Phân lập hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế enzyme a glucosidase và kháng 2 dòng tế bào ung thư gan và phổi từ nhân trần tía (adenosma bracteosumbonati)

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM LƯƠNG THỊ NGỌC HÂN PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α GLUCOSIDASE VÀ KHÁNG 2 DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ GAN VÀ PHỔI TỪ NHÂN TRẦN TÍA (ADENOSMA BRACTEOSUM BONATI ) LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành 60420201 TP HỒ CHÍ MINH, tháng 10 năm 2021 ii CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Ngọc Hồng Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Côn.

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM - LƯƠNG THỊ NGỌC HÂN PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE VÀ KHÁNG DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ GAN VÀ PHỔI TỪ NHÂN TRẦN TÍA (ADENOSMA BRACTEOSUM BONATI.) LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 60420201 TP HỒ CHÍ MINH, tháng 10 năm 2021 ii CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Ngọc Hồng Luận văn Thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Công Nghệ TP HCM ngày 22 tháng 10 năm 2021 Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ) TT Họ tên Chức danh Hội đồng PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Chủ tịch TS Nguyễn Hoàng Dũng Phản biện TS Nguyễn Hoài Hương Phản biện TS Trịnh Thị Lan Anh TS San Trâm Anh Ủy viên Ủy viên, Thư ký Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau Luận văn sửa chữa (nếu có) Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn iii TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Độc lập – Tự – Hạnh phúc Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 09 năm 2021 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lương Thị Ngọc Hân Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 04/03/1996 Nơi sinh: Tiền Giang Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 1841880005 I- Tên đề tài: Phân lập hợp chất tự nhiên có khả ức chế enzyme α-glucosidase kháng dòng tế bào ung thư gan phổi từ nhân trần tía (Adenosma brateosum Bonati.) II- Nhiệm vụ nội dung: – Nội dung 1: Tổng quan tài liệu liên quan đến đề tài – Nội dụng 2: Khảo sát sơ độc tính cytotocic bào xác Artemia – Nội dung 3: Khảo sát khả ức chế α-glucosidase – Nội dung 4: Đánh giá hoạt tính gây độc hai dịng tế bào ung thư HepG2 A549 cao chiết cồn nhân trần tía – Nội dụng 5: Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ cao phân đoạn HE – Nội dụng 6: Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất tự nhiên phân lập từ cao phân đoạn HE – Nội dung 7: Đề xuất hướng nghiên cứu ứng dụng sản phẩm thực tiễn từ nhân trần III- Ngày giao nhiệm vụ: Ngày 23 tháng 07 năm 2020 IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: Ngày 19 tháng 02 năm 2021 V- Cán hướng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Hồng CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Học viên thực Luận văn Lương Thị Ngọc Hân ii LỜI CÁM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, q thầy giảng dạy Viện Khoa Hoc Ứng Dụng tất thầy cô truyền dạy kiến thức quý báu cho em suốt năm học vừa qua Qua em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Nguyễn Ngọc Hồng, thầy Dương Thúc Huy người định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp Bên cạnh em xin cảm ơn thầy anh chị Phịng Thí Nghiệm Xưởng Chế biến bảo quản Sau thu hoạch nuôi trồng thủy sản – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao anh, chị, bạn phịng thí nghiệm Hợp chất tự nhiên – trường Đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt đề tài Cuối cùng, xin cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh, động viên lúc khó khăn, nản lịng suốt thời gian học tập, nghiên cứu sống Lương Thị Ngọc Hân iii TÓM TẮT Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.) sử dụng từ lâu loại dược liệu, nguồn gốc từ thiên nhiên, có nhiều tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, tiêu độc, chữa cảm cúm, táo bón, vàng da bệnh gan mật, giới có nghiên cứu tiến hành nhân trần tía Mục đích nghiên cứu khảo sát sơ độc tính cytotocic bào xác Artemia, khả chống tăng đường huyết thơng qua hoạt tính ức chế enzyme α –glucosidase, đồng thời tách chiết hợp chất tinh khiết từ cao cồn Adenosma bracteosum Bonati đánh giá khả gây độc hai dòng tế bào ung thư gan HepG2 phổi A549 cao cồn hợp chất phân lập Kết thử nghiệm cho thấy cao chiết cồn có khả gây độc tốt cao chiết nước (cao chiết nước gần khơng có độc tính) Trong cao phân đoạn cao cồn cao phân đoạn HE có hoạt tính gây độc Artemia mạnh phân đoạn lại Khả gây độc hai dòng tế bào ung thư HepG2 A549 cho thấy cao cồn 2,8 lần 3,3 lần so với đối chứng thuốc chống ung thư camptothecin nồng độ Có thể nhận thấy cao chiết cồn Adenosma bracteosum Bonati có tiềm Nghiên cứu cung cấp sở làm tảng cho nghiên cứu sâu thành phần chế kháng ung thư loài Từ cao cồn tách phân đoạn HE (hexan:ethylacetate = 1:1), tiến hành kỹ thuật sắc ký phân lập ba hợp chất tinh khiết Dựa vào sắc ký phổ đồ xác định cấu trúc định danh ba chất HA1, HA2, HA3 là: 5,4'-dihydroxy-6,7,8,3'tetramethoxyflavone, 5-demethynobiletin, cirsilineol Hai ba hợp chất (HA1, HA2) vừa phân lập định danh hợp chất mới, chưa công bố nghiên cứu khoa học Adenosma bracteosum Bonati Kết thử nghiệm cho thấy ba hợp chất có khả ức chế enzyme α –glucosidase, giúp làm giảm lượng đường máu, hữu ích việc hỗ trợ điều trị đái tháo đường Trên hai dòng tế bào ung thư HepG2 A549, ba hợp chất thể khả ức chế ung thư iv gan tốt ung thư phổi Đối với dịng tế bào HepG2, HA1 HA3 có hoạt tính mạnh, HA2 hoạt tính trung bình Đối với dòng tế bào A549, HA2 lại ức chế yếu, HA1 HA3 có khả ức chế mạnh hẳn Những kết thu cho thấy Adenosma bracteosum Bonati có tiềm sinh học lớn Nghiên cứu cung cấp thơng tin hữu ích cho nghiên cứu sâu phân tích hoạt tính sinh học hợp chất tự nhiên có lồi thực vật v ABSTRACT Adenosma bracteosum Bonati has been used for a long time as a medicinal herb derived from nature, it has many effects to support digestion, detoxify, treat flu, constipation, jaundice and hepatobiliary disease, but in the world there are very few studies conducted on purple ceiling The aim of this study was to investigate preliminary cytotocic toxicity on Artemia cysts, anti-hyperglycemic ability through α-glucosidase enzyme inhibitory activity, and at the same time to extract pure compounds from alcohol extract of Adenosma bracteosum Bonati and evaluated the cytotoxicity on two liver cancer cell lines HepG2 and lung A549 from alcohol extract and isolated compounds The test results show that the alcohol extract is more toxic than the aqueous extract (the water extract has almost no toxicity) Among fractions of the alcohol extract, the HE fraction was more toxic to Artemia than the other fractions The cytotoxicity on two cancer cell lines HepG2 and A549 also showed that high alcohol was only 2.8 times and 3.3 times worse than anti-cancer drug control that camptothecin at the same concentration The alcohol extract of Adenosma bracteosum Bonati can be seen to have great potential This study also provides the basis for further studies on the composition as well as the anti-cancer mechanism of this plant Ethanolic extracts was separated with HE (hexan: ethylacetate = 1:1), carries out chromatographic techniques and through many chromatographic columns has isolated three pure compounds Based on the chromatograms and spectroscopy, the structure and identification of three substances HA1, HA2, HA3 were determined: 5,4'-dihydroxy6,7,8,3'-tetramethoxyflavone, 5-demethynobiletin, cirsilineol Two of the three compounds (HA1, HA2) have just been isolated and identified as new compounds that have never been published in scientific studies on Adenosma bracteosum Bonati The test results also show that all three compounds have the ability to inhibit the enzyme αglucosidase, which helps to reduce blood sugar, which is very useful in supporting the vi treatment of diabetes In two cancer cell lines HepG2 and A549, all three compounds showed better inhibition of liver cancer than lung cancer For the HepG2 cell line, HA1 and HA3 were highly active, and HA2 was moderately active For cell line A549, HA2 is weakly inhibited, HA1 and HA3 have stronger inhibitory ability The obtained results showed that Adenosma bracteosum Bonati has great biological potential This study provides useful information for further studies to analyze the biological activity of natural compounds present in this plant vii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xi DANH MỤC CÁC BẢNG xiii DANH MỤC CÁC HÌNH xiv MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Tính cấp thiết đề tài Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Chi Adenosma 1.1.1 Vị trí phân loại thực vật 1.1.2 Đặc điểm hình thái chi Adenosma 1.1.3 Phân bố chi Adenosma 1.2 Thành phần hố học Nhân trần tía (Adenosma bracteosum) 10 1.2.1 Tinh dầu 10 1.2.2 Thành phần khác 10 1.3 Tác dụng sinh học Nhân trần tía (Adenosma bracteosum) 11 1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn 11 1.3.2 Tác dụng gan 12 1.3.3 Tác dụng chống oxy hóa 12 1.3.4 Tác dụng chống viêm 12 1.4 Tác dụng theo y học cổ truyền 12 1.5 Khả ức chế enzyme α-glucosidase mối liên hệ với đái tháo đường 14 PHỤ LỤC Phụ lục Dữ liệu phổ 1H-NMR HA1 Acetone-d6 Phụ lục Dữ liệu phổ 13C-NMR HA1 Acetone-d6 Phụ lục Dữ liệu HMBC hợp chất HA1 Acetone-d6 Phụ lục Dữ liệu HSQC hợp chất HA1 Acetone-d6 Phụ lục Dữ liệu phổ 1H-NMR HA2 Acetone-d6 Phụ lục Dữ liệu phổ 13C-NMR HA2 Acetone-d6 Phụ lục Dữ liệu HMBC hợp chất HA2 Acetone-d6 Phụ lục Dữ liệu HMBC giãn rộng hợp chất HA2 Acetone-d6 Phụ lục Dữ liệu HSQC hợp chất HA2 Acetone-d6 Phụ lục 10 Dữ liệu phổ 1H-NMR HA3 Acetone-d6 Phụ lục 11 Dữ liệu phổ 13C-NMR hợp chất HA3 Acetone-d6 Phụ lục 12 Dữ liệu HSQC hợp chất HA3 Acetone-d6 Phụ lục 13 Dữ liệu phổ HMBC hợp chất HA3 đo Acetone-d6 Phụ lục 14 Dữ liệu HMBC giãn rộng hợp chất HA3 Acetone-d6 Nồng độ (ug/mL) 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5 0.75 Nồng độ (ug/mL) 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5 0.75 HA1 12687 32457 44195 50516 58135 62189 74325 79004 13320 33090 42274 51000 58747 61135 73380 79682 10058 32331 43419 50192 59578 60640 73477 78186 Trung bình 12022 32626 43296 50569 58820 61321 73727 78957 % 14 38 51 59 69 72 87 93 SD 1730 407 966 407 724 791 520 749 Trung bình 31143 56453 65283 68884 76224 75424 78600 84018 % 37 66 77 81 90 89 92 99 SD 991 1042 1924 612 806 1598 3421 367 HA2 32104 57312 67302 68969 75316 76483 75887 83594 30124 56752 63471 68233 76854 76203 77471 84225 31201 55294 65077 69449 76502 73586 82443 84234 Phụ lục 15 Số liệu thử nghiệm hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư gan HepG2 HA1 HA2 Nồng độ (ug/mL) 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5 0.75 Nồng độ (ug/mL) 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5 0.75 HA3 10120 25620 41671 55655 56274 56637 68212 65243 10421 19249 31192 43949 45559 48851 57091 66400 10123 23903 43870 55189 58093 56906 64278 77790 10024 19391 30597 46651 46648 46551 53541 67922 Trung bình 10414 25512 41981 56962 60855 60311 65545 71543 % 12 30 49 67 71 71 77 84 SD 507 1557 1754 2677 6425 6132 2311 6274 Camptothecin Trung bình 10245 10230 17349 18663 35315 32368 44857 45152 47929 46712 47222 47541 52958 54530 65990 66771 % 12 22 38 53 55 56 64 78 SD 199 1140 2569 1375 1186 1183 2237 1018 11000 27012 40403 60041 68199 67390 64144 71596 Phụ lục 16 Số liệu thử nghiệm hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư gan HepG2 HA3 Camptothecin Nồng độ (ug/mL) 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5 0.75 Nồng độ (ug/mL) 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5 0.75 HA1 24101 56543 61700 70431 102174 125356 154941 193021 22415 78530 63781 75043 117488 126518 172804 191793 23214 68250 63874 83700 119952 123075 159228 181770 Trung bình 23243 67774 63118 76391 113205 124983 162324 188861 % 10 30 28 33 49 54 71 82 SD 11001 11001 1229 6736 9632 1752 9325 6172 Trung bình 93928 146455 173464 191118 208318 214119 206178 223412 % 41 64 76 83 91 93 90 97 SD 2304 1874 3708 1355 2327 4633 4351 3223 HA2 92542 145772 172370 190357 206150 210995 204412 227112 92654 148575 170426 192683 210776 219442 211134 221217 96587 145019 177595 190315 208028 211920 202987 221907 Phụ lục 17 Số liệu thử nghiệm hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư gan A529 HA1 HA2 Nồng độ (ug/mL) 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5 0.75 Nồng độ (ug/mL) 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5 0.75 HA3 5101 11578 70435 92259 118214 178212 192100 194683 5212 71953 83524 82883 92907 98646 111688 128331 6241 11856 68602 93896 120130 164951 186491 186547 6321 14162 73452 97148 121262 171016 183895 196117 Trung bình 5888 12532 70830 94434 119869 171393 187495 192449 % 31 41 52 75 82 84 SD 1418 1418 2449 2489 1541 6639 4194 5161 5425 73285 88350 81518 90284 99763 117923 129215 Camptothecin Trung bình 6524 5720 69829 71689 81807 84560 83286 82562 90355 91182 103784 100731 115287 114966 125186 127577 % 31 37 36 40 44 50 56 SD 704 1743 3392 927 1494 2702 3130 2118 Phụ lục 18 Số liệu thử nghiệm hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư gan A529 HA3 Camptothecin ... tài: Phân lập hợp chất tự nhiên có khả ức chế enzyme α -glucosidase kháng dòng tế bào ung thư gan phổi từ nhân trần t? ?a (Adenosma brateosum Bonati.) II- Nhiệm vụ nội dung: – Nội dung 1: Tổng quan... Khảo sát khả gây độc dòng tế bào ung thư HepG2 A5 49 số hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn HE nhân trần t? ?a  Ý ngh? ?a khoa học Phân lập hợp chất tinh khiết từ nhân trần t? ?a Chứng minh nhân trần. .. thư? ?ng gốc tự có liên quan đến phát triển ung thư [14, 52, 56] 1.6.1 Ung thư gan 1.6.1.1 Ung thư gan gì? Ung thư gan ung thư xuất phát từ loại tế bào gan Gan có kích thư? ??c cỡ trái banh bầu dục