Khi bào tử gặp điều kiện thuận lợi thì bào từ sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng mới (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003).
1.4.3.2. Thành phần hoá học của bào tử
Các lớp bao và màng của bào tử có cấu tạo cơ bản là protein có chứa nhiều glycine, tyrosine và đặc biệt là cystein, ngồi ra cịn có sự tham gia của keratin. Nguyên sinh chất của bào tử có chứa nhiễm sắc thể, ribosome và enzyme chuyển hoá ở trạng thái khơng hoạt động. Khi bào tử nảy mầm thì những enzyme này bắt đầu hoạt động. Bào tử có chứa một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic. Acid này chiếm từ 5- 12% khối lượng khô của bào tử (acid này khơng bao giờ có trong tế bào sinh dưỡng, nó được hình thành trong q trình hình thành bào tử và mất đi khi nảy mầm). Lượng nước trong bào tử rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết.
1.4.4. Bộ gen củaB.velezensis
Năm 1997, người ta đã hồn tất việc nghiên cứu về trình tự gen củaB.velezensis
lần đầu tiên cơng bố trình tự gen của vi khuẩn này. Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4.110 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen khơng thể thiếu được, 79 gen được dự đốn là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với q trình trao đổi chất của tế bào.
1.4.5. Tính chất đối kháng
Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện mơi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố
môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi mơi trường ni cấy nấm bệnh có sự hiện diện của
B.velezensis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh dưỡng. Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976).
1.4.6. Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974),B.velezensisthuộc: Giới (Kingdom):Bacteria.
Ngành (Division): Firmicutes.
Lớp (Class): Bacilli.
Bộ (Order): Bacillales.
Họ (Family):Bacillaceae.
Giống (Genus):Bacillus.
Lồi (Species): Bacillus velezensis.
1.4.7. Đặc điểm ni cấy
Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 370C.
Nhu cầu O2: B.velezensislà vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.
Môi trường:Môi trường thạch đĩa BHIB: khuẩn lạc dạng trịn, lồi, rìa khơng đều, màu trắng đục, đường kính ≤ 0.5 mm.
1.4.8. Cấu trúc kháng nguyên
B.velezensis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L - acid glutamic. Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-.
1.4.9. Tính đối kháng củaB.velezensisvới một số vi sinh vật gây bệnh
DoB.velezensis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng chịu đựng được acid dạ dày, các chất dịch tiêu hố trong đường ruột. Chúng cịn có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột.
B.velezensis với một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế.
Với đồng loại, các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đơng”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài.B.velezensis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ. Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn cơng, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ.
Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì khơng thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt. Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004).
1.4.10. Đặc điểm có lợi của vi khuẩnB.velezensis
1.4.10.1. Sinh enzyme ngoại bào.
Vi khuẩnB.velezensiscó khả năng sản xuất rất nhiều các loại enzyme tiêu hóa khác nhau dựa vào nguồn cơ chất khác nhau, bao gồm các enzyme:
B.velezensis có thể tổng hợp nên enzyme α - amylase. Dưới tác dụng của α – amylase tinh bột và các sản phẩm chứa tinh bột sẽ bị thủy phân thành đường glucose. Enzyme α – amylase củaB.velezensisphân giải tinh bột nguyên nhanh hơn 2 – 2,5 lần so với bình thường.
b. Enzyme protease
Enzyme protease là nhóm enzyme xúc tác q trình thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến được sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Protease là enzyme quan trọng, cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể vì protease có khả năng phân hủy protein tạo thành acid amin giúp cho sinh vật dễ hấp thu hơn và tổng hợp cấu trúc cơ thịt của vật nuôi.
c. Enzyme lipase
Lipase là enzyme tan được trong nước, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết ester trong chất nền lipid không tan trong nước tạo thành glycerol và acid béo giúp cho quá trình hấp thu chất béo tốt hơn.
Lipase thực hiện chức năng cần thiết trong q trình vận chuyển, tiêu hóa và xử lý các chất béo của chế độ ăn như triglyceride, dầu, mỡ trong hầu hết các sinh vật sống.
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu2.1.1. Thời gian nghiên cứu 2.1.1. Thời gian nghiên cứu
- Từ tháng 05 năm 2020 đến tháng 08 năm 2020.
2.1.2. Địa điểm
2.1.2.1. Địa điểm phân tích thí nghiệm
Phịng thí nghiệm Vi sinh của Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ Tp.HCM, khu E3 lô E1, phân khu đào tạo E1, khu Công Nghệ cao Tp.HCM, Phường Hiệp Phú, Quận 9, Tp.HCM.
2.2. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị2.2.1. Vật liệu 2.2.1. Vật liệu
Vi khuẩnB.velezensisđược phân lập và định danh từ đề tài:“ Nghiên cứu, phân lập, sàng lọc các chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng sinh enzyme ngoại bào”được thực hiện bởi tác giả là Trần Hữu Thành.
Biochar được lấy từ Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM. Mẫu sau khi lấy được chuyển về phịng thí nghiệm của Viện Khoa HọcỨng dụng - Trường Đại học Cơng Nghệ Tp.HCM.
2.2.2. Hóa chất
Dung dịch HCl 1N Agar Dung dịch NaOH 1N NaCl Cồn 70o, cồn 96o BHI
Lugol Fuchsin
2.2.3. Dụng cụ và thiết bị Cốc 250ml Erlen 250ml Pipetman 100µl, 1000µl Pipet 5ml, 20ml Bóp cao su Đầu típ Đũa thủy tinh
Bao hấp, giấy gói, thun Đèn cồn
Bông không thấm, bông thấm Seal Tủ cấy. Nồi hấp khử trùng Autoclave (Hàn Quốc). Tủ lạnh. Tủ hút. Kính hiển vi (Olympus, Nhật). Cân phân tích (OHAUS, USA). Máy cất nước.
Bếp từ.
Máy ly tâm (Hettich, Đức). Máy đo OD
2.3. Phương pháp nghiên cứu2.3.1. Phương pháp nhuộm gram 2.3.1. Phương pháp nhuộm gram
Làm tiêu bản
Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên lame. Dùng que cấy lấy một ít sinh khối .
Để khơ vết bơi trong khơng khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn.
Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh trong 1 phút. Rửa nước.
Nhuộm lugol trong 1 phút. Rửa nước.
Rửa cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu.
Rửa nước.
Rửa nước.
Làm khơ và soi tiêu bản với vật kính dầu.
2.3.2. Phương pháp nhuộm bào tử
Dùng dây cấy vịng vơ trùng lấy sinh khối vi khuẩn cần xác định làm vết bôi trên lame.
Đặt một cốc nước trên bếp từ và đun sơi. Sau đó đặt lên trên miệng cốc một miếng giấy lọc.
Cho dung dịch Malachite Green 5% vào vết bơi và đặt lame có sinh khối của vi khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong khoảng thời gian 5 phút.
Sau đó rửa vết bơi bằng nước cất trong khoảng thời gian 30 giây. Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fuchsin trong khoảng 60-90 giây. Rửa lại bằng nước rồi thấm khơ.
Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X.
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật
Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, dễ thực hiện, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện mơi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó cá chủng này được chuyển vào tủ mát từ 30C – 50C để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, nhằm đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian dịnh kì cấy chuyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền 1 lần.
Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ ở nhiệt độ 40C. Sau 1 đến 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dung que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới đem đi ủ, thời gian ủ từ 48-72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C ( Nguyễn Văn Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.4. Phương pháp tăng sinh và xác định mật độ vi khuẩn
a. Mục đích:nhằm hoạt hóa các vi khuẩn được giữ giống phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong q trình bảo quản.
b. Ngun tắc
Sử dụng phương pháp ni cấy vi sinh vật trên mơi trường dinh dưỡng thích hợp. Mơi trường dinh dưỡng thích hợp khơng những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà cịn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường.
c. Cách tiến hành
Đối với giống vi khuẩn được giữ trong glycerol 20%, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối của vi khuẩn cho vào erlen chứa 10ml BHI trong điều kiện vô trùng. Sau đó, ủ lắc với tốc độ 150 vịng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013). Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng λ = 600nm.
d. Cơng thức tính tốn xác định mật độ tế bào (cơng thức McFahrland)
Mật độ (cfu/ml) = OD600nmx 1,02 x 109
2.3.5. Phương pháp bảo quản lạnh sâu.
Ngồi phương pháp giữ giống trên mơi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong q trình làm lạnh và tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong máy bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và tan nhanh như glycerol.
Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong mơi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 2 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu
cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Văn Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.6. Phương pháp đánh giá khả năng sinh enzyme amylasea. Nguyên tắc của thử nghiệm a. Nguyên tắc của thử nghiệm
Mục đích là để xác định xem vi khuẩn có khả năng sản sinh ra enzyme amylase thủy phân tinh bột thành glucose hay khơng?
b. Cơ sở sinh hóa
Tinh bột là một đại lượng phân tử có cấu trúc từ các đơn phân là glucose gồm có hai dạng amylose và amylopectin. Amylase là phân tử tinh bột dạng thẳng khơng có phân nhánh, cấu tạo từ 200 – 300 đơn vị, trong khi đó amylopectin là phân tử phân nhánh. Tinh bột dễ dàng bị thủy phân bởi các vi sinh vật có khả năng sản sinh ra enzyme amylase để tạo thành dextrin, maltose và glucose.
Để phát hiện khả năng phân hủy tinh bột, sử dụng thuốc thử glugol làm chất chỉ thị. Khi có sự hiện diện của tinh bột, iodine tạo phức màu nâu. Khi tinh bột bị enzyme thủy phân, iodine không tạo phức nên màu nâu biến mất.
c. Cách tiến hành thí nghiệm
Đầu tiên, tiến hành tăng sinh chủng vi khuẩn B.velezensis phân lập trong môi trường BHIB trong 24 giờ ở 370C. Sau đó pha lỗng về mật độ 108cfu/ml, hút 100µl dịch cho vào mơi trường BHIA, trang đều ủ ở 370C trong 24 giờ.
Trên các đĩa môi trường Starch Agar, đục các lỗ có đường kính 7mm. Sau đó gắp khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn cho vào các lỗ trên đĩa môi trường khảo sát. Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Sau 24 giờ nhỏ lugol vào đĩa và đọc kết quả.
d. Đọc kết quả
Thử nghiệm ( + ): xuất hiện vòng phân giải của tinh bột (màu vàng của lugol) Thử nghiệm ( - ): toàn bộ đĩa xuất hiện màu xanh đen.
2.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng sinh enzyme cellulasea. Nguyên tắc của thử nghiệm a. Nguyên tắc của thử nghiệm
Mục đích là để xác định xem vi khuẩn có khả năng sản sinh ra enzyme cellulase thủy phân cellulose thành glucose hay không?
b. Cơ sở sinh hóa
Cellulase C1 cịn được gọi là exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-α-D-glucan cellobiohydrolase). Enzyme này thủy phân đặc hiệu liên kết α -1,4-glucoside ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose (cấu trúc gồm 2 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α -1,4-glucoside). Enzyme này khơng có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng.
Cellulase Cx còn được gọi là endocellulase (endoglucanase; 1,4-β-D-glucan-4- glucanohydrolase). Enzyme này thủy phân liên kết α-1,4-glucoside ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose như CMC và HEC. Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vơ định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh.
α -glucosidase (cellbiase; α -D-glucoside glucohydrolase) khơng có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy mà tham gia phân hủy cellobiose, cellodextrin tạo thành D- glucose.
c. Cách tiến hành thí nghiệm
Tiến hành chuẩn bị dịch vi khuẩnB.velezensisnhư trên.
Trên đĩa môi trường CMC, tiến hành đục các lỗ có đường kính 7mm. Sau đó gắpcác khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn vào các lỗ trên đĩa môi trường khảo sát. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Sau đó nhỏ lugol vào và đọc kết quả.
d. Đọc kết quả
Thử nghiệm ( + ): không xuất hiện màu nâu xung quanh điểm cấy.
2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
2.4. Bố trí thí nghiệm2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Biochar Khảo sát các yếu tố vật lý, hóa học Tăng sinh Xác định mật độ Dịch vi khuẩn Xử lí Cố định vi khuẩn
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩnBacillus velezensisz