1 Vũ Thu Hằng TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ Học phần Kỹ thuật thu hồi và hoàn thiện sản phẩm công nghệ sinh học Chuyên đề 5 SẮC KÝ, PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ VÀ Ý NGHĨA CỦA CHÚNG TRONG QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH SẢN PHẨM CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn PGS TS Lê Gia Hy Sinh viên thực hiện Vũ Thu Hằng Lớp Cao học 2021 2023 Hà Nội – 2022 2 Vũ Thu Hằng MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU NỘI DUNG 1 Lịch sử sắc ký 2 Sắc ký là gì? 3 Phân loại.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ Học phần: Kỹ thuật thu hồi hoàn thiện sản phẩm công nghệ sinh học Chuyên đề 5: SẮC KÝ, PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ VÀ Ý NGHĨA CỦA CHÚNG TRONG QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH SẢN PHẨM CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Lê Gia Hy Sinh viên thực : Vũ Thu Hằng Lớp : Cao học 2021-2023 Hà Nội – 2022 Vũ Thu Hằng MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU NỘI DUNG Lịch sử sắc ký Sắc ký gì? Phân loại kỹ thuật sắc ký 3.1 Theo chất vật lý pha 3.2 Theo tượng sắc ký 3.3 Theo kỹ thuật phương tiện sắc ký Các kỹ thuật sắc ký ý nghĩa chúng q trình tách chiết tinh sản phẩm cơng nghệ sinh học 4.1 Sắc ký giấy 4.2 Sắc ký lớp mỏng 4.3 Sắc ký cột 4.4 Sắc ký trao đổi ion 4.5 Sắc ký gel 4.6 Sắc ký lực 4.7 Sắc ký tương tác kỵ nước 4.8 Sắc ký khí Kết luận 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO 16 Vũ Thu Hằng MỞ ĐẦU Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác Các hợp chất bao gồm đại phân tử protein, acid nucleic, lipid,… hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ Những hợp chất diện số lượng nhỏ, dạng vết (enzyme) hay số lượng nhiều (các protein cấu tạo) Để phân tích thành phần hóa học tế bào, nhằm hiểu rõ quy trình biến đổi nó, qua úng dụng sử dụng thành phần phù hợp Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học Từ đó, kỹ thuật tách riêng hợp chất đời với tên gọi sắc ký (chromatography) Kỹ thuật sắc ký đem lại ứng dụng to lớn nhiều lĩnh vực, có thu hồi sản phẩm cơng nghệ sinh học, từ đó, sản phẩm dược phẩm sinh học sử dụng với độ tinh khiết cao, xác định sớm, với hiệu đạt tiêu chuẩn sử dụng người Ngày nay, sắc ký sử dụng để tách tất hợp chất có tính chất khác mầu sắc, mùi vị, trọng lượng, điện tích, tính kỵ nước, Nhưng phân tử sinh học thiên hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay khác nên cần có đa dạng phương pháp hay kỹ thuật sắc ký khác phù hợp cho đặc tính chúng Sau nội dung sắc ký, kỹ thuật sắc ký ý nghĩa chúng tác chiết tinh sản phẩm công nghệ sinh học Vũ Thu Hằng NỘI DUNG Lịch sử sắc ký Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett cho dung dịch sắc tố thực vật ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy sắc tố bị hấp phụ lên đầu cột Khi cho ete dầu hoả lên cột, sắc tố di chuyển cột từ xuống dưới, sắc tố có tốc độ riêng, tách thành vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành hệ mà Tvest gọi sắc đồ Ơng đặt tên cho phương pháp tách sắc ký (Chromatography) Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa chất màu, graphein có nghĩa viết Tên gọi ngày sử dụng phương pháp dùng tách chất không màu Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực, Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách hợp chất mang điện tích theo trọng lượng phân tử chúng Đến năm 1964, Moor gọi “gel permeation chromatography” hay gọi sắc ký lọc gel Năm 1906, sắc ký khí biết đến đến 1952, kỹ thuật phát triển mạnh mẽ, thập niên 1960 Năm 1967, Horvath C tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp Sắc ký gì? Sắc ký nhóm phương pháp hoá lý dừng để tách thành phần hỗn hợp Sự tách sắc ký dựa phân chia khác chất khác vào hai pha ln tiếp xúc khơng hồ lẫn vào nhau: pha tĩnh pha động (Trong thí nghiệm Tvest: pha tĩnh canxi cacbonat, pha động ete dầu hoả) Pha tĩnh trì hỗn di chuyển thành phần mẫu Khi thành phần di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng tách khỏi theo thời gian Mỗi thành phần qua hệ thống khoảng thời gian riêng biệt, gọi thời gian lưu Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp chuyên chở chất lỏng khí thành phần tách phân bố khác chất hòa tan chúng chảy qua pha tĩnh rắn lỏng Nhiều kỹ thuật khác dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa tính khác chất mơi trường động khí lỏng môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua giấy, gelatin hay gel magnesium silicate, Sắc ký phương pháp để phân tách tinh phân tử sinh học Sắc ký phương pháp nhanh, dễ dàng không ảnh hưởng đến protein, phương pháp đề nghị nghiên cứu định lượng protein hay phân tử Vũ Thu Hằng Phân loại kỹ thuật sắc ký 3.1 Theo chất vật lý pha Pha động chất lỏng hay chất khí Pha tĩnh chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay chất lỏng (được giữ chất mang rắn) Do đó, dựa vào chất pha ta phân biệt phương pháp (trong tên phương pháp, pha động nêu trước pha tĩnh): + Sắc ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC) + Sắc ký lỏng - rắn (liquid - song chromatography LSC) + Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC) + Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC) Hai phương pháp đầu gọi chung sắc ký lỏng (LC) Hai phương pháp đầu gọi chung sắc ký khí (GC) 3.2 Theo tượng sắc ký + Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh chất rắn có khả hấp phụ, phương pháp sắc ký lỏng - rắn khí - rắn + Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh chất lỏng khơng hồ lẫn với pha động, chất lỏng bao bề mặt chất rắn gọi giá hay chất mang phải chất trơ, không tham gia vào sắc ký Sắc ký phân bố bao gồm sắc ký lỏng - lỏng sắc ký khí - lỏng + Sắc ký trao đổi ion (ion - exchange chromatography): pha tĩnh chất nhựa trao đổi ion chớp chất cao phân tử có mang ion có khả trao đổi với ion dấu dung dịch hỗn hợp sắc ký) + Sắc ký theo loại cỡ (size - exclusion chromatography): gọi sắc ký gel Các phân tử cỡ lớn loạt phân tử nhỏ tách theo kích thước phân tử nhỏ di chuyển chậm 3.3 Theo kỹ thuật phương tiện sắc ký Theo phương pháp giữ pha tĩnh: + Sắc ký cột (column chromatography: CC) pha tĩnh chứa cột kim loại hay thuỷ tinh + Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh tráng giữ mặt phẳng thuỷ tinh, nhựa hay nhôm Lớp mỏng pha tĩnh thường là: silicagel, nhôm oxit, xenlulozơ, chất nhựa trao đổi lớn có chiều dày khoảng 0,25 - 0,5mm + Sắc ký giấy (paper chromatography - PC) pha tĩnh (lỏng) thấm loại giấy lọc đặc biệt gọi giấy sắc ký Theo cách cho pha động chạy ta có: Vũ Thu Hằng + Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép chất chạy tách pha tĩnh (Sắc đồ nằm pha tĩnh) + Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy kép chất ngồi pha tính (ra khỏi cột, khỏi giấy) Các kỹ thuật sắc ký ý nghĩa chúng trình tách chiết tinh sản phẩm công nghệ sinh học 4.1 Sắc ký giấy Sắc ký giấy phương pháp phân tách dễ dàng thành phần hỗn hợp (acid amin) Trong sắc ký giấy, pha tĩnh tờ giấy cellulose ( thí dụ tờ giấy thấm, giấy lọc phịng thí nghiệm) Các lọai giấy có tính nước nên thực tế, pha tĩnh lớp nước (H2O) thật mỏng che phủ lên bề mặt tờ giấy, sắc ký giấy lọai sắc ký phân chia Pha động chất lỏng( chất lỏng hay hỗn hợp dung môi) Phương pháp thường sử dụng để tách chất ưa nước amino acid, đường, Trong giấy, cellulose có dạng sợi, sợi nằm cạnh tạo thành mạng lưới với lỗ rỗng to Khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bề mặt sợi lỗ rỗng phủ đầy dung môi Như thế, chất tan bị phân tán nhiều lỗ rỗng khiến vết sắc ký to Bột giấy hấp thu nước, nước bị giữ lại cấu trúc glucopyranose cầu nối hydrogen, trình sắc ký xảy theo chế phân chia Hình1 Sắc ký giấy, chất màu di chuyển theo dung môi lên giấy với điểm khác (a) Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt góc mảnh giấy lọc, cạnh giấy nằm dung môi (b) Dung môi di chuyển lên giấy lực hút mao mạch, chất phân bố theo tỷ lệ khác Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích thước Vũ Thu Hằng phân tử hịa tan dung mơi (c) Những chất khác trải điểm khác biệt bảng , tạo thành sắc ký đồ Hiện nay, sắc ký giấy dần thay sắc ký lớp mỏng Do phần lớn chất hữu khơng có màu, nên sắc ký giấy khơng cho thấy vị trí mẫu chất q trình dung mơi di chuyển lên giấy Nhược điểm sắc ký giấy: Trong giấy, cellulose dạng sợi dài nằm song song kề cách tự nhiên, hệ thống mạng chắn có lỗ hỗng Khi dung mơi giải ly di chuyển (mang theo chất tan, solute) dọc theo bề mặt sợi, lỗ rỗng dịp phủ đầy dung mơi, chất tan có dịp khuếch tán vào lỗ rỗng này, khiến chất tan lúc to dần so với vết chấm tạo mức xuất phát ban đầu Còn sợi cellulose nén chặt q dịng chảy khó di chuyển 4.2 Sắc ký lớp mỏng 4.2.1 Khái niệm đặc điểm sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng hay gọi sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào tượng hấp thu pha động dung mơi hỗn hợp dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid alumin) Pha tĩnh tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên phẳng kiếng, nhôm hay plastic Do chất hấp thu tráng thành lớp mỏng nên phương pháp gọi sắc ký lớp mỏng Hình Bình sắc ký lớp mỏng - Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy - Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin, ) tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên kiếng, nhôm, hay plastic Chất hấp thu nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay lọai polymer hữu - Mẫu cần phân tích: thường hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha lõang 2-5%, nhờ vi quản để chấm thành Vũ Thu Hằng điểm gọn pha tĩnh, vị trí phái cao chút so với mặ thống chất lỏng chứa bình - Pha động: dung môi hay hỗn hợp dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo lớp mỏng, lôi kéo mẫu chất theo Dung mơi di chuyển cao nhờ tính mao quản Mỗi thành phần chất di chuyển với vận tốc khác nhau, phía sau mực dung môi Vận tốc di chuyển phụ thuộc vào lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ mẫu chất lại pha tĩnh tùy thuộc vào độ hòa tan mẫu chất dung môi - Ưu điểm: + Chỉ cần lượng mẫu để phân tích + Có thể phân tích đồng thời mẫu chất chuẩn đối chứng điều kiện phân tích + Tất hợp chất mẫu phân tích định vị sắc ký lớp mỏng 4.2.2 Ứng dụng sắc ký lớp mỏng Khả phân tích sắc ký lớp mỏng đa dạng, từ chất phân cực tới chất phân cực trung bình tới mạnh Rất nhiều nhóm hợp chất tự nhiên có giá trị trị liệu phân tích sắc ký lớp mỏng Tuy khả phân tách không cao không nhạy HPLC hay GC sắc ký lớp mỏng phương pháp phổ biến hữu ích phân tích dược liệu, công nghệ sinh học, phân tách hóa học Trong nghiên cứu sản xuất sản phẩm công nghệ sinh học thường người ta sử sắc ký lớp mỏng để định tính định lượng sản phẩm mong muốn, sơ đánh giá độ tinh tinh sản phẩm phương pháp sắc ký giấy 4.3 Sắc ký cột 4.3.1 Khái niệm đặc điểm sắc ký lớp mỏng Sắc ký cột tiến hành điều kiện áp suất khí Pha tĩnh hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), nạp cột thủy tinh Mẫu chất cần phân tích đặt đầu cột, phía pha tĩnh (có lớp thủy tinh che chở để lớp mặt khơng bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đặt phái cao Dung môi giải ly khỏi cột phần bên cột hứng vào lọ nhỏ đặt ống dẫn cột Phương pháp thường làm cho trình tách bị chậm, hiệu thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Tuy vậy, sắc ký cột có ưu điểm pha tĩnh dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, triển khai với lượng mẫu tương đối lớn 4.3.2 Ứng dụng sắc ký cột Sắc ký cột ứng dụng lĩnh vực hóa học để tách chiết chất từ hỗn hợp Sắc ký cột thường sử dụng nhà máy dược để chiết xuất lượng lớn chất dược liệu Vũ Thu Hằng Hình Sắc ký cột 4.4 Sắc ký trao đổi ion 4.4.1 Khái niệm đặc điểm sắc ký trao đổi ion Sự trao đổi ion gắn kết có tính chất thuận nghịch phân tử có mang điện tích Trong sắc ký cột nhồi , pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mang điện tích Giả sử cho ngang qua cột hỗn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều lọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan có mang điện tích ngược dấu với điện tích nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất tan dẽ đuổi đối ion C chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, chất tan bị giữ lại cột, chất khác hỗn hợp mẫu chất ban đầu không bị giữ lại nên khỏi cột kỹ thuật tách riêng hợp chất S khỏi hỗn hợp ban đầu RG- + S+ -Hoặc RG+ +S- - RG-S+ +C+ RG+S- +C- Trong đó: R pha tĩnh hay gọi nhựa (resin), G nhóm chức mang điện tích cố định pha tĩnh hay cịn gọi nhóm chức họat động nhựa C đối ion G S chất hữu có mang điện tích trái dấu với G Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer carbohydrate Vũ Thu Hằng Hình Sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình gọi sắc ký trao đổi ion dương, tương tác với phân tử mang điện tích dương Ngược lại, hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAEcellulose)), gọi sắc ký trao đổi ion âm, tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion pha động, ion phân tử protein tương tác với hạt mang điện tích Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dương, đó, protein mang điện tích dương phóng thích ngồi cột theo độ lớn điện tích 4.4.2 Ứng dụng sắc ký trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion công cụ mạnh mẽ quan trọng nhà hóa học phân tích dược phẩm Sắc ký trao đổi ion sử dụng để ước tính phân tách phân tử có điện tích ion khác bao gồm protein, peptit, axit amin, vitamin, cacbohydrat, enzim, v.v riêng với kỹ thuật sắc ký khác Điều áp dụng để tách biệt làm phân tử hữu từ nguồn tự nhiên Các phân tử khác với công suất lớn phân tích Các phân tử mong muốn tinh chế mức cao Với chi phí thấp, kỹ thuật sắc ký trao đổi ion áp dụng để chuyển giao cho quy mô sản xuất Các sản phẩm tự nhiên chiết xuất khơng dung mơi theo dõi Nó đóng vai trị quan trọng việc khám phá thuốc phân lập sản phẩm tự nhiên 10 Vũ Thu Hằng 4.5 Sắc ký gel 4.5.1 Khái niệm đặc điểm sắc ký gel Trong sắc ký gel, pha tĩnh mạng polymer có lỗ rỗng lỗ rỗng phủ đầy dung môi dùng làm pha động Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân tử khác cị thể tách riêng hay khơng tuỳ vào kích thước lỗ rỗng Các phân tử có kích thước lớn lỗ rỗng, khơng thể chui lọt vào bên lỗ rỗng, nhanh chóng theo dịng chảy pha động khỏi cột phân tử có trọng lượng phân tử (TLPT) nhỏ kích thước lỗ rỗng, toàn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, cuối theo dòng chảy khỏi cột chậm trễ Dòng chảy pha động khiến phân tử lớn chui vào lỗ rỗng mạng gel, nhanh chóng xuyên qua cột, khỏi cột, phân tử nhỏ khỏi cột lâu cịn chui vào khỏi lỗ rỗng gel Như vậy, thành phần khác hỗn hợp mẫu ngang qua cột sắc ký gel, khỏi cột theo trình tự TLPT lớn khỏi cột trước, phân tử nhỏ khỏi cột sau Hình Sắc ký gel 4.5.2 Ứng dụng sắc ký gel Ứng dụng khử muối: polyme (chẳng hạn protein, axit nucleic, polysaccharides, vv) giải pháp tạp chất phân tử lượng thấp loại bỏ phương pháp sắc ký gel, hoạt động gọi khử muối Khử muối pháp luật đơn giản, nhanh chóng, enzyme protein khác q trình khử muối khơng phải dễ dàng thối hóa Gel áp dụng SephadexG-10, 15,25, Bio-Gel-p-2, 4,6 Chiều dài Cột tỷ lệ đường kính 5-15, khối lượng riêng khối lượng mẫu lên đến 25% -30% để ngăn chặn giảm khả hòa tan khử muối kết tủa protein mẫu hấp phụ cột, muối thường dễ bay amoni axetat đệm để cân cột sau thêm vào mẫu, cách sử dụng đệm rửa giải đó, rửa giải thu thập muối biến động loại bỏ cách lyophilization Xác định trọng lượng phân tử vật liệu polyme: loạt tiêu chuẩn trọng lượng phân tử biết đến vào cột gel sắc ký điều kiện, ghi thành phần tích rửa giải 11 Vũ Thu Hằng phút, rửa giải khối lượng so với trọng lượng phân tử âm mưu logarit, phạm vi trọng lượng phân tử đường thẳng, đường cong chuẩn trọng lượng phân tử Xác định trọng lượng phân tử chất chưa biết, mẫu thêm vào đường cong tiêu chuẩn xác định rửa cột gel sưng lên, theo khối lượng chất rửa giải đường cong tiêu chuẩn trọng lượng phân tử 4.6 Sắc ký lực 4.6.1 Khái niệm đặc điểm sắc ký lực Sắc ký lực hấp thụ phát lực sinh học mà phân tử sinh học có với phân tử khác cố định pha ổn định Có nhiều phương pháp để rửa giải phân tử lực có nhiều loại sắc ký lực khác nhau, bước theo gradient thường sử dụng Thường sử dụng hệ thống có áp suất thấp Các giá thể (thường agarose) thường chịu áp suất 50psi Hình Sắc ký lực - Nhược điểm: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết ligand lên giá thể hoạt hóa thường gặp nhiều khó khăn - Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh protein A (protein A antigen cho IgG), bước bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng nguyên thủy cịn họat tính với dạng biến tính - Sử dụng sắc ký lực cho tương tác kháng nguyên kháng thể: ta tinh kháng nguyên cách cho mẫu qua cột có chứa giá thể liên kết với kháng thể để thu nhận protein Ngược lại, giá thể có liên kết với kháng nguyên chuyên biệt bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên Ứng dụng nhiều gắn kết protein A vào gel để gắn kết với globulin miễn dịch 4.6.2 Ứng dụng sắc ký lực Sắc ký lực sử dụng nhiều ứng dụng, bao gồm tinh axit nucleic, làm protein từ dịch chiết loại bỏ tế bào tinh chế protein từ máu Sử dụng tính đặc hiệu kỹ thuật ứng dụng trong: - Ái lực miễn dịch: làm kháng thể sắc ký lực từ huyết máu, 12 Vũ Thu Hằng huyết biết có chứa kháng thể chống lại kháng nguyên đặc hiệu (ví dụ, huyết đến từ sinh vật miễn dịch chống lại kháng nguyên có liên quan), sau sử dụng để tinh lực kháng nguyên Điều biết đến sắc ký lực miễn dịch vận chuyển Ví dụ: Các peptid cùngchứa cystein cố định lên nhựa agarose thông qua gốc cystein sau sử dụng để làm kháng thể Hầu hết kháng thể đơn dòng tinh sử dụng sắc ký lực dựa Protein A Protein G đặc hiệu-immunoglobulin, tìm thấy từ vi khuẩn - Sắc ký lực cố định ion kim loại (IMAC) dựa sở liên kết đồng hóa trị đặc hiệu axit amin, đặc biệt histidin, với kim loại Kỹ thuật cho phép protein có lực với ion kim loại giữ lại cột có chứa ion kim loại cố định, ví dụ coban, niken, đồng để tinh protein hay peptid có chứa histidin; sắt, kẽm gali để tinh protein hay peptid phosphoryl hóa - Protein tái tổ hợp sử dụng phổ biến sắc ký lực để tinh protein tái tổ hợp Protein có lực biết protein găn đầu để trợ giúp mức độ tinh chúng Protein biến đổi gen cho phép lựa chọn liên kết lực, hiểu protein dung hợp - Sắc ký lực lectin dạng sắc ký lực mà lectin sử dụng để tách thành phần mẫu Lectin, Concanavalin A, protein mà liên kết phân tử hydratcarrbon (đường) đặc hiệu Ứng dụng phổ biến sắc ký lực lectin để phân tách glycoprotein từ protein khơng glycosyl hóa dạng glycoprotein khỏi dạng glycoprotein khác 4.7 Sắc ký tương tác kỵ nước Sắc ký tương tác kỵ nước phuơng pháp bổ sung tốt cho kỹ thuật phân tách khác Trong năm gần đây, phương pháp trở nên thông dụng bước trình sắc ký Hình Sắc ký tương tác kỵ nước 13 Vũ Thu Hằng Loại hạt Macro-Prep có dẫn xuất nhóm kỵ nước, gốc methyl hay t-butyl Các gốc hấp dẫn gốc kỵ nước khác có bề mặt protein Khi cho mẫu protein vào điều kiện nồng độ muối cao ép phần kỵ nước lại gần đính với Quá trình rửa giải thực cách giảm dần nồng độ muối phần kỵ nước lại vào dung dịch Đặc điểm: + Phân tách phân tử theo tính kỵ nước phân tử + Các nhóm kỵ nước khác đựợc cố đinh bề mặt giá thể + Dưới điều kiện nồng độ muối cao (thấp) CÁC phần kỵ nước phân tử tương tác nhóm cố định + Các phân tử gắn kết giải cách giảm áp lực ion hịa tan phân tử khỏi giá thể Ưu điểm: Là bước cho phép cô mẫu, công suất cao, nhanh, mẫu thu nhận nồng độ muối thấp Nhược điểm: số protein bị tủa nồng độ muối cao, khó nâng cấp quy mơ lớn 4.8 Sắc ký khí 4.8.1 Khái niệm đặc điểm sắc ký khí Sắc ký khí phương pháp dùng để tách chất thể khí bay hơi, với pha động chất khí, gọi khí mang (carrier gas) Sắc ký khí cịn áp dụng cho chất khí, lỏng, rắn dễ bay bền nhiệt độ cao, có TLPT M