b. Phương pháp tách chiết enzyme horse-radish peroxidase (HRP)
ARN RIBOSOM 26S
Các chủng đại diện cho 24 nhóm được chúng tôi tiến hành đọc trình tự vùng D1/D2 (tương đương với trình tự nucleotide 63 - 642 của Saccharomyces cerevisiae) từ đầu 5’ của gen LSU rRNA. Trình tự được nhân lên bằng cặp mồi NL-1 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) và NL-4 (5’-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3’). Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR được thiết kế như sau:
biến tính ban đầu ở 94°C trong 2 phút, kế tiếp là 36 vòng bao gồm biến tính 94°C trong 1 phút, gắn mồi ở 52°C trong 1 phút, pha kéo dài ở 72°C trong 2 phút. Sau khi tiến hành phản ứng PCR sản phẩm được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% và nhuộm bằng ethidium bromide. Kết quả được trình bày trong hình 3.5.1.
Hình 3.5.1. Sản phẩm PCR của các chủng nấm men được nhân với cặp mồi NL-1 và NL-4.
Từ kết quả thu được ở hình 11 cho thấy sảnphẩm PCR của 24 chủng được nhân với cặp mồi NL-1 và NL-4 là hoàn toàn đặc hiệu và đạt tiêu chuẩn để dùng cho đọc trình tự.
Để tinh sạch sản phẩm PCR dùng cho giải trình tự, toàn bộ sản phẩm PCR được diện di trên gel agarose 1% sau đó nhuộm, rửa, soi trên máy soi gel và cắt các băng tương ứng vào các ống eppendorf sạch. ADN dùng cho giải trình tự được tinh sạch bằng kit QIAEX II như được trình bày trong phần phương pháp. Sau khi tinh chế ADN được kiểm tra bằng điện sau đó tiến hành đọc trình tự. Tên loài được xác định bằng cách so sánh trình tự thu được với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thông
qua trình tìm kiếm blast. Dưới đây là kết quả trình tự một phần gen ARN ribosom 26S của một số chủng nấm men đại diện.
KẾT LUẬN
Sau quá trình nghiên cứu chúng tôi đã thu được các kết quả sau:
Đã tuyển chọn được 30 chủng nấm men có khả năng chuyển hóa xylose thành
ethanol.
Đã tiến hành phân nhóm các chủng có khả năng chuyển hóa xylose thành xylitol theo đặc điểm hình thái, kỹ thuật fingerpriting và định tên các chủng đại diện cho mỗi nhóm bằng phương pháp đọc trình tự vùng D1/D2 của ARN ribosome 26S. Đã xây dựng được phương pháp định lượng ethanol với giá thành thấp và có khả
năng ứng dụng rộng rãi. Đã tinh chế được enzyme AOX và HRP để thay thế cho