Ứng Dụng Nấm Men Lên Men Xylose Trong Sản Xuất Cồn Nhiên Liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI o0o LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ỨNG DỤNG NẤM MEN LÊN MEN XYLOSE TRONG SẢN XUẤT CỒN NHIÊN LIỆU NGUYỄN THANH THỦY HÀ NỘI - 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI o0o LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC ỨNG DỤNG NẤM MEN LÊN MEN XYLOSE TRONG SẢN XUẤT CỒN NHIÊN LIỆU NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGUYỄN THANH THỦY Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ NGUYÊN THÀNH HÀ NỘI - 2007 MỞ ĐẦU Ethanol hay ethyl alcohol (cồn) chất lỏng khơng màu, hồ tan nước, sơi 78,32oC có cơng thức hố học C2H5OH Ethanol có tác dụng diệt khuẩn mạnh, ưu điểm ethanol phạm vi ứng dụng diệt khuẩn sau tác dụng, bốc nhanh không để lại dư lượng Ethanol dùng để nâng cao hiệu hoá chất khác Nó hố chất bản, quan trọng dùng ngành cơng nghiệp hố học cơng nghiệp dược phẩm Đối với ngành công nghiệp thực phẩm, ethanol loại thành phần quan trọng để sản xuất loại đồ uống bia, vang, rượu mạnh Đặc biệt ngày nay, ethanol coi nguồn nhiên liệu sạch, nhiên liệu tương lai, có vị trí thay nguồn nhiên liệu hố thạch ngày cạn kiệt than đá, dầu mỏ [2, 8] Chính thế, giải pháp ứng dụng cồn nhiên liệu xu hướng tất yếu giới [12] Trên thực tế, việc sản xuất cồn thực dựa hai hướng chính: Cơng nghệ hyđrat hóa ethylen theo phương pháp sinh học Trong đó, phương pháp sinh học với khả tận dụng chất thải nông nghiệp nguồn nguyên liệu ban đầu cho q trình lên men có ưu vượt trội đầy tiềm Quá trình thực có ý nghĩa to lớn mặt thương mại tận dụng xử lý chất thải từ ngành cơng nghiệp mía đường, ngành công nghiệp giấy nguồn lignocellulose từ thiên nhiên Trong số nguồn nguyên liệu sinh học cho sản xuất ethanol, nguồn nguyên liệu cellulose thực dồi khai thác [15] Sản lượng sinh khối thực vật toàn cầu hàng năm vào khoảng 200 tỷ tấn, 90% số lignocellulose Khoảng 8-20 tỷ thực tế sử dụng để sản xuất ethanol Mặc dù có nhiều cố gắng việc sản xuất ethanol từ nguồn tài nguyên tái sinh quy mô công nghiệp gặp nhiều khó khăn Sinh khối thực vật giàu lignocellulose nguyên liệu phức tạp nhiều so với tinh bột Thành phần chủ chốt chúng bao gồm cellulose, hemicellulose lignin gắn kết chặt chẽ với liên kết hydro liên kết đồng hóa trị Để sản xuất ethanol, polymer sinh học cần phân huỷ thành đường đơn sau hỗn hợp đường hexose (chủ yếu glucose) pentose (chủ yếu xylose) lên men thành ethanol [10] Có hai hướng tiếp cận vấn đề này, thơng qua thủy phân axit thủy phân enzyme [9, 11, 12] Công nghệ thủy phân axit có từ trước Đại chiến Thế giới lần thứ II sử dụng rộng rãi thời kỳ Trong trình thủy phân sử dụng axit lượng đáng kể đường bị phân hủy sản sinh chất độc hại (như furfuran) vi sinh vật công đoạn lên men [13, 14, 16] Hiện nay, công nghệ thủy phân axit khơng nghiên cứu nhiều tương đối ổn định khó hạ giá thành Một khó khăn khác sản xuất cồn nhiên liệu từ lignocellulose liên quan tới khả lên men đường xylose (chiếm 20-30% lượng đường tạo ra) thành ethanol chủng nấm men Trong số nghìn lồi nấm men biết có lồi có khả lên men xylose mức độ khác Hiện nay, nấm men Pachysolen tannophilus sử dụng lên men dịch thuỷ phân hemicellulose (sản phẩm chủ yếu xylose) để tạo thành ethanol Tuy nhiên nấm men P tannophilus khơng tích luỹ q % ethanol canh trường điều hạn chế lớn sản xuất [9] Vì vậy, nhiệm vụ quan trọng trước mắt tìm kiếm chủng nấm men có khả lên men hiệu ethanol quy mô công nghiệp Ở Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng cồn nhiên liệu bắt đầu quan tâm năm gần Để đáp ứng mục tiêu nghiên cứu sản xuất cồn nhiên liệu giải khâu chủ chốt tồn q trình sản xuất, điều đồng nghĩa với việc giải tốt khó khăn q trình thủy phân ngun liệu ban đầu tuyển chọn chủng giống cho công nghệ lên men ethanol Chính mà chúng tơi chọn đề tài nghiên cứu Ứng dụng nấm men lên men xylose sản xuất cồn nhiên liệu Nội dung nghiên cứu : -Phân lập, tuyển chọn chủng giống lên men xylose + Phân lập sàng lọc chủng giống có khả lên men xylose + Xác định đặc điểm sinh lý chủng lựa chọn + Định tên chủng lựa chọn giải trình tự gen 26S rDNA -Xây dựng phương pháp xác định cồn enzyme +Tìm cơng thức chất cho phản ứng enzyme kit ALCOTEST +Xây dựng đường chuẩn ethanol -Tinh chế thu hồi enzyme AOX HRP để thay enzyme thương phẩm CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 XU THẾ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHIỆP CỒN NHIÊN LIỆU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM Cồn dung mơi quan trọng, sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác thực phẩm, dược phẩm, y tế số ngành công nghiệp (làm dung môi công nghệ sơn, vecni….) Hiện trước tình hình nguồn nhiên liệu hố thạch (than đá dầu mỏ) dần cạn kiệt người quan tâm tới việc sản xuất sử dụng nguồn nhiên liệu sinh học (Bio-Fuel) để thay cho nguồn nhiên liệu hoá thạch Theo BP, tập đoàn dầu mỏ hàng đầu giới, trữ lượng dầu mỏ toàn cầu thăm dò tới năm 2003 khoảng 150 tỷ Mức tiêu thụ dầu mỏ toàn cầu vào thời điểm 3,6 tỷ tấn/năm Với mức độ gia tăng nhu cầu lượng tương đương với việc phát mỏ trữ lượng dầu mỏ tồn cầu đủ cho nhân loại vòng thập kỉ tới Hơn việc sử dụng xăng dầu làm nhiên liệu thải vào khơng khí lượng lớn khí nhà kính (thành phần CO2) khói bụi hữu Hậu làm nhiệt độ khơng khí trái đất tăng lên 0.6-0.8°C, mực nước biển dâng cao 15-20cm, ô nhiễm mơi trường Nếu khơng tâm hành động trái đất có nguy bị nóng lên thêm 2-3°C thiên tai, bão lũ, hạn hán bệnh tật hiểm nghèo xuất Chính lý cấp bách mà nhiều quốc gia giới kể nước có nguồn dầu khí lớn Mỹ, Brazin, Ấn Độ, Trung Quốc… tập đoàn lượng trọng nghiên cứu đưa vào ứng dụng loại nhiên liệu nhiên liệu sinh học để thay xăng dầu Một loại nhiên liệu sinh học đầu tư phát triển nhiên liệu cồn Tồn giới năm 2002 sản xuất gần 33 triệu cồn, 70% dùng làm nhiên liệu phân bổ Châu Mỹ 65%, Châu Á 19%, Châu Âu 3%, lục địa khác 13% Brazil nước tiên phong sử dụng cồn thay xăng cách gần 40 năm Ở Mỹ đến có 20 nhà máy sản xuất cồn với công suất khoảng 13 triệu Ấn Độ nước dẫn đầu Châu Á sử dụng cồn làm nhiên liệu, phủ Ấn Độ dự kiến đầu tư khoảng tỷ USD để xây dựng nhà máy sản xuất cồn nhiên liệu Trung Quốc sử dụng cồn thay xăng thành phố lớn (Trịnh Châu, Lạc Dương, Cáp Nhĩ Tân, Hắc Long Giang, Triều Đơng) với nhà máy có cơng suất từ 200.000 - 800.000 tấn/năm Ở Đông Nam Á Thái Lan, Inđônêxia, Malayxia phát triển công nghệ sản xuất cồn dùng thay xăng Thái Lan thành lập ủy ban Cồn Quốc gia để nghiên cứu phát triển dạng nhiên liệu sinh học này, thay cho dầu diesel Năm 1981, có Pilot để sản xuất thực nghiệm cồn (99,5%), đến năm 1985 thiết lập số trạm phân phối dạng nhiên liệu sinh học Gasohol (thay xăng) Diesohol (thay diesel) ngoại ô Băngcốc Năm 2004, nước sản xuất 280.000 m3 cồn, đầu tư thêm 20 nhà máy để năm 2015 có 2,5 triệu m3 cồn dùng làm nhiên liệu Ở Việt Nam cồn sản xuất hầu hết sử dụng cho ngành công nghiệp đồ uống hoá chất Một số nhà máy sản xuất cồn với công suất lớn là: Công ty Rượu Hà Nội có cơng suất thiết kế 10 triệu lít cồn/năm Cơng ty Rượu Bình Tây (thành phố Hồ Chí Minh) với cơng suất thiết kế 20 triệu lít cồn/năm Ngồi nước có 26 doanh nghiệp Nhà nước tư nhân sản xuất rượu cồn địa phương như: Công ty Cổ phần Rượu Đồng Xuân (Phú Thọ) với công suất thiết kế 0,6 triệu lít cồn/năm, nhà máy cồn Tam Hiệp (Hà Tây), nhà máy Đường - Giấy - Rượu Hưng Nhân (Thái Bình) v.v Sản lượng cồn vào năm 80 kỉ trước đạt 30 triệu lít/ năm Đến năm 2005 đạt khoảng 50 triệu lít/ năm Nhận thấy tầm quan trọng nguồn nhiên liệu sinh học an ninh lượng Quốc gia, ngày 09/3/2007 ngành dầu khí Việt nam ký kết hợp đồng hợp tác đầu tư xây dựng nhà máy sản xuất cồn từ sắn lát với Tập đoàn Itochu (Nhật Bản), khu đất 30 Khu Công Nghiệp Hiệp Phước Nhà máy có cơng suất 100.000 sản phẩm/năm với tổng mức đầu tư ban đầu khoảng 80-100 triệu USD Sản phẩm Cồn nhà máy pha chế với xăng thương phẩm theo tỷ lệ 10% cồn 90% xăng để tạo hỗn hợp nhiên liệu với tên gọi “Xăng E10” [1, 2, 19] 1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CỒN NHIÊN LIỆU Hai phương pháp để sản xuất cồn nhiên liệu phương pháp hydrat hố etylen dầu mỏ xúc tác axit phương pháp sinh học thông qua q trình lên men Trong đó, phương pháp sinh học phổ biến Nguyên tắc phương pháp sinh học hydrat cacbon nguyên liệu tinh bột cellulose phải thủy phân thành đường đơn, tiếp đến trình lên men đường thành rượu cuối trình chưng cất rượu thành cồn Tùy thuộc nguồn nguyên liệu sử dụng mà cơng đoạn thuỷ phân hydrat cacbon ban đầu có khác Có ba nguồn ngun liệu để sản xuất cồn nguyên liệu chứa đường (nước mía ép, rỉ đường mía, rỉ đường củ cải…), nguyên liệu chứa tinh bột (ngô, khoai, sắn…) nguyên liệu chứa cellulose (rơm, rạ, thân ngơ, bã mía …) [19] 1.2.1 Cơng nghệ sản xuất cồn từ đường Đường mía nguyên liệu giàu saccaroza Brazil nước dẫn đầu sản xuất cồn nhiên liệu từ đường mía Hiện nay, Brazil có 60.000 đồn điền trồng mía với 6,5 triệu nhà máy sản xuất đường, cồn [18, 19] Cơng nghệ sản xuất cồn từ mía đơn giản nhất, mía sau ép dịch tiếp men giống lên men Tuy nhiên, mía cơng nghiệp quan trọng ngun liệu công nghiệp sản xuất đường sản lượng hạn chế Ngồi nước ép mía, rỉ đường - phụ phẩm công nghệ sản xuất đường, nguồn nguyên liệu sử dụng phổ biến để sản xuất cồn Rỉ đường thường chiếm từ 3-5% so với lượng mía đưa vào sản xuất tỷ lệ phụ thuộc vào chất lượng mía cơng nghệ sản xuất Trước đưa vào lên men, mật rỉ phải xử lý axit để loại bỏ tạp chất, cặn can xi, chất phi đường giúp cho trình lên men chưng cất sau thuận lợi Theo số liệu Tổng cơng ty mía đường Việt Nam, đến năm 2000 có 40 nhà máy đường vào hoạt động với tổng công suất khoảng 12 triệu mía Nếu tỷ lệ mật rỉ chiếm 3% nhà máy thải 420.000 Từ mật rỉ thu 300 lít cồn 100% (v/v) [3 ] 1.2.2 Công nghệ sản xuất cồn từ tinh bột - Thủy phân tinh bột: Nguyên liệu chứa tinh bột như: Ngô, khoai, sắn, gạo tấm, phải chuyển hoá thành đường lên men (glucose) nhờ hoạt động enzym λ amylaza β amylaza có sẵn hạt nảy mầm, tổng hợp từ vi sinh vật dạng enzym thương phẩm - Lên men: Tiếp đến trình lên men nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae với phản ứng hóa học tổng quát sau: C6H12O6 → CH3CH2OH + 2CO2 + Q Thông thường nấm men tích lũy khoảng 4-8% rượu dịch lên men, nồng độ rượu sản phẩm cuối tăng lên nhờ q trình chưng cất - Chưng cất: Hiện nay, Việt nam công nghệ chưng cất cồn hoàn thiện với độ cồn lên tới 99% Việc tinh chế cồn 96% thành cồn tuyệt đối sử dụng rây phân tử nhiều nơi quan tâm nghiên cứu chuẩn bị đưa ứng dụng Có thể nói cơng nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường mía từ tinh bột hoàn thiện, nguồn nguyên liệu tinh bột đường mía sản phẩm nơng nghiệp quan trọng với số lượng hạn chế, nguồn ngun liệu cellulose từ phế phụ phẩm nơng nghiệp dồi chưa sử dụng Vì vậy, việc nghiên cứu, hồn thiện cơng nghệ sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu cellulose có ý nghĩa thời điểm tương lai [3] 1.2.3 Công nghệ sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa cellulose Trong số nguồn nguyên liệu sinh học sử dụng cho sản xuất ethanol, nguyên liệu cellulose thực dồi khai thác Sản lượng sinh khối thực vật toàn cầu hàng năm vào khoảng 200 tỷ tấn, 90% số lignocellulose Có khoảng 8-20 tỷ thực tế sử dụng để sản xuất ethanol Sinh khối thực vật giàu lignocellulose nguyên liệu phức tạp nhiều so với tinh bột Thành phần chủ chốt chúng bao gồm cellulose, hemicellulose lignin gắn kết chặt chẽ với liên kết hydro liên kết đồng hóa trị Để sản xuất ethanol, polymer sinh học cần phân huỷ thành đường đơn sau hỗn hợp đường hexose (chủ yếu glucose) pentose (chủ yếu xylose) lên men thành ethanol Việc thủy phân lignocellulose theo đường hóa học enzyme khơng đơn giản Ngồi ra, q trình thủy phân sử dụng axit (một công đoạn thiếu cơng nghệ có) cịn phân hủy lượng đáng kể đường tạo thành (tới 60% tùy theo chế độ thủy phân) sản sinh chất độc hại furfuran vi sinh vật công đoạn lên men Bản thân việc lên men đường xylose (chiếm 20-30% lượng đường tạo ra) thành ethanol gặp nhiều khó khăn có chủng vi sinh vật có khả thực cơng đoạn cách hiệu Công đoạn chủ chốt sản xuất cồn nhiên liệu từ biomass thủy phân nguyên liệu thành đường Hiện có hai hướng thủy phân thủy phân axit thủy phân enzym Công nghệ thủy phân axit có từ trước Đại chiến Thế giới lần thứ II không nghiên cứu nhiều cơng nghệ khơng có tính kinh tế cao Có hai dạng cơng nghệ thủy phân axit thủy phân axit đặc thủy phân axit loãng Trong năm gần đây, với nhiều thành tựu công nghệ sinh học, việc sản xuất enzym thương phẩm có bước tiến mạnh Các sản phẩm enzym đa dạng chủng loại với hoạt tính enzym 54 OD 450nm 2.5 y = 50.955x + 0.064 R2 = 0.993 1.5 0.5 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Nồng độ ethanol (% ) y = 60.598x + 0.2521 R2 = 0.9791 OD 450nm 2.5 1.5 0.5 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.04 0.05 Nồng độ ethanol (%) 3.5 OD 450nm y = 65.917x + 0.4453 R2 = 0.9244 2.5 1.5 0.5 0 0.01 0.02 0.03 Nồng độ ethanol (%) Hình 3.3.3.2 a,b,c: Đồ thị biểu diễn thời gian phản ứng khác 55 Thời gian phản ứng khác từ 15 phút (hình a), 30 phút (hình b), 45 phút (hình c) thể qua đồ thị Từ cho thấy thời gian phản ứng tăng độ tuyến tính giảm hệ số R2 giảm dần Vì chúng tơi chon thời gian phản ứng từ 15 đến 20 phút Sau xác định nồng độ ethanol thời gian phản ứng thích hợp cho phản ứng, chúng tơi đến kết luận: nồng độ ethanol phù hợp để xây dựng đường chuẩn dùng định lượng ethanol phương pháp enzyme trường hợp nhỏ 0.05% với thời gian phản ứng 20 phút Số liệu xử lý phần mềm Magellan, đồ thị vẽ phần mềm Sigmaplot Độ tương quan tuyến tính đồ thị chuẩn thu 0,9878 3.5 y = 57.565x + 0.3824 R2 = 0.9878 OD 450nm 2.5 1.5 0.5 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 Nồng độ cồn (%) Hình 3.3.3.3 Đường chuẩn rthanol Do đặc thù phản ứng enzyme nhạy cảm với điều kiện phản ứng nhiệt độ, thời gian Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng lượng sản phẩm tạo thành Nếu tiến hành xây dựng đường chuẩn lần dùng cho lần định lượng sau bị sai số điều kiện phản ứng khác mang lại Do đó, để đảm bảo độ xác, đường chuẩn cần dựng lần định lượng ethanol riêng biệt điều kiện phản ứng với mẫu định lượng 56 3.4 PHÂN NHÓM BẰNG KỸ THUẬT FINGERPRINTING Trong số chủng phân lập có 30 chủng có khả chuyển hố xylose thành ethanol Với mục đích có nhìn tổng qt lồi có khả tạo thành ethanol, tiến hành phân loại chủng phương pháp sinh học phân tử Do khơng có điều kiện để đọc trình tự tồn 30 chủng nên chúng tơi tiến hành phân nhóm chủng kỹ thuật fingerprinting sử dụng mồi MTS2 (có trình tự 5’-(GAC)5-3’) sau nhóm lựa chọn đại diện để đọc trình tự Các chủng nuôi cấy môi trường malt-glucose 2°Bx, sau ngày chủng thu nhận để tách ADN mô tả phần phương pháp Phản ứng PCR tiến hành với thành phần phản ứng mô tả phần phương pháp Chu trình nhiệt thiết lập là: biến tính ban đầu 94°C phút, 36 chu kỳ lặp lại với bước biến tính 94°C phút, gắn mồi 52°C phút, pha kéo dài 72°C phút Sau phản ứng diễn ra, sản phẩm điện di gel agaroza 1% với hiệu điện 100V Kết trình bày hình sau 57 Hình 3.4 Phổ fingerprinting sử dụng mồi MTS2 15 chủng nấm men có khả chuyển hóa xylose thành ethanol Theo nghiên cứu cơng bố kinh nghiệm phịng thí nghiệm chủng có phổ sản phẩm PCR nhân với mồi MTS2 có tên lồi giống 58 phân loại phương pháp đọc trình tự ARN ribosome 26S Việc phân thành nhóm kỹ thuật fingerprinting giúp tránh đọc trình tự trùng lặp, giảm chi phí Từ nhóm thu được, chủng đại diện lựa chọn để định tên phương pháp đọc trình tự ARN ribosome 26S 3.5 ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỌC TRÌNH TỰ VÙNG D1/D2 CỦA ARN RIBOSOM 26S Các chủng đại diện cho 24 nhóm chúng tơi tiến hành đọc trình tự vùng D1/D2 (tương đương với trình tự nucleotide 63 - 642 Saccharomyces cerevisiae) từ đầu 5’ gen LSU rRNA Trình tự nhân lên cặp mồi GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) NL-4 NL-1 (5’- (5’-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3’) Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR thiết kế sau: biến tính ban đầu 94°C phút, 36 vòng bao gồm biến tính 94°C phút, gắn mồi 52°C phút, pha kéo dài 72°C phút Sau tiến hành phản ứng PCR sản phẩm kiểm tra cách điện di gel agarose 1% nhuộm ethidium bromide Kết trình bày hình 3.5.1 59 Hình 3.5.1 Sản phẩm PCR chủng nấm men nhân với cặp mồi NL-1 NL-4 Từ kết thu hình 11 cho thấy sản phẩm PCR 24 chủng nhân với cặp mồi NL-1 NL-4 hoàn toàn đặc hiệu đạt tiêu chuẩn để dùng cho đọc trình tự Để tinh sản phẩm PCR dùng cho giải trình tự, tồn sản phẩm PCR diện di gel agarose 1% sau nhuộm, rửa, soi máy soi gel cắt băng tương ứng vào ống eppendorf ADN dùng cho giải trình tự tinh kit QIAEX II trình bày phần phương pháp Sau tinh chế ADN kiểm tra điện sau tiến hành đọc trình tự Tên lồi xác định cách so sánh trình tự thu với trình tự cơng bố ngân hàng gen thơng 60 qua trình tìm kiếm blast Dưới kết trình tự phần gen ARN ribosom 26S số chủng nấm men đại diện 61 KẾT LUẬN Sau q trình nghiên cứu chúng tơi thu kết sau:  Đã tuyển chọn 30 chủng nấm men có khả chuyển hóa xylose thành ethanol  Đã tiến hành phân nhóm chủng có khả chuyển hóa xylose thành xylitol theo đặc điểm hình thái, kỹ thuật fingerpriting định tên chủng đại diện cho nhóm phương pháp đọc trình tự vùng D1/D2 ARN ribosome 26S  Đã xây dựng phương pháp định lượng ethanol với giá thành thấp có khả ứng dụng rộng rãi Đã tinh chế enzyme AOX HRP để thay cho enzyme thương phẩm 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Định (2003), Bio-Fuel : Cồn, nguồn nhiên liệu tương lai Khoa học công nghệ số 1-2/2003, trang 78 Vũ Nguyên Thành (2006) Thuyết minh đề tài nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ : Nghiên cứu công nghệ hệ thống thiết bị sản xuất cồn nhiên liệu từ phế phụ phẩm nông nghiệp (biomass).Viện Công nghiệp Thực phẩm Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng (2005), Cơng nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylic Nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Duy Hạng, Lê Xuân Thám (2000), Tăng cường chất lượng bã mía làm thức ăn gia súc phương pháp lên men sinh học Phòng sinh học viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh (2004), Công nghệ enzym Nhà xuất khoa học kĩ thuật Nguyễn Văn Ri (2004), Chuyên đề phương pháp tách chất Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Lê Ngọc Tú (2000), Hố sinh cơng nghiệp, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần thị Luyến (1998), Công nghệ enzym Nhà xuất nơng nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh Lê văn Nhương, Nguyễn Chúc, Nguyễn Đức Lượng, Nghiên cứu thu nhận ứng dụng enzym vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật 10 Võ Hồng Nhân, Trần Tuấn Đức, Thuỷ phân vỏ chuối enzym cellulase, Tạp chí khoa học cơng nghệ 1993 63 11 Đặng Văn Lợi, Lê Văn Hoàng (1999), Tối ưu hố q trình sinh tổng hợp enzym amylase cellulase A niger, Nông nghiệp Công nghiệp Thực phẩm 12 Hà Vân Linh, Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Khảo sát hoạt tính hệ enzym thủy phân chiết tách từ môi trường nuôi cấy Trichoderma sp thử ứng dụng chế biến phân hữu vi sinh, Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ ĐHQG TP.HCM, tập 6, tháng 02/2003 Tiếng Anh 13 Affleck R P (2000), Recovery of Xylitol from Fermentation of Model Hemicellulose Hydrolysates Using Membrane Technology, Blacksburg Virginia 14 Aranda-Barradas J S., Delia M L., Riba J P (2002), “Kinetic study and modelling of the xylitol production using Candida parapsilosis in oxygenlimited culture conditions”, Bioprocess Engineering, 22, pp 219-225 15 Badger P.C (2002), Ethanol from cellulose : A general review - Trends in new crops and new uses, ASHS Press- Alexandria 16 Gurgel P V., Mancilha I M., Pecanha R P and Siqueria J F M (1995), “Xylitol recovery from fermented sugarcane bagasse hydrolyzate”, Bioresource Technology, 52, pp 219-223 17 Heikkila H., Puuppo O., Tylli M., Nikander H., Nygren J., Lindroos M., Eroma O (1999), “Method for Producing Xylitol”, U.S patent 5,998,607 18 Horitsu H., Yahashi Y., Takamizawa K., Kawai K., Suzuki T., Watanabe N (1992), “Production of Xylitol from D-Xylose by Candida tropicalis: Optimization of Production Rate”, Biotechnology and Bioengineering, 40, pp 1085-1091 19 Johansson B., Christensson C., Hobley T., Hahn-hagerdal B (2001) “Xylulokinase overexpression in two strains of Sachharomyces cerevisiae also expressing xylose reductase and xylitol dehydrogenase and its effect 64 on fermentation of xylose and lignocellulosic hydrolysate”, Applied and Environmental Microbiology, pp 4248-4255 20 Saha B C (2003), “Hemicellulose bioconversion” Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 30, pp 279 - 291 21 Taherzadeh M J (1999), Ethanol from Lignocellulose: Physiological Effects of Inhibitors and Fermentation Strategies, Göteborg - Sweden 22 Demain AL, Newcomb M, Wu JH Cellulase, clostridia, and ethanol Microbiol Mol Biol Rev 2005; 69(1):124-154 23 Farrell AE, Plevin RJ, Turner BT, Jones AD, O'Hare M, Kammen DM Ethanol can contribute to energy and environmental goals Science 2006; 311(5760):506-508 24 Jones AM, Ingledew WM Fuel Alcohol Production: Optimization of Temperature for Efficient Very-High-Gravity Fermentation Appl Environ Microbiol 1994; 60(3):1048-1051 25 Krishnan MS, Blanco M, Shattuck CK, Nghiem NP, Davison BH Ethanol production from glucose and xylose by immobilized Zymomonas mobilis CP4(pZB5) Appl Biochem Biotechnol 2000; 84-86:525-541 26 Lee J Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol J Biotechnol 1997; 56(1):1-24 27 Lin Y, Tanaka S Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects Appl Microbiol Biotechnol 2006; 69(6):627-642 28 Neureiter M, Danner H, Thomasser C, Saidi B, Braun R Dilute-acid hydrolysis of sugarcane bagasse at varying conditions Appl Biochem Biotechnol 2002; 98-100:49-58 29 Saha BC, Bothast RJ Pretreatment and enzymatic saccharification of corn fiber Appl Biochem Biotechnol 1999; 76(2):65-77 65 30 Sedlak M, Ho NW Production of ethanol from cellulosic biomass hydrolysates using genetically engineered Saccharomyces yeast capable of cofermenting glucose and xylose Appl Biochem Biotechnol 2004; 113116:403-416 31 Sun Y, Cheng JJ Dilute acid pretreatment of rye straw and bermudagrass for ethanol production Bioresour Technol 2005; 96(14):1599-1606 66 TÓM TẮT LUẬN VĂN Vi sinh vật sử dụng trình thủy phân lignocellulose lựa chọn trực tiếp từ số chủng có sẵn sưu tập Viện Cơng nghiệp Thực phẩm Nhiều chủng sưu tập biết có lực sinh cellulase cao Phần lớn chủng sưu tập không sinh độc tố không ảnh hưởng tới môi trường sản xuất quy mô công nghiệp Song song với việc khảo sát chủng sưu tập, việc phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh cellulase từ thiên nhiên coi trọng Nấm men Saccharomyces cerevisiae sử dụng cho lên men glucose thành ethanol Cho tới chưa có loại vi sinh vật tốt nấm men Saccharomyces cerevisiae sản xuất ethanol từ glucose Tìm kiếm vi sinh vật có khả lên men lên men xylose thành ethanol việc khó khăn không với nhà khoa học nước mà cịn tồn cơng nghệ nói chung Trong Sưu tập giống Viện Công nghiệp Thực phẩm lưu giữ số chủng có khả Tuy nhiên mức độ tích lũy ethanol chưa khảo sát Cho nên tiến hành phân lập tuyển chọn chủng có khả nhiều mẫu phẩm khác Kết đạt tương đối khả quan : thu 30 chủng có khả lên men xylose thành cồn định tên cách đọc trình tự ADN Song song với việc tìm chủng giống chúng tơi cịn tiến hành xây dựng phương pháp xác định cồn kit ALCOTEST Kit có độ xác tương đối cao, dễ thực hiện, giá thành lại không rẻ nên tiến hành tinh chế enzyme để làm kit enzyme AOX HRP Sau kết mong muốn nghiên cứu tiếp chủng giống nấm men lên men xylose để nâng cao hiệu suất lên men cồn chất rác thải nông nghiệp 67 ... thành phần cấu tạo gần giống với thành phần cấu tạo thành tế bào, thêm vào thường thấy có thêm số chất khác cutin, suberin đặc biệt lignin- nhóm polyme alcohol thơm Lignin cứng, tạo độ bền đáng... xuất cồn Rỉ đường thường chiếm từ 3-5% so với lượng mía đưa vào sản xuất tỷ lệ phụ thuộc vào chất lượng mía cơng nghệ sản xuất Trước đưa vào lên men, mật rỉ phải xử lý axit để loại bỏ tạp chất,... cellulose có cấu tạo sợi, chuỗi cellulose có đường kính khoảng 3nm kết hợp với tạo thành vi sợi có đường kính 10 - 40 nm Các vi sợi lại liên kết với liên kết hydrro liên kết vanderwalls tạo thành bó