b. Phương pháp tách chiết enzyme horse-radish peroxidase (HRP)
3.3.1 Tách chiết và xác định hoạt tính của enzyme trong kit “ALCOTEST”
* Tinh chế enzyme AOX:
Chủng nấm men dại Pichia pastoris được nuôi trên môi trường có 1,34% YNB và 1% glycerol ở nhiệt độ 280C, lắc 250 vòng/phút. Sau 16h ly tâm thu lấy tế bào. Lượng tế bào sẽ được nuôi trong môi trường 1,34% YNB và 0,5% methanol ở nhiệt độ
280C, lắc 250 vòng/ phút. Sau mỗi 6 giờ lấy mẫu 1 lần, ly tâm thu lấy tế bào. Sau 96
0.25-0.5mm, votex đến khi tế bào vỡ hoàn toàn. Ly tâm thu lấy enzyme thô. Điện di xác định protein của các lần lấy mẫu để xác định thời điểm biểu hiện enzyme cực đại. Kết quả thể hiện qua hình sau:
Hình 3.3.1.1: AOX biểu hiện ở các thời gian nuôi cấy khác nhau: lan1-marker, lan 2- 0h, lan 3- 6h, lan 4- 12h, lan 5- 18h, lan 6-24h, lan 7 – 30h, lan 8- 36h, lan 9- 42h, lan 10- 48h, lan 11- 54h, lan 12 – 60h, lan 13- 66h, lan 14 – 72h, lan 15 – 78h, lan 16 – 84h, lan 17 – 90h, lan 18 – 96h, lan 19 – AOX chuẩn.
Qua kết quả điện di trên, chúng tôi chọn nuôi cấy nấm men sinh AOX trong vòng 24h trên môi trường MM. Tế bào nuôi cấy được phá vỡ bằng phương phápđã nêu
trên. Enzyme AOX sẽ được tinh chế bằng máy AKTA prime, trước tiên enzyme thô được chạy qua cột DEAE, kết quả thể hiện qua hình sau.
Hình 3.3.1.2: Tinh sạch enzyme AOX qua cột DEAE
Lấy mẫu từ các pick trên xác định định tính xem pick nào là pick của enzyme AOX, chúng tôi xác định được pick cuối cùng là pick của enzyme AOX. Từ kết quả này ta lấy mẫu từ các fraction 93 đến 107 để chạy điện di SDS-PAGE. Kết quả thể hiện
qua hình sau
Hình 3.3.1.3: Kết quả điện di AOX từ Pichia pastoris : lan1-marker, lan 2- crude extract, lan 3- fraction 93, lan 4- fraction 94, lan 5- fraction 95, lan 6- fraction 96, lan 7- fraction 97, lan 8- fraction 98, lan 9- fraction 99, lan 10- fraction 100, lan 11- fraction 101, lan 12- fraction 102, lan 13- fraction 103, lan 14- fraction 104, lan 15- fraction 105, lan 16- fraction 106, lan 17- fraction 107, lan 18- AOX chuẩn.
Từ kết quả trên, thu tất cả enzyme trong các fraction từ 96 đến 106 để chạy tiếp cột lọc gel Superdex 200, kết quả thu được thể hiện qua hình
…..
Hình 3.3.1.4: Tinh sạch enzyme AOX qua cột loc gel Superdex 200
Từ các kết quả trên, chúng tôi tiến hành chạy điện di SDS-PAGE để so sánh kết quả của quá trình tinh chế enzyme AOX.
1 2
Hình 3.3.1.5: Kết quả điện di SDS-PAGE của hình 5-1: lan 1- marker, lan2-fraction 30, lan 3-fraction 32, lan 4- fraction 33, lan 5-fraction 34, lan 6- fraction 35, lan 7- fraction 36, lan 8- fraction 37. Kết quả điện di SDS-PAGE của hình 5-2: lan 1- marker,
lan 2, 3-crude extract, lan - AOX sau khi tinh chế bằng cột DEAE, lan 5- AOX sau lọc gel qua cột Superdex 200, lan 6- AOX chuẩn.
*Tinh chế enzyme HRP
Củ cải được nghiền nhỏ và chiết bằng đệm Tris-HCl 20mM, pH 7.5. Kết tủa protein bằng (NH4)2SO4 80%. Protein thô thu được sẽ được chạy qua cột lọc gel Sephadex G50 để loại muối (NH4)2SO4. Sau đó mẫu được chạy tiếp qua cột DEAE, kết quả thể hiện ở hình sau.
Hình 3.3.1.6: HRP thô được chạy qua cột DEAE
Mẫu trong các fraction từ 72 đến 88 sẽ được chạy điện di SDS-PAGE, kết quả thể hiện ở hình …..
Hình 3.3.1.7: lan 1- marker, lan 2 đến lan 18 – fraction 72 đến fraction 88, lan 19-
HRP chuẩn.
Thu mẫu trong các fraction từ 72 đến 82 để chạy qua cột lọc gel Superdex 200, kết quả thể hiện qua hình sau.
Hình 3.3.1.8: HRP được chạy qua cột lọc gel Superdex 200.
Hình 3.3.1.9: Lan 1-marker, lan 2- dịch chiết củ cải, lan 3-HRP thô sau khi chay qua
cột lọc gel Sephadex G50, lan 4, 5-HRP sau khi chạy qua cột DEAE, lan 6- HRP sau
khi chạy qua cột lọc gel Superdex 200, lan 7- HRP chuẩn.