b. Phương pháp tách chiết enzyme horse-radish peroxidase (HRP)
2.2.12 Phương pháp đọc trình tự gen 26S rRNA (D1/D2)
Vùng bất bảo thủ D1/D2 (tương đương với trình tự nucleotide 63 - 642 của
Saccharomyces cerevisiae) từ đầu 5’ của gen LSU rRNA được nhân đối xứng sử dụng cặp mồi: NL-1 (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) và NL-4 (5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’). Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR được thiết kế như sau: biến tính ban đầu ở 94°C trong 2 phút, kế tiếp là 36 vòng lặp biến tính
94°C trong 1 phút, gắn mồiở 52°C trong 1 phút, pha kéo dài ở 72°C trong 2 phút. Sau
36 chu trình nhiệt các ống phản ứng được giữ tiếp ở 72°C trong 10 phút để hoàn tất phản ứng cho các phân tử có độ dài thiếu hụt. Sau cùng nhiệt độ được giảm tới 4°C
cho tới lúc lấy mẫu ra. Sau phản ứng PCR 5µl mẫu được trộn với 1 µl loading dye nạp lên 1 % agaroza gel trong 0.5 x TBE. Điện di được thực hiện ở chế độ 100V cho tới khi băng mầu chuẩn dẫn đầu (Bromophenol Blue) đạt 2/3 gel. Gel được nhuộm trong môi trường đệm 0.5 x TBE chứa 0.5 µg/ml Ethidium Bromide trong vòng 10 phút. Sau
khi nhuộm gel được vớt ra và rửa qua bằng nước sau đó hiển thị dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 302 nm (tương đương chế độ “High” trên VWR Scientific Benchtop Ultraviolet Transilluminator). Ảnh được lưu lại bằng máy ảnh Polaroid Gelcam hoặc máy ảnh số Fujifilm FinePix 1300 (dùng filter mầu da cam). Sản phẩm PCR được làm sạch bằng QIAEX II như được trình bày trong phần 2.2.10. Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination”. Sau khi đọc, trình tự được so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST và xác định tên loài của chủng tương ứng.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP NẤM MEN TỪ MẪU ĐẤT VÀ RÁC THẢI
Với mục đích phân lập các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa xylose thành ethanol để ứng dụng trong sản xuất ethanol từ phế thải nông nghiệp nên chúng tôi đã tiến hành phân lập các chủng nấm men trên môi trường sử dụng cơ chất là xylose. Sau đó các chủng nấm men sẽ được chọn lọc để tìm ra chủng có khả năng chuyển hóa xylose thành ethanol. Chúng tôi tiến hành phân lập trên nhiều loại mẫu, từ nhiều nguồn mẫu khác nhau chẳng hạn như lá câyrụng, mục nát trong vườn, đất mùn,
rác thải từ nhà máy giấy, rác sinh hoạt, rơm rạ…
Các mẫu đất bao gồm đất cống rãnh, đất ruộng, đất vườn, đất bồn hoa, vườn thực vật… Ngoài ra, một số mẫu rơm rạ để lâu, thối mục cũng được sử dụng để phân lập nấm men.
Môi trường dùng trong phân lập có thành phần bao gồm: các nguyên tố khoáng, vi lượng, cao nấm men 5 g/lít, xylose 20 g/lít, agar 20 g/lít. Với mục đích là phân lập các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa xylose thành ethanol dùng trong sản xuất
ethanol từ phế thải nông nghiệp nên chủng tôi chọn xylose làm cơ chất trong môi trường phan lập.
Quá trình phân lập được tiến hành như mô tả trong phần phương pháp. Sau khi phân lập, những khuẩn lạc mọc to, đại điện được quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học. Các khuẩn lạc nấm men đại diện được lựa chọn và tiến hành làm sạch sau đó giữ trong ống nghiệm với thành phần môi trường giống như môi trường phân lập. Việc chọn các khuẩn lạc to giúp tăng khả năng lấy được các chủng nấm men có khả năng đồng hóa xylose. Những khuẩn lạc nhỏ được loại bởi vì đó có thể là các khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật có không có khả năng sử dụng nguồn xylose. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Nguồn gốc của các chủng nấm men lên men xylose phân lập được
STT Tên mẫu Chủng nấm men phân lập được
1 Nhà máy giấy Tân Tiến,
Yên Phong, Bắc Ninh XFE 1, XFE 34, XFE 89
14 Bãi rác Yên Phong, Bắc
Ninh
XFE 100, XFE 121, XFE 299,
20 Nước thải xưởng sản xuất
giấy dó XFE 235
34 Làng Kim Liên, Nghệ An XFE 250, XFE 301
35 Vườn thú Hà Nội XFE 464, XFE 464-2, XFE
483 44 Bèo thối sông Thiên Đức,
Yên Viên, Gia Lâm, Hà Nội XFE 523-2, XFE 495
46 Rác sinh hoạt, Thanh Xuân,
Hà Nội XFE 580, XFE 743, XFE, 856, XFE 877, XFE 989 48 Phân sâu cây thông XFE 932
49 Rơm rạ thối xã Yên Thường,
Gia Lâm, Hà nội XFE 977, XFE 988, XFE 989, XFE 1001 50 Rác thải chợ Long Biên, Hà
Nội XFE 1005, XFE 1009, XFE 1011
51 Phân sâu gỗ lát XFE 1015
52 Phân sâu XFE 1017
Tất cả các chủng nấm men chúng tôi phân lập được là 1020 chủng. Những chủng này được làm sạch trên môi trường thạch 2% xylose, sau đó cấy truyền vào ống eppendop có chứa môi trường thạch 2% xylose để giữ giống. Những chủng nấm men đã phân lập trên được nhân giống trong môi trường lỏng 2% xylose trong 24 giờ, nhiệt độ 280C. Sau đó lên men trên môi trường 10% xylose trong 10 ngày, nhiệt độ 280C.
Kết thúc quá trình lên men, ly tâm 10000 vòng/phút để loại bỏ xác tế bào nấm men.
Lấy dịch lên men để phân tích định tính xem chủng nào sinh cồn bằng phương pháp enzyme đã nêu trên.
Tiến hành phân tích: 2µl enzyme AOX + 2µl enzyme HRP + 100µl TMB + 50µl mẫu, sau 20 phút phản ứng. Phản ứng được thực hiện trên vi đĩa. Kết thúc phản ứng, quan sát thấy giếng nào có màu xanh nhạt nghĩa là chủng đấy có sinh cồn. Giữ lại 30 chủng nấm men trên để tiến hành nghiên cứu tiếp.