b. Phương pháp tách chiết enzyme horse-radish peroxidase (HRP)
3.3.2 Xây dựng công thức các chất tham gia kit “ALCOTEST”
Kit enzyme gồm ba thành phần:
+ TMB được pha loãng trong DMSO (dimethyl sulphoxide), stock 1 có nồng độ 100mg/ml, tiếp theo pha loãng TMB trong DMSO để làm stock 2 có nồng độ 10mg/ml, khi nào tiến hành phản ứng thì pha loãng stock 2 tới nồng độ 0.1mg/ml bằng beta cyclodextrin 0,25% (beta cyclodextrin 0,25% pha loang trong đệm photphate natri
50mM, pH 7.0).
+ AOX được pha loãng trong đệm photphate natri 50mM pH 7.0, stock 1 có
nồng độ 1000U/ml, stock 2 có nồng độ 100U/ml, khi nào dùng thì pha thành nồng độ
10U/ml.
+ HRP được pha loãng trong đệm photphate natri 50mM pH 7.0, stock 1 có
nồng độ 100mg/ml, stock 2 có nồng độ 10mg/ml, khi nào dùng thì pha loãng tới nồng độ 1mg/ml.
Để có một phản ứng xác định ethanol tương đối chính xác, chúng tôi phải tiến
hành lựa chọn nồng độ các chất TMB, AOX, HRP sao cho thích hợp nhất để tránh lãng phí và tốn kém.
Factor Stock Dilution Volume TMB 10 mg/ml 1/200 1/100 1/50 1/25 100 µl AOX 100 U/ml 1/40 1/20 1/10 1/5 2 µl HRP 10 mg/ml 1/40 1/20 1/10 1/5 2 µl Ethanol 50µl Bảng 3.3.2.1. Tìm nồng độ các chất tham gia phản ứng thích hợp
Kết quả thể hiện trong hình 3.3.2.2
Hình 3.3.2.2: Tỷ lệ các chất tham gia phản ứng trong kit “ALCOTEST”
Sau khi tiến hành các bước trên chúng tôi chọn được tỷ lệ các chất tham gia
phản ứng enzyme xác định nồng độ cồn bằng kit “ALCOTEST” :
Factor Stock Dilution Volume TMB 10 mg/ml 1/100 100 µl
AOX 100 U/ml 1/10 2 µl
HRP 10 mg/ml 1/10 2 µl
Ethanol 50µl
-Các bước tiến hành:
Mỗi giếng trên vi đĩa ta nhỏ 2µl AOX, 2µl HRP, 100µl chromogen và 50µl
ethanol, trộn đều và để phản ứng xảy ra trong 20 phút. Dừng phản ứng bằng 50µl HCl
0,8M, trộn đều. Đo cường độ màu ở bước sóng 450nm. Kết quả thu được dựa vào đường chuẩn (ethanol).
Ethanol concentration, % 0.1 0.04 0.02 0.01 0.005 0.0025 0.00125 0 TMB 1/200 0.3048 0.3078 0.3142 0.1989 0.1896 0.1819 0.1791 0.1793 TMB 1/100 0.3276 0.4769 0.4275 0.196 0.1903 0.1836 0.1798 0.1815 TMB 1/50 0.2312 0.4263 0.3371 0.1988 0.1933 0.1875 0.1843 0.1825 TMB 1/25 0.3037 0.4883 0.4274 0.1936 0.1937 0.1883 0.1814 0.1828 AOX 1/40 0.3156 0.4421 0.4036 0.1919 0.1822 0.178 0.1747 0.1786 AOX 1/20 0.3189 0.4461 0.4199 0.1913 0.1828 0.1804 0.1783 0.1762 AOX 1/10 0.3215 0.4636 0.4174 0.1905 0.1828 0.1845 0.1806 0.1802 AOX 1/5 0.3215 0.4465 0.4173 0.1967 0.1863 0.1765 0.1798 0.1815 HRP 1/40 0.2048 0.2438 0.2219 0.1724 0.1702 0.1675 0.1681 0.172 HRP 1/20 0.2398 0.3168 0.2806 0.1786 0.1817 0.1736 0.1764 0.1759 HRP 1/10 0.3248 0.4626 0.4227 0.1963 0.1936 0.1838 0.1817 0.1793 HRP 1/5 0.4374 0.5148 0.5438 0.2319 0.2157 0.2012 0.1939 0.1894
Bảng 3.3.2.3: Lựa chọn nồng độ các chất thích hợp cho phản ứng ALCOTEST