b. Phương pháp tách chiết enzyme horse-radish peroxidase (HRP)
3.4 PHÂN NHÓM BẰNG KỸ THUẬT FINGERPRINTING
Trong số các chủng phân lập được có 30 chủng có khả năng chuyển hoá xylose
thành ethanol. Với mục đích có một cái nhìn tổng quát về các loài có khả năng tạo
thành ethanol, chúng tôi đã tiến hành phân loại các chủng này bằng các phương pháp sinh học phân tử. Do không có điều kiện để đọc trình tự toàn bộ 30 chủng nên chúng tôi đã tiến hành phân nhóm các chủng này bằng kỹ thuật fingerprinting sử dụng mồi MTS2 (có trình tự 5’-(GAC)5-3’) sau đó mỗi nhóm lựa chọn một đại diện để đọc trình tự.
Các chủng được nuôi cấy trên môi trường malt-glucose 2°Bx, sau 2 ngày các chủng này được thu nhận để tách ADN như mô tả trong phần phương pháp. Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần phản ứng như mô tả trong phần phương pháp. Chu trình
nhiệt được thiết lập là: biến tính ban đầu ở 94°C trong 2 phút, kế tiếp là 36 chu kỳ lặp lại với các bước biến tính 94°C trong 1 phút, gắn mồi ở 52°C trong 1 phút, pha kéo dài
ở 72°C trong 2 phút. Sau khi phản ứng diễn ra, sản phẩm được điện di trên gel agaroza
1
Hình 3.4. Phổ fingerprinting sử dụng mồi MTS2 của 15 chủng nấm men có khả năng chuyển hóa xylose thành ethanol.
Theo như các nghiên cứu đã công bố và kinh nghiệm của phòng thí nghiệm thì các chủng có cùng một phổ sản phẩm PCR khi nhân với mồi MTS2 sẽ có tên loài giống
nhau khi phân loại bằng phương pháp đọc trình tự ARN ribosome 26S. Việc phân thành các nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting giúp tránh được đọc trình tự trùng lặp, giảm chi phí. Từ mỗi nhóm thu được, một chủng đại diện được lựa chọn để định tên bằng phương pháp đọc trình tự ARN ribosome 26S.