến hoạt tính của vi khuẩn. Vì vậy ta phải khảo sát khả năng ảnh hưởng của pH đế khả năng sinh enzyme của vi khuẩn
B.velezensisở các nồng độ pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau.
Thử nghiệm được thực hiện với giá trị pH 4,0, pH 5,0, pH 6.0, pH 7,0, pH 8,0. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6: Đường kính vịng phân giải tinh bột và cellulose cố định vào biochar ở các pH khác nhau
pH B.velezensistự do B.velezensiscố định vào biochar
Amylase Cellulase Amylase Cellulase
pH 4,0 18mm 22mm 17,3mm 18,3mm
pH 5,0 18mm 20,6mm
pH 6,0 25mm 21,6mm
pH 7,0 23mm 21mm
pH 8,0 17,5mm 18,5mm
Dựa vào bảng 3.6 ta có thể thấy, vi khuẩnB.velezensisđều sinh enzyme tốt ở các nồng độ pH khác nhau, trong đó vi khuẩn B.velezensis sinh enzyme tốt nhất ở pH 6,0 và pH 7,0 và thấp nhất ở pH 4,0 và pH 8,0. Vì ở pH 4,0 và pH 5,0 mang tính acid nên khơng phải pH thích hợp để vi khuẩn sinh enzyme và pH 8,0 mang tính kiềm cũng khơng phải pH thích hợp để vi khuẩn sinh enzyme. Vì vậy, pH 6,0 và pH 7,0 là pH hơi
trung tính thích hợp để vi khuẩn sinh enzyme mạnh nhất. Vi khuẩnB.velezensistự do ở pH tối ưu là pH 7,0, So với vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar và vi khuẩn
B.velezensistự do thì pH thích hợp để vi khuẩn B.velezensissinh enzyme mạnh nhất là pH trung tính. Trong q trình ni cấy phải đảm bảo pH thích hợp thì vi khuẩn sinh enzyme mạnh nhất. Với kết quả thí nghiệm này tơi tiến hành chọn pH 6,0 cho thí nghiệm tiếp theo.
3.6. Kết quả khảo ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn đến khả năng sinh enzyme của vikhuẩnB.velezensiscố định vào biochar khuẩnB.velezensiscố định vào biochar
Thử nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B.velezensis với các tỷ lệ 1:5(w/v), 1:10(w/v), 1:15(w/v), 1:20(w/v) được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Đường kính vịng phân giải tinh bột và cellulose cố định vào biochar ở các tỷ lệ phối trộn khác nhau Tỷ lệ phối trộn ( w/v ) 1:5 ( w/v ) Amylase Cellulase B.velezensiscố định vào biochar 16mm 19.8mm B.velezensistự do 18mm 22mm
Kết quả thu được là tỷ lệ 1:5(w/v) vi khuẩn sinh enzyme mạnh nhất với đường kính vịng phân giải là 16mm và 19.8mm và tỷ lệ 1:10(w/v), 1:15(w/v) và 1:20(w/v) vi khuẩn B.velezensis khơng sinh enzyme. Vì ở tỷ lệ 1:10(w/v), 1:15(w/v) và 1:20(w/v) lượng vi khuẩn q lớn nên khoảng khơng trong biochar có giới hạn lượng vi khuẩn bám vào không hết sẽ ảnh hưởng đến mật độ nếu vi khuẩn phủ đầy biochar thì ức chế lẫn nhau nên tỷ lệ càng lớn thì lượng enzyme vi khuẩn sinh ra càng thấp hoặc khơng có. Tỷ lệ 1:5(w/v) phối trộn ở mức tương đối, vừa đủ để vi khuẩn sinh enzyme tốt nhất. Cần đảm bảo phối trộn với lượng vừa đủ đảm bảo vi khuẩn sinh enzyme tốt nhất. Với kết quả thí nghiệm trên tơi tiến hành chọn tỷ lệ 1:5(w/v) cho thí nghiệm tiếp theo.
3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc đến khả năng sinh enzyme củavi khuẩnB.velezensiscố định vào biochar vi khuẩnB.velezensiscố định vào biochar
Enzyme ngoại bào được vi khuẩnB.velezensis sinh ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc đến khả năng sinh enzyme được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8.Đường kính vịng phân giải tinh bột và cellulose cố định vào biochar ở các thời gian lắc khác nhau
Thời gian lắc ( giờ )
B.velezensistự do B.velezensiscố định vào biochar
Amylase Cellulase Amylase Cellulase
24 giờ 18mm 22mm 17,4mm 18,7mm
48 giờ 20,4mm 19,5mm
72 giờ 19,2mm 21mm
96 giờ 20mm 22mm
120 giờ 17,8mm 17,2mm
Dựa vào bảng 3.8 cho thấy vi khuẩn B.velezensis sinh enzyme tốt nhất ở tất cả các mốc thời gian cần khảo sát và sinh enzyme mạnh nhất 96 giờ, thấp nhất ở 24 giờ và 120 giờ. Ở 24 giờ tăng lên đạt đỉnh điểm đến 96 giờ, sau đó lại giảm dần ở 120 giờ. Vì khoảng thời gian 24 giờ không đủ để vi khuẩn sinh trưởng phát triển và sinh enzyme tốt nhất. Tuy nhiên, ở 120 giờ thì khoảng thời gian quá dài vi khuẩn ức chế lẫn nhau thì lượng enzyme thu được tương đối ít. Vì vậy, khoảng thời gian thích hợp để vi khuẩn sinh enzyme mạnh nhất ở 96 giờ. Cần kiểm soát các khoảng thời gian hợp lí nhất để theo dõi vi khuẩn sinh enzyme mạnh nhất. Với kết quả thí nghiệm này tơi tiến hành chọn thời gian là 96 giờ.
Từ kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn B.velezensis
cố định vào biochar cho thấy vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar hay vi khuẩn
phân giải của vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar lớn hơn so với đường kính vịng phân giải của vi khuẩn B.velezensistự do vì điều kiện mơi trường ni cấy thích hợp, khả năng tăng trưởng và sinh enzyme mạnh nhất khi cố định vào biochar. So với đề tài :“ Nghiên cứu quy trình cố định vi khuẩn B.velezensis vào biochar có nguồn gốc
từ vỏ trấu” được thực hiện bởi tác giả Phan Thị Kim Soa thì vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng vẫn giữ được hình thái khuẩn lạc, hình dạng, kích thước và các thơng số cũng tương đồng. Chọn lọc các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar lần lượt là mật độ vi khuẩn ở 107 ( cfu/ml ), pH 6.0, tỷ lệ phối trộn 1:5 ( w/v ), thời gian lắc là 96 giờ. Đây là điều kiện thích hợp để vi khuẩnB.velezensis cố định vào biochar hay vi khuẩn B.velezensis tự do sinh trưởng và sinh enzyme mạnh nhất. Lượng enzyme sinh ra nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, dệt may, giấy, dược phẩm,…Ứng dụng vi khuẩn B.velezensis trong các lĩnh vực giúp giảm giá thành và nâng cao năng suất.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.
4.1.Kết luận
- Dựa vào các đặc điểm của biochar, vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng vẫn giữ được hình thái khuẩn lạc, hình dạng và kích thước vi khuẩn.
- Vi khuẩnB.velezensis cố định vào biochar sinh enzyme ngoại bào rất mạnh. - Vi khuẩn B.velezensis cố định vào biochar sinh enzyme ngoại bào tốt nhất lân lượt qua các thông số: mật độ vi khuẩn là 107 cfu/ml, pH là pH 6,0, tỷ lệ phối trộn là 1:5(w/v), thời gian lắc là 96 giờ.
4.2. Kiến nghị
- Cần phải khảo sát khả năng ảnh hưởng pH ở các giá trị cao hơn và thời gian khảo sát lâu hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu trong nước
− [1]http://kkhtn.duytan.edu.vn/Home/ArticleDetail/vn/94/2066/khao-sat-kha- nang-tong-hop-cellulase-ngoai-bao-cua-vi-khuan-bacillus-subtilis.
− [2] http://kythuatnuoitrong.com/dac-tinh-sinh-hoc-cua-vi-khuan-bacillus-sutilis. − [3] Phạm Văn Ty (2006), Công nghệ sinh học – công nghệ vi sinh và môi
trường, NXB Giáo Dục, Tp.HCM., NXB giáo Dục, TPHCM.
− [4]http://luanvan.net.vn/luan-van/luan-van-khao-sat-dieu-kien-nuoi-cay-va-sinh- bao-tu-vi-khuan-bacillus-subtilis-7991/
− [5]Phạm Thị Tuyết Ngân, 2011. Nghiên cứu quần thể chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao ni tơm sú (Penaeus monodon). Luận án Tiến sĩ Thủy sản. Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
− [6]Trần Thị Thu Hiền, 2010. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus ứng dụng tạo chế phẩm sinh học để xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản. Luận văn cao học. Viện công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm. Đại học Bách Khoa Hà Nội.
Tài liệu nước ngoài
− [1] Altan, A. (2004), Isolation and Molecular Characterization of Extracellular Lipase and Pectinase Producing Bacteria from Olive Oil Mills, İzmir Institute of Technology.
− [2] Arici, M., Bilgin, B., Sagdic, O. and Ozdemir, C. (2004), Some characteristics of Lactobacillus isolates from infant faeces, Food Microbiology, 21(1), 19–24.
− [3] Balcázar, J.L., de Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I., Cunningham, D., Vendrell, D. and Múzquiz, J.L. (2006), The role of probiotics in aquaculture, Veterinary microbiology, 114(3-4), 173–186. 11
− [4] Balcázar, J.L. and Rojas-Luna, T. (2007), Inhibitory Activity of Probiotic Bacillus subtilis UTM 126 Against Vibrio Species Confers Protection Against Vibriosis in Juvenile Shrimp (Litopenaeus vannamei), Current Microbiology, 55(5), 409–412.
− [5] Chythanya, R., Karunasagar, I. and Karunasagar, I. (2002), Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas-2 strain, Aquaculture, 208(1), 1–10.
− [6] Mishra, V. and Prasad, D.N. (2005), Application of in vitro methods for selection of Lactobacillus casei strains as potential probiotics, International Journal of Food Microbiology, 103(1), 109–115.
− [7] Purivirojkul, W., and Areechon, (2007), Application of Bacillus spp. isolated from intestine of black tiger shrimp (Penaeus monodon Fabricius) from natural habita for control pathogenic bacteria in aquacult, Kasetsart J. (Nat. Sci), 41, pp. 125-132.
− [8] Vaseeharan, B. and Ramasamy, P. (2003), Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon, Letters in applied microbiology, 36(2), 83–87.
PHỤ LỤC
A. Thành phần môi trường Stasch Agar (g/l)
Meat Extract 3,0 gam.
Peptone 5,0 gam.
Tinh bột tan 2,0 gam.
Agar 20,0 gam.
B. Thành phần môi trường CMC Agar (g/l)
NaNO3 2,0 gam. K2HPO4 1,0 gam. MgSO4 0,5 gam. KCl 0,5 gam. CMC 5,0 gam. Peptone 0,2 gam. Agar 20,0 gam.
C. Thống kê xử lí số liệu bằng chương trình Statistical Analysis Systems 9,4 (SAS) 1. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng sinh enzyme amylase
DATA; INPUT T $ N @@; CARDS; a 16.25 a 17.8 a 16 b 18.8 b 15.6 b 17.8 c 21.8
c 21.25 c 21 d 20 d 20 d 18.8 ; PROC ANOVA; CLASS T; MODEL N = T; MEANS T / LSD ;
TITLE ‘kha nang sinh enzyme amylase’; RUN;
kha nang sinh enzyme amylase The ANOVA Procedure
Class Level Information Class Levels Values T 4 a b c d
Number of Observations Read 12
Number of Observations Used 12 kha nang sinh enzyme amylase
Dependent Variable: N
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 40.72750000 13.57583333 12.69 0.0021
Error 8 8.55666667 1.06958333
Corrected Total 11 49.28416667
R-Square Coeff Var Root MSE N Mean
0.826381 5.513318 1.034207 18.75833
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 3 40.72750000 13.57583333 12.69 0.0021 The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for N
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 1.069583
Critical Value of t 2.30600
Least Significant Difference 1.9473
Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T
Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 21.3500 3 c A A 19.6000 3 d B 17.4000 3 b B B 16.6833 3 a
2. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng sinh enzyme cellulase.
DATA; INPUT T $ N @@; CARDS; a 20.2 a 18.8 a 21.5 b 20 b 19.8 b 18.8 c 20 c 20 c 20 d 20.4
d 18.5 d 18.5 ; PROC ANOVA; CLASS T;