1 GIÁO TRÌNH THỰC TẬP CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ ĐỊNH LƯỢNG Phần 1 Các phương pháp định lượng bằng công cụ Buổi 4 Các phương pháp phân tích sắc ký Bài 8 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP HPLC) Bài 9 Phương pháp sắc ký khí – detector bắt giữ điện tử (GC ECD) (Các bài thực tập trong phần này được trích từ giáo trình “Thực tập phân tích công cụ”) Bài 8 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP HPLC) Xác định Rhodamin B trong sơn móng tay 8 1 Mục đích thí nghiệm Rh.
GIÁO TRÌNH THỰC TẬP CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ ĐỊNH LƯỢNG Phần 1: Các phương pháp định lượng công cụ Buổi 4: Các phương pháp phân tích sắc ký Bài 8: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC) Bài 9: Phương pháp sắc ký khí – detector bắt giữ điện tử (GC-ECD) (Các thực tập phần trích từ giáo trình “Thực tập phân tích cơng cụ”) Bài 8: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP-HPLC) Xác định Rhodamin B sơn móng tay 8.1 Mục đích thí nghiệm Rhodamin B (cơng thức cấu tạo Hình 8.1) phẩm màu cơng nghiệp có màu đỏ, phát huỳnh quang, sử dụng rộng rãi làm thuốc nhuộm nhiều ngành sản xuất giấy, sơn, dệt, da sứ,… Rhodamin B bị cấm sử dụng làm phụ gia thực phẩm thêm vào mỹ phẩm gây cấp mạn tính, gây dị ứng, mẩn ngứa da, gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực, có hại cho gan thận, tích tụ dần thể gây ung thư dị tật bẩm sinh người, … Nhưng có màu đỏ bắt mắt mà Rhodamin B mà thường trộn trái phép vào thực phẩm như tương ớt, hạt dưa … , làm chất tạo màu son mơi, phấn trang điểm, sơn móng tay để thành màu sắc quyến rũ Thành phần dịch sơn móng (phổ biến so với loại bột) gồm Nitrocellulose (tạo lớp phim bao phủ), số loại resin thông dụng alkyl resin, sucrose resin, sulfonamid resin acrylic resin….; cá loại nhựa dẻo ester, acid citric acetyltributyl, dung môi dùng để pha chế, sắc tố màu phẩm màu nhuộm (Rhodamine B), màu hữu (Lithol Rubin BCA) màu vô (Titan dioxyd) sử dụng để tạo thành màu sắc quyến rũ sơn lên móng Trong thực tập này, hàm lượng Rhodamin B sơn móng tay bán trên thị trường xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC) Hình 8.1 Cơng thức cấu tạo Rhodamin B 8.2 Cơ sở lý thuyết phương pháp phân tích 8.2.1 Nguyên tắc chung phương pháp RP-HPLC Pha tĩnh sản phẩm liên kết nhóm closilan hữu mà mạch hydrocacbon chứa 18 nguyên tử cacbon nhóm silanol bề mặt silic Phản ứng gọi phản ứng silan hoá sau: Phản ứng điều chế pha tĩnh hoàn toàn tương tự phân điều chế pha tĩnh pha liên kết pha thường (thuỷ phân axit, chưng hạt silic 90oC axit HCl 0,1N 18-24 Sấy 200oC chân không Khi phản ứng dùng lượng dư thuốc thử, gấp đôi, tiến hành phản ứng môi trường bazơ, thí dụ piridine để hấp thụ axit giải phóng trình phản ứng Bề mặt silic sau ete hóa trở nên kỵ nước, nhóm chức hidrocacbon bề mặt làm thay đổi tính chất Khi mạch cacbon dài, lớp phủ dày, tính kỵ nước cao Chỉ có khoảng 50% -60% nhóm silanol bề mặt silic ete hố Các nhóm silanol cịn lại mang tính chất phân cực, ngun nhân pic khơng cân đối Vì vậy, đơi khi, người ta silan hố tiếp nhóm silanol lại hợp chất trimetylsilan Cl-Si(CH3)3 Mạch hydrrocacbon cồng kềnh, tính khơng phân cực cao, khả hấp phụ lớn, phân tử closilan hữu tương tác với hình thành mạch hidrocacbon mạch dài hơn, che phủ bề mặt tốt hơn, phân cực Qua thực nghiệm chứng tỏ cột chứa silan hữu có 18 cacbon bền dùng nhiều Cột cịn gọi cột ODS viết tắt từ octadesilsilan Pha động RP-HPLC dung môi phân cực, thường dùng nước dung dịch đệm pha trộn với dung môi it phân cực nước methanol, acetonitril…với tỷ lệ khác Hai tính chất pha động cần phải quan tâm trình tìm điều kiện tách độ phân cực pH Sự lựa chọn pha động tuân theo nguyên tắc chung độ phân cực phù hợp cho chất phân tích tan pha động đảm bảo hệ số lưu k’ có giá trị khoảng Khi thay đổi thành phần pha động, thí dụ tăng giảm tỷ lệ dung mơi phân cực nước, tính khơng phân cực pha động tăng giảm theo Kết chất phân tích di chuyển nhanh hay chậm cột Một nguyên tắc hòa tan chất chất tương tự tan vào Thí dụ pha động có hai thành phần MeOH nước mà chất phân tích chloramphenicol-CP tan MeOH tốt so với nước Như vậy, tăng tỷ lệ MeOH, CP tan pha động tốt hơn, thời gian lưu giảm Yếu tố thứ hai pha động pH Thay đổi pH pha động tác động đến cân axit-bazơ chất phân tích Tùy thuộc vào pK axit-bazơ chất tan, thay đổi pH pha động dẫn tới thay đổi trạng thái chất tan sang ion hay phân tử khơng mang điện tích (điểm đẳng điện- pI) Kết chất tan tăng giảm thời gian lưu, phân tử chất tan trạng thái khơng mang điện tích hấp thu vào pha tĩnh ODS tốt Nguyên tắc tách chất sắc ký lỏng pha đảo, tùy thuộc vào mức độ phân cực chất phân tích, chúng bị lưu giữ pha tĩnh với mức độ khác nhau, có thời gian lưu khác tách khỏi Do pha tĩnh mang tính phân cực, pha động phân cực nên chất phân tích mang tính phân cực, thời gian lưu lớn chúng liên kết tốt với pha tĩnh Ngược lại, chất mang tính phân cực, chúng có thời gian lưu ngắn tan tốt pha động Khi thiết lập điều kiện tách, người phân tích ln tím cách tăng cường khác biệt tính chất phân cực chất cho chúng có thời gian lưu đủ khác xa hay tách khỏi 8.2.2 Thiết bị HPLC a) Sơ đồ chức thiết bị HPLC Hình 8.2 Sơ đồ chức thiết bị HPLC Phần cấp dung dịch Khối chức loại khí, chia dịng Bơm cao áp Cổng tiêm mẫu Cột tách Detector Phần mềm xử lý số liệu Thiết bị ghi b) Van bơm mẫu Van bơm mẫu có cổng, gắn với vịng mẫu dung tích 20l Khi van vị trí load, mẫu nạp vào vòng mẫu qua kim tiêm (syring) qua bơm mẫu tự động, mẫu thừa thải qua cổng (hình 8.3) Lúc này, dung mơi bơm cao áp đẩy trực tiếp vào đầu cột qua cổng sang Hình 8.3 Van bơm mẫu vị trí load inject Khi bơm mẫu vào đầu cột, xoay tay van 60o để đặt van vị trí ịnject, lúc bơm đẩy dung mơi qua vịng mẫu, mang theo mẫu vào đầu cột Tuỳ theo hàm lượng mẫu mà ta lắp vòng mẫu có dung tích khác 8.3 Ngun tắc phép phân tích Rhodamine B (M= 479,01 g/mol) tan tốt nước, độ tan 50 g/l), pKa= 3,7 nên chiết rhodamine B khỏi mẫu sơn móng tay nước, ly tâm loại bỏ phần nổi, lọc lấy phần dung dịch chứa rhodamine B bơm vào hệ thống HPLC với cột tách cột pha đảo C18, dung môi pha động , detector PDA với nguồn sáng đèn W Phổ hấp thụ phổ huỳnh quang Rhodamin B có dạng Hình 8.4 Hình 8.4 Phổ hấp thụ phổ huỳnh quang Rhodamin B nước 8.4 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị - Hệ thống HPLC: LC-10A, detector DAD (Shimadzu, Nhật Bản) - Cột ODS C18, chiều dài 25 cm, đường kính mm, kích thước hạt μm Nước cất lần - Chất chuẩn: Rhodamine B (C28H31ClN 95% hãng Sigma Aldrich - Dung dịch chuẩn gốc Rhodamine B 1000 ppm pha từ chất chuẩn Rhodamine B nước - Dung dịch chuẩn trung gian Rhodamin B 100 ppm: pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc nước cất - Dung dịch chuẩn làm việc để xây dựng đường chuẩn Rb 0,5; 2; 5; 10; 20 ppm chuẩn bị từ dung dịch chuẩn trung gian, định mức dung mơi pha động bình - định mức 10 ml Hóa chất: Acetonitril (Fisher, Mỹ, 99,9%); Mẫu phân tích loại sơn móng tay màu hồng bán thị trường • Điều kiện tách hệ thống HPLC-DAD - Thể tích vịng mẫu: 10 L - Thời gian phân tích: 10 phút, thời gian xuất chất phân tích khoảng 3-5 phút - Bơm: Kênh acetonitrin 60%, kênh nước 40%, tốc độ dòng tổng cộng 0,8 ml/phút Bước sóng Detector: 530 nm Nhiệt độ cột nhiệt độ phịng 8.5 Nội dung thí nghiệm 8.5.1 Xây dựng đường chuẩn Rhodamine B Xoay van vị trí load, tráng kỹ kim tiêm vòng mẫu lần nước cất sau dung dịch đo Lấy dung dịch Rhodamine B có nồng độ từ nhỏ đến lớn vào kim tiêm, rửa vòng mẫu dung dịch đo sau nạp đầy vịng mẫu (dư 1-2 giọt chảy qua) Mở data file, thiết bị sẵn sàng cho phân tích, xoay nhanh cần van để đưa mẫu vào đầu cột (thiết bị tự động lưu kết quả) 8.5.2 Phân tích mẫu Cân từ 0,5-1 gam mẫu sơn móng tay cân phân tích (độ đọc cân 0,1 mg) cho vào ống ly tâm dung tích 25 ml Thêm 10, 00 ml nước cất vào mẫu, đậy nắp, lắc máy lắc phút rung siêu âm phút ly tâm máy li tâm với tốc độ 000 r/min Dùng syringe gắn đầu lọc (màng lọc 0,45 m) lấy 2,5 ml chuyển vào bình định mức 25 ml định mức đến vạch nước cất Dung dịch dùng để bơm vào hệ HPLC Chú ý: nồng độ chất phân tích nằm ngồi đường chuẩn cần điều chỉnh thể tích lấy dung dịch mẫu pha lỗng Xoay van vị trí load, tráng kỹ kim tiêm vòng mẫu lần dung dịch mẫu Nạp mẫu vào vòng cho dư 1-2 giọt chảy qua Mở data file, thiết bị sẵn sàng cho phân tích, xoay nhanh van sang vị trí inject để định lượng 8.5.3 Đánh giá độ thu hồi phương pháp phân tích Làm thí nghiệm mục 9.5.2 với lượng cân, có thêm 2,5 ml dung dịch chuẩn trung gian 100 ppm Rb 7,5 ml nước sau tiến hành tương tự 8.5.4 Tính tốn kết Sinh viên cần ghi chép lại số liệu thực nghiệm để - Báo cáo tỷ số signal/noise (S/N) cho mức nồng độ thấp đường chuẩn Các thông số cần thiết pic để trả lời câu hỏi phần báo cáo thực tập - Tính số đĩa lý thuyết cho cột tách Rhodamine B Dựng đường chuẩn Rhodamin B xác định hàm lượng Rb (ng/g) có mẫu sơn móng tay - Tính độ thu hồi phương pháp phân tích 8.6 Câu hỏi chuẩn bị Câu Nêu khác sắc ký lỏng pha đảo sắc ký lỏng pha thường Câu Tại cột C18 ứng dụng rộng rãi để tách chất có độ phân cực khác nhau? Câu Để thay đổi thời gian lưu cần thực biện pháp gì? Tại sao? Câu Sự khác detector PDA hay gọi detector diode array với detector UVVis thơng thường Câu Ngồi phương pháp HPLC bài, phương pháp khác dùng để phân tích Rhodamine B sơn móng tay, ưu nhược điểm phương pháp so với phương pháp đề xuất thực tập 8.7 Tường trình thực tập Thơng tin: Họ tên, lớp, nhóm, người hướng dẫn, buổi thực tập, ngày thực tập Cách chuẩn bị mẫu: Địa điểm lấy mẫu, thông tin mẫu, cách lấy mẫu bảo quản mẫu, cách pha chế dung dịch chuẩn cách chuẩn bị dung dịch phân tích Báo cáo số liệu: Các thơng số thí nghiệm, nhận xét sắc đồ, số liệu thu bao gồm thời gian chết, thời gian lưu, độ rộng pic diện tích pic Tính tốn kết quả: Dựa số liệu thu tính tốn thời gian lưu hiệu chỉnh, hệ số lưu, số đĩa lí thuyết trung bình, số đĩa lí thuyết hiệu lực trung bình Rhodamine B Nhận xét kết quả: Dựa kết tính tốn đưa nhận xét về: - Phương pháp định tính Rhoamine B mẫu (so sánh thời gian dung dịch chuẩn (tính thời gian lưu trung bình độ lệch chuẩn) , mẫu phân tích, mẫu thêm chuẩn; - Các thơng số phương pháp định lượng: hệ số dung tích; số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng pic, độ tinh khiết pic Tài liệu tham khảo Daniel C Harris (2010) Quantitative Chemical Analysis (8th Edition) W.H Freeman and Company Publishing Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xn Trung (2007) Hóa học phân tích – Phần 2: Các phương pháp phân tích cơng cụ Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Douglas A Skoog, F James Holler, Stanley R Crouch (2006) Principles of Instrumental Analysis (6th Edition) Brooks Cole Publishing http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AN-1102-LC-Rhodamine-BCosmetics-AN71174-EN.pdf BÀI 9: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ – DETECTOR BẮT GIỮ ĐIỆN TỬ (GC-ECD) Tách xác định số hóa chất bảo vệ thực vật clo hữu mẫu nước 9.1 Mục đích thí nghiệm Hexachlorocyclohexane (HCH), cịn gọi benzene hexachloride (BHC), nhóm đồng phân quang học có chung cơng thức phân tử C6H6Cl6, tổng hợp sử dụng rộng rãi làm thuốc trừ sâu từ sau chiến tranh giới thứ đến năm 1990 Trong hỗn hợp HCH kỹ thuật thường chứa đồng phân α-HCH (55–80%), β-HCH (5–14%), γHCH (8–15%), δ-HCH (2–16%) ε-HCH (3–5%) Riêng đồng phân γ-HCH có tác dụng đặc hiệu nên phân lập tổng hợp thành sản phẩm riêng với tên thương mại Lindane Do đồng phân HCHs có độ bền cao, có khả tích lũy sinh học, gây rối loạn nội tiết cho tác nhân gây ung thư, hợp chất bị cấm sản xuất sử dụng nhiều quốc gia giới từ năm 1990 Năm 2009, α-HCH, β-HCH Lindane đưa vào danh sách hóa chất cần phải loại bỏ theo Cơng ước Stockholm chất nhiễm hữu khó phân hủy (POPs) Hình 9.1 Cơng thức cấu tạo HCHs Tại Việt Nam, HCH kỹ thuật Lindane (thường biết đến với tên gọi thuốc trừ sâu 666) với thuốc trừ sâu clo hữu khác (OCPs) bị cấm từ năm 1995 Tuy nhiên, OCPs nói chung HCHs nói riêng phát thành phần môi trường Việt Nam nước mặt, đất, trầm tích, khơng khí, sinh vật chí thể người Sự có mặt OCPs mơi trường sinh vật hàng thập kỷ sau chúng bị cấm lưu hành giải thích tính chất bền vững khả tích lũy sinh học, cộng thêm với điểm ô nhiễm tồn lưu chưa xử lý triệt để hành vi mua bán, sử dụng thuốc trừ sâu không rõ nguồn gốc xuất xứ Trong thực tập này, sinh viên tiến hành xác định hàm lượng số đồng phân HCHs bao gồm α-HCH, β-HCH γ-HCH mẫu nước kỹ thuật chiết lỏng lỏng định lượng phương pháp sắc ký khí ghép nối detector bắt giữ điện tử (GC-ECD) Các đồng phân HCHs có độ phân cực tương đối thấp tách khỏi mẫu nước chuyển vào dung môi phân cực dichloromethane (DCM) Dịch chiết DCM chứa chất phân tích tiếp tục làm khan, làm qua cột chứa chất hấp phụ florisil, đặc phân tích hệ thống GC-ECD 9.2 Cơ sở lý thuyết phương pháp phân tích Sắc ký khí kèm với loại detector phù hợp phương pháp ưu việt để tách định lượng cách xác lượng vết siêu vết hợp chất dễ bay tính chất chúng giống Tách hợp chất hữu cột sắc ký khí dựa vào phân bố khác hợp chất hữu pha tĩnh lỏng rắn pha động khí, cho pha động qua cột Hình 9.2 sơ đồ thiết bị sắc ký khí gồm có phận chính: 1- nguồn khí mang; 2- điều chỉnh áp suất/dòng; 3- phận nạp mẫu (cổng bơm mẫu = injector); 4- cột tách; 5- detector; 6- phận điều khiển xử lý tín hiệu, = máy ghi Hình 9.2 Sơ đồ thiết bị sắc kí khí Khi mẫu bơm vào đầu cột, qua cổng 3, có đặt nhiệt độ thích hợp làm cho mẫu hoá Tuỳ thuộc vào nồng độ mẫu mà người ta đặt chế độ làm việc cho phận bơm mẫu theo kiểu chia dòng hay khơng chia dịng Nếu nồng độ mẫu lớn, chế độ chia dòng thiết lập, phần lớn mẫu thải ngồi, phần vào cột Khí mang từ nguồn đẩy chất phân tích dọc theo cột 4, trình tách chất xảy Sau tách, chất qua detector Tín hiệu xử lý, khuếch đại ghi lại thiết bị ghi Ngoài thiết bị điều khển phần mềm theo máy bao gồm đặt chế độ làm việc phận chức nhiệt độ detector, nhiệt độ injector, tốc độ dịng khí mang, bơm mẫu… đặc biệt nhiệt độ cột tách, cần thiết phải đặt chương trình cho nhiệt độ cột cho hiệu tách đạt tốt Các chức thực khối chức Bộ phận cuối ghi số liệu 9.2.1 Khí mang khí phụ trợ Trong sắc ký khí, khí mang đóng vai trị pha động, có nhiệm vụ đưa mẫu phân tích dọc theo cột, ngồi số trường hợp khí mang cịn tham gia phát chất phân tích sau cột góp phần làm hệ sắc ký Khí mang phải đáp ứng u cầu như: (1) có khả khuếch tán tốt, (2) có độ tinh khiết cao, (3) trơ với pha tĩnh, chất phân tích vật liệu hệ sắc ký, (4) hấp phụ vào pha tĩnh (5) dễ sử dụng, an toàn giá thành hạ Các khí thường dùng làm khí mang sắc ký khí He, H2, N2, Ar, Ne, Kr, CH4 Trong khí trên, N2 sử dụng phổ biến có ưu điểm an tồn, giá thành rẻ dễ dàng làm tinh khiết; N2 cấp từ bom chứa N2 lỏng cấp trực tiếp từ thiết bị phát N2 Khí phụ trợ thành phần cần thiết để đưa chất phân tích từ sau cột tách đến detector, góp phần phát chất phân tích detector tham gia vào việc làm để trì tuổi thọ, độ nhạy độ lặp lại detector Khí phụ trợ sử dụng phổ biến N Đối với số detector cần đến lửa FID hay FPD (Flame Photometric Detector – detector quang hóa lửa) cịn cần thêm hỗn hợp khí hydro oxy khơng khí Ở phịng thí nghiệm nay, khí hydro thường cung cấp thiết bị sinh khí hoạt động nguyên tắc điện phân nước khơng khí cấp thiết bị nén khí 9.2.2 Cổng bơm mẫu Mẫu phân tích hệ thống sắc ký khí thường dạng dung dịch, chất phân tích hịa tan dung mơi phù hợp dùng syringe hút thể tích xác định dung dịch mẫu (thường μL) tiêm vào hệ sắc ký Có hai cách bơm mẫu vào hệ thống sắc ký khí bơm mẫu trực tiếp bơm mẫu gián tiếp Đối với bơm mẫu trực tiếp, dung dịch mẫu đưa trực tiếp vào cột tách, chất phân tích sau hóa tách khỏi dung mơi nhờ chương trình nhiệt độ hiệu ứng dung mơi; cách bơm mẫu có ưu điểm phản ánh trung thực thành phần dung dịch mẫu đòi hỏi thiết kế đặc biệt phận bơm mẫu Cách bơm mẫu gián tiếp sử dụng phổ biến hơn, theo giọt dung dịch mẫu đưa vào hóa buồng bay ống thủy tinh có gia nhiệt, sau dịng khí mang đưa đám mẫu vào cột tách Bơm mẫu gián tiếp có chế độ bơm chia dịng (split) khơng chia dịng (splitness) Đối với chế độ bơm khơng chia dịng, tồn đám mẫu đưa vào cột tách, chế độ phù hợp cho loại cột nhồi mẫu có nồng độ chất phân tích thấp Chế độ bơm khơng chia dịng thường dùng sắc ký khí cột mao quản, cho mẫu có nồng độ chất phân tích khơng q thấp để hạn chế lượng dung môi đến detector; tỉ lệ chia dòng thường nằm khoảng 1:50 đến 1:500, tỉ lệ chia dịng 1:50 lượng mẫu vào cột 1/50 lượng mẫu bị đưa qua van chia Hiện nay, nhằm thu kết với độ lặp lại cao, hệ thống GC thường trang bị phận lấy mẫu bơm mẫu tự động (autosampler) 10 Hình 9.3 Sơ đồ cổng bơm mẫu theo chế độ bơm gián tiếp có chia dịng 9.2.3 Cột tách Trong sắc ký nói chung sắc ký khí nói riêng, cột tách giữ vai trị trung tâm q trình tách chất hỗn hợp Có hai loại cột tách sắc ký khí cột nhồi cột mao quản Cột nhồi có đường kính từ – mm, đến 12 mm, chiều dài từ – m, làm thủy tinh thép không gỉ; bên cột nhồi vật liệu chất hấp phụ rắn (rây phân tử zeolite, silica gel, alumina, carbon xốp) hạt chất mang trơ phủ pha tĩnh lỏng (chất mang phổ biến silic dioxit, pha tĩnh lỏng thường hợp chất có phân tử khối lớn polymer phân loại theo nhóm chức mức độ phân cực) Cột nhồi ứng dụng phân tích định lượng hiệu suất tách khơng cao, cần tốc độ dịng khí mang lớn, áp suất cao lượng mẫu lớn, cột nhồi sử dụng chủ yếu vào mục đích sắc ký điều chế Cột mao quản hở với nhiều loại pha tĩnh có độ phân cực khác ngày sử dụng rộng rãi phân tích định lượng Hiện cột mao quản làm chủ yếu silica nung chảy (SiO2) phủ bên lớp polyimide (là loại polymer chịu nhiệt nhằm bảo vệ cột); cột mao quản có đường kính 0,25 đến 0,75 mm chiều dài từ 10 đến 100 m Tùy theo cách thức bố trí pha tĩnh lỏng bên cột mà ta có loại cột mao quản hở WCOT (Wall-coated capillary open tubular, cột mao quản hở có thành phủ pha tĩnh lỏng, cịn gọi cột mao quản film mỏng) SCOT (Support-coated open tubular, cột mao quản hở có thành gắn hạt chất mang rắn phủ pha tĩnh lỏng, gọi cột mao quản lớp mỏng) Trong cột WCOT có hiệu tách tốt với số đĩa lí thuyết từ 1000 đến 4000 đĩa m chiều dài cột Pha tĩnh phổ biến cột WCOT polysiloxane với độ phân cực khác phụ thuộc vào thành phần nhóm chức Loại cột phân cực có pha tĩnh polydimethyl siloxane (PDMS), để tăng dần độ phân cực người ta thay nhóm methyl nhóm chức khác phenyl, ví dụ pha tĩnh poly (35% diphenyl, 65% dimethyl) siloxane có độ phân cực trung bình hay nhóm chức cyanopropyl, ví dụ pha tĩnh poly (90% biscyanopropyl, 10% cyanopropyl phenyl) siloxane có độ phân cực mạnh Ngồi 11 polyethylene glycol với tên thông thường Carbowax loại pha tĩnh phân cực mạnh dùng phổ biến Việc lựa chọn pha tĩnh dựa nguyên tắc “tương tự”, có nghĩa độ phân cực pha tĩnh chất phân tích tương tự khả lưu giữ chất phân tích cột tốt, tăng khả tách; ví dụ để tách hydrocarbon hay PCBs thường dùng cột có pha tĩnh PDMS cịn để tách ancol thường dùng cột Carbowax 9.2.4 Detector Detector phận quan trọng hệ sắc ký giúp nhận biết chất phân tích khỏi cột dựa tính chất đặc trưng cấu tử chất phân tích, cung cấp thơng tin để để phận ghi xử lí tín hiệu đưa kết cuối sắc đồ với pic ứng với cấu tử Các yêu cầu detector lí tưởng bao gồm: (1) độ nhạy cao, (2) độ ổn định độ lặp lại tốt, (3) khoảng tuyến tính rộng, (4) khoảng nhiệt độ làm việc rộng, (5) thời gian đáp ứng ngắn khơng phụ thuộc vào tốc độ dịng, (6) bền dễ sử dụng, (7) vừa có khả đáng ứng với tất chất phân tích, vừa có tính chọn lọc cao nhiều nhóm chất (8) khơng bị suy thối theo thời gian Detector bắt giữ điện tử (ECD) loại detector sử dụng rộng rãi cho mẫu mơi trường detector đáp ứng chọn lọc với chất hữu có chứa halogen coi chất nhiễm điển thuốc trừ sâu clo hữu polyclo biphenyl Trong hệ thống GC-ECD, dòng vật chất từ cột tách dẫn qua nguồn phóng xạ tia β, thường nickel-63 Mỗi electron từ nguồn phóng xạ ion hóa phân tử khí mang (thường khí nitơ) để tạo hỗn hợp cấu tử mang điện (ví dụ N 2+ electron thứ cấp) Khi khơng có mặt chất hữu cơ, dịng điện khơng đổi hai điện cực hình thành từ trình ion hóa Dịng điện giảm mạnh có mặt phân tử hữu chứa nguyên tử có độ âm điện cao chúng có khả kết hợp với electron tự để tạo thành ion âm Sự giảm dòng điện tỉ lệ với lượng chất hữu vào detector sở để tạo tín hiệu định lượng detector 12 Hình 9.4 Sơ đồ detector bắt giữ điện tử (ECD) Detector ECD có đáp ứng tốt hợp chất chứa nguyên tử halogen (trong mức độ đáp ứng giảm theo thứ tự I > Br > Cl >> F), dẫn xuất nitro, peroxide, quinone hợp chất kim Giới hạn phát detector ECD hợp chất halogen hữu fg/s Detector nhạy hợp chất chứa nhóm chức amin, ancol hydrocacbon So với detector khác detector ion hóa lửa hay detector dẫn nhiệt, detector ECD có ưu điểm độ chọn lọc cao bị ảnh hưởng thành phần mẫu Tuy nhiên, khoảng đáp ứng tuyến tính detector ECD tương đối hẹp cỡ 104 9.3 Nguyên tắc phép phân tích HCHs tan nước nên môi trường nước hợp chất thường tồn mức nồng độ vết siêu vết (ppb hay ppt) HCHs cần chiết vào dung môi hữu cơ, ví dụ DCM, để thu dịch chiết dễ dàng xử lý trước phân tích GC (cô đặc để làm giàu, chuyển sang dung môi phù hợp cho hệ GC, xử lý mẫu với kỹ thuật sắc ký hấp phụ) Khi mẫu nước chiết với DCM, nhiều thành phần khác mẫu chiết với HCHs Các chất cản trở gây ảnh hưởng đến tín hiệu HCHs nên cần phải loại bỏ cách đưa dịch chiết qua cột sắc ký thủy tinh nhồi chất hấp phụ rửa giải HCHs dung môi phù hợp Dung dịch rửa giải chứa HCHs tiếp tục cô đặc đến thể tích đủ để dễ dàng phát thiết bị GC-ECD Ví dụ, chiết L mẫu nước đặc dịch chiết đến mL nồng độ HCHs dung dịch phân tích làm giàu đến 1000 lần so với nồng độ mẫu nước ban đầu Một thể tích nhỏ dung dịch mẫu phần tích (1 µL) đưa vào hệ thống GC-ECD để tách định lượng HCHs Cột tách sử dụng cột mao quản film mỏng với lớp film pha tĩnh lỏng phủ lên thành cột silica Pha tĩnh sử dụng polysiloxane (5% phenyl 13 95% methyl) có độ phân cực thấp Mặc dù đồng phân HCHs có cơng thức phân tử khung phân tử giống nhau, tính chất lý hóa khơng hồn tồn giống xếp không gian nguyên tử clo khác Sự khác biệt cho phép hỗn hợp đồng phân HCHs tách khỏi q trình sắc ký Tín hiệu chất HCHs mẫu phân tích đặc trưng thời gian lưu so với dung dịch chuẩn Detector ECD có độ nhạy cao hợp chất hữu có chứa nguyên tố âm điện HCHs với nguyên tử clo phân tử Nồng độ chất HCHs dung dịch phân tích tính tốn phương pháp ngoại chuẩn 9.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất • Hệ thống sắc ký khí GC/ECD: Scion 456 GC (Scion Instruments, Mỹ) • Bộ lấy mẫu tự động: CP-8400 Autosampler (Bruker, Malaysia) • Syringe bơm mẫu: MicroliterTM 701N; 10 μL; vạch chia 0,1 μL (Hamilton, Mỹ) • Cột mao quản: DB-5; chiều dài 30 m; đường kính 0,25 mm; bề dày pha tĩnh 0,25 μm; pha tĩnh (5% phenyl 95 % methyl) polysiloxane (Agilent Technologies) • Cân phân tích (độ đọc 0,00001 g) • Bình định mức 10 mL 50 mL (Duran, Đức) • Syringe pha dung dịch chuẩn: 1000 μL, 250 µL, 50 µL (Agilent Technologies) • Các chất chuẩn: PESTANAL® α-HCH, β-HCH, γ-HCH dạng rắn có độ tinh khiết 99 % (Sigma-Aldrich) • Dụng cụ thiết bị xử lý mẫu: ống đong 1000 mL, phễu chiết 2000 mL, cột sắc ký thủy tinh, bình cầu, pipet Pasteur, ống nghiệm chia vạch, cất quay chân khơng, thổi khí N2, vial chứa mẫu • Dung mơi hóa chất xử lý mẫu: dichloromethane, hexane, florisil, NaCl, Na2SO4 9.5 Nội dung thí nghiệm 9.5.1 Điều kiện tách Cổng bơm mẫu: • Nhiệt độ injector: 225 °C • Chế độ bơm: khơng chia dịng (splitness) • Thể tích mẫu bơm: μL Khí mang: N2 (99,9995 %), đẳng dịng 1.2 mL/phút Chương trình nhiệt độ lị cột: • Nhiệt độ đầu 160 °C, giữ phút • Tăng đến 280 °C với tốc độ 10 °C/phút • Giữ 280 °C phút • Thời gian phân tích: 18 phút 14 Detector: • Nhiệt độ detector: 300 °C • Khí phụ trợ N2 (99,9995%): 25 mL/phút 9.5.2 Thao khác khởi động tắt hệ thống GC/ECD Khởi động hệ thống: (1) Mở van bom khí N2 (2) Bật cơng tắc On/Off thân máy GC/ECD (3) Khởi động máy tính điều khiển (4) Khởi động phần mềm điều khiển Compass CDS (5) Khởi động hệ thống GC (System On) (6) Tìm đến file chứa chương trình phân tích, mở gửi thơng tin sang hệ thống GC (7) Chờ thông số thực tế đạt đến thông số cài đặt, hệ thống trạng thái Ready đường ổn định bắt đầu phân tích mẫu Tắt hệ thống: (8) Sau mẫu cuối phân tích, chờ hệ thống trạng thái Ready (9) Tìm đến file chứa chương trình tắt máy, mở gửi thơng tin sang hệ thống GC (10) Chờ thông số thực tế đạt đến thông số cài đặt, chủ yếu nhiệt độ injector, lò cột detector đạt khoảng 500C (11) Thốt khỏi phần mềm Compass CDS tắt máy tính điều khiển (12) Tắt công tắc On/Off thân máy GC/ECD (13) Khóa van bom khí N2 9.5.3 Thao tác khai báo thông tin mẫu phần mềm điều khiển Chỉ khai báo thông tin mẫu cần bơm hệ thống hiển thị chế độ sẵn sàng để bơm mẫu (Ready tín hiệu màu xanh thân máy) Trên công cụ chọn biểu tượng Quick Start Run hiển thị hộp thoại để khai báo thơng tin sau: • Tên mẫu (Run Name): nhập tên mẫu, ví dụ: 2017xxyy S HCH ppb, xx tháng, yy ngày thực tập, kí hiệu S nhóm sáng C nhóm chiều, “HCH ppb” tên dung dịch chuẩn, mẫu thực lưu “Mau nuoc” “Sample” • Vị trí lọ đựng mẫu (Vial #): Kiểm tra lọ đựng mẫu cần bơm vị trí khay đựng mẫu, sau nhập số tương ứng vào trống Vị trí Rack # ln mặc định “0” 15 • Thời gian ghi tín hiệu (Run Time): 18 • Thể tích bơm (Injection Volume): μL Sau khai báo xong kích Start, autosampler tự động lấy bơm mẫu 9.5.4 Thao tác bơm mẫu syringe (kĩ thuật bơm mẫu kim nóng) Trước lần lấy mẫu, syringe cần tráng kĩ dung môi phù hợp, lần tráng hút dung mơi đến nửa thể tích kim (khoảng μL) thải bỏ dịch tráng vào bình chứa dung mơi thải, lặp lại thao tác 10 lần Sau tráng syringe mẫu phân tích, hút khoảng μL dung dịch mẫu, thải bỏ dịch tráng vào bình chứa dung mơi thải, lặp lại thao tác đến lần Lấy xác L dung dịch cần phân tích, ý khơng để đầu piston có bọt khí, sau kéo cao piston syringe đến vạch μL Khi thông tin mẫu khai báo hệ thống sắc kí sẵn sàng cho phân tích bơm mẫu Khi cắm syringe vào injector, syringe phải ln vng góc với thân máy, tay giữ đầu kim kim loại (để tránh làm cong đầu kim), dùng lực tay lại đẩy thân syringe đến toàn đầu kim xuyên qua septum nằm máy Chờ đến giây đẩy nhanh, dứt khốt piston để đưa tồn lượng mẫu vào injector, vừa bơm mẫu xong tiến hành ghi tín hiệu (thường cách ấn nút Start thân máy), sau rút syringe khỏi thân máy (rút theo phương thẳng đứng, vng góc với thân máy) Sau bơm mẫu xong, syringe tráng dung mơi 10 lần, thao tác tương tự lúc tráng syringe trước bơm mẫu đặt cẩn thận vào hộp 9.5.5 Hoạt động autosampler Autosampler thay người phân tích thao tác với syringe bơm mẫu Sau cài đặt thông số cho autosampler hệ thống GC/ECD sẵn sàng để phân tích, autosampler tiến hành bước sau đây: • Kiểm tra vị trí lọ đựng mẫu khay mẫu Nếu khơng thấy lọ đựng mẫu vị trí khai báo, hệ thống báo lỗi Sau autosampler kiểm tra vị trí lọ đựng mẫu, tuyệt đối không chạm vào khay mẫu để tránh làm dịch chuyển vị trí khay • Tráng rửa syringe trước bơm mẫu: autosampler tráng rửa syringe dung mơi dung dịch mẫu cần phân tích Số lần tráng rửa người phân tích cài đặt cho phù hợp, thể tích tráng từ đến μL • Lấy mẫu bơm mẫu vào hệ thống GC/ECD: sau tráng rửa syringe, autosampler tiến hành lấy mẫu, bao gồm bước loại bọt khí, lấy đến thể tích xác (thường μL), sau kéo piston lên vị trí khoảng μL Cuối autosampler bơm nhanh lượng mẫu vừa lấy vào injector hệ thống tự động ghi tín hiệu 16 • Tráng rửa syringe sau bơm mẫu: autosampler tráng rửa syringe dung môi với số lần tráng thể tích tráng tương tự trước bơm mẫu 9.5.6 Xử lí sắc đồ lấy kết Xử lý số liệu thực phần mềm Compass CDS Data Trên cơng cụ, kích vào File, chọn Open, chọn tiếp Open Chromatogram Trong cửa sổ Open File, chọn kích vào file liệu cần xử lí, chọn tiếp Open File cần xử lí xuất với sắc đồ Kích vào dịng “result” dọc bên trái hình lên bảng pic, bao gồm thời gian lưu (min) diện tích pic (μV.Sec) Dựa vào nội dung thực tập kiến thức, sinh viên nhận diện pic cần quan tâm dung dịch chuẩn mẫu thực Trong trường hợp phần mềm xử lí tự động chọn pic lấy diện tích khơng xác, tự chọn pic lấy diện tích cách thủ cơng Kích vào dòng ứng với pic cần kẻ lại bảng kết (dịng chân pic tương ứng sắc đồ bị tô vàng) Chọn biểu tượng “Delete Current Peak” cơng cụ, pic bị xóa khỏi bảng kết Chọn biểu tượng “Add Peak Mode” công cụ chọn lại pic cách kẻ chân pic từ điểm xuất pic đến điểm pic kết thúc, bảng kết hiển thị pic kẻ 9.5.7 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc dung dịch chuẩn làm việc Dung dịch chuẩn gốc 2000 ng/mL: pha dung dịch chuẩn hỗn hợp HCH-2000 (nồng độ cấu tử 2000 ng/mL) từ chất chuẩn tinh khiết dạng rắn α-, β- γ-HCH; dung mơi hexane, dùng bình định mức 50 mL Các dung dịch chuẩn làm việc: từ dung dịch gốc HCH-1000, sinh viên tự đề xuất cách chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc HCH-10, HCH-20, HCH-50 HCH-100; nồng độ cấu tử 10, 20, 50, 100 ng/mL (ppb); dung môi hexane, dùng bình định mức 10 mL syringe 9.5.8 Xác định thời gian lưu dựng đường chuẩn chất phân tích Lần lượt bơm μL dung dịch chuẩn HCH-10, HCH-20, HCH-50 HCH-100 Từ sắc đồ thu được, thao tác phần mềm Compass CDS để xác định thông số: thời gian lưu, độ rộng pic diện tích pic chất phân tích nồng độ khác Tính thời gian lưu hiệu chỉnh (tR’), hệ số lưu (k’), số đĩa lí thuyết trung bình số đĩa lí thuyết hiệu lực trung bình cột tách chất phân tích Sử dụng Excel phần mềm thống kê chuyên dụng khác để dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ α-, β- γ-HCH với diện tích pic tương ứng chúng Tìm phương trình hồi qui (dạng S = a + b.C) hệ số tương quan (R2) Bơm mẫu dịch chiết mẫu thật qua qui trình xử lý Dựa vào sắc đồ, thời gian lưu chất hỗn hợp chất chuẩn mẫu; đường chuẩn để tiến hành định tính định lượng đồng phân HCH mẫu 17 9.5.9 Quy trình phân tích hàm lượng OCPs mẫu nước Hàm lượng HCHs mẫu nước phân tích theo quy trình sau: Hình 9.5 Quy trình phân tích HCHs mẫu nước phương pháp GC-ECD 9.6 Câu hỏi chuẩn bị Câu Nêu sở tách hỗn hợp đồng phân α-, β- γ-HCH phương pháp sắc ký khí? Nêu vai trị cột tách chương trình nhiệt độ? Câu Nêu nguyên lý hoạt động detector ECD? So sánh độ nhạy, khoảng tuyến tính, khả ứng dụng ưu, nhược điểm detector ECD FID? Câu Phân biệt injector chia dòng (split) khơng chia dịng (splitless), nêu ứng dụng chúng Câu Giải thích vai trị bước quy trình xử lý mẫu nước để xác định hàm lượng OCPs? 9.7 Tường trình thí nghiệm Thơng tin: Họ tên, lớp, nhóm, người hướng dẫn, buổi thực tập, ngày thực tập Cách chuẩn bị mẫu: Thông tin mẫu, cách lấy mẫu bảo quản mẫu, cách pha chế dung dịch chuẩn cách chuẩn bị dung dịch phân tích 18 Báo cáo số liệu: Các thơng số thí nghiệm, nhận xét sắc đồ, số liệu thu bao gồm thời gian chết, thời gian lưu, độ rộng chân pic diện tích pic Tính tốn kết quả: Dựa số liệu thu tính tốn thời gian lưu hiệu chỉnh, hệ số lưu, số đĩa lí thuyết trung bình, số đĩa lí thuyết hiệu lực trung bình chất phân tích Lập cơng thức tính toán hàm lượng đồng phân HCHs mẫu nước theo quy trình đưa mục 11.5.9 Nhận xét kết quả: Dựa kết tính tốn đưa nhận xét ý trình làm thí nghiệm Sinh viên tìm hiểu quy định hành Việt Nam mức hàm lượng cho phép HCHs đối tượng môi trường nước mặt, nước ngầm, đất, trầm tích Tài liệu tham khảo US Environmental Protection Agency (2007) Method 8081B – Organochlorine Pesticides by Gas Chromatography Daniel C Harris (2010) Quantitative Chemical Analysis (8th Edition) W.H Freeman and Company Publishing Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xn Trung (2007) Hóa học phân tích – Phần 2: Các phương pháp phân tích cơng cụ Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Douglas A Skoog, F James Holler, Stanley R Crouch (2006) Principles of Instrumental Analysis (6th Edition) Brooks Cole Publishing 19 ... với electron tự để tạo thành ion âm Sự giảm dòng điện tỉ lệ với lượng chất hữu vào detector sở để tạo tín hiệu định lượng detector 12 Hình 9 .4 Sơ đồ detector bắt giữ điện tử (ECD) Detector ECD... hạn phát detector ECD hợp chất halogen hữu fg/s Detector nhạy hợp chất chứa nhóm chức amin, ancol hydrocacbon So với detector khác detector ion hóa lửa hay detector dẫn nhiệt, detector ECD có... đáp ứng tuyến tính detector ECD tương đối hẹp cỡ 1 04 9.3 Nguyên tắc phép phân tích HCHs tan nước nên môi trường nước hợp chất thường tồn mức nồng độ vết siêu vết (ppb hay ppt) HCHs cần chiết vào