Động học enzyme, Enzyme tái tổ hợp

MỤC LỤC MỞ ĐẦU NỘI DUNG I GIỚI THIỆU II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III TẠO ENZYME TÁI TỔ HỢP IV KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN V KẾT LUẬN Tài liệu tham khảo MỞ ĐẦU Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung Thế kỷ 21 được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học, được coi là thời điểm lịch sử mà con tầu vũ trụ mang tên “công nghệ sinh học” đã rời khỏi bệ phóng để bay đến tầm cao mới Công nghệ s.

MỤC LỤC MỞ ĐẦU NỘI DUNG I GIỚI THIỆU II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III TẠO ENZYME TÁI TỔ HỢP IV KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN V KẾT LUẬN Tài liệu tham khảo Vũ Thu Hằng MỞ ĐẦU Ngày khơng phủ nhận tầm quan trọng công nghệ sinh học kinh tế quốc dân nước ta nói riêng giới nói chung Thế kỷ 21 coi kỷ ngành công nghệ sinh học, coi thời điểm lịch sử mà tầu vũ trụ mang tên “công nghệ sinh học” rời khỏi bệ phóng để bay đến tầm cao Cơng nghệ sinh học Việt Nam coi hướng phát triển mũi nhọn nhiều nước Trong có trọng đầu tư cho lĩnh vực công nghệ enzyme Trong cơng nghệ enzyme tái tổ hợp hướng Có nhiều loại enzyme tái tổ hợp nghiên cứu để đưa vào ứng thực tiễn Các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân Hydrolase enzyme ứng dụng nhiều lĩnh vực, đặc biệt ngành công nghiệp thực phẩm, tiêu biểu như: αamylase, β-amylase, protease, lipase, Các enzyme có đóng góp to lớn việc phục vụ, nâng cao đời sống người Vì nhu cầu cải tiến tạo enzyme tái tổ hợp mang đặc tính ưu việt quan tâm Xuất phát từ thực tế trên, em lựa chọn xin trình bày nội dung tiểu luận nghiên cứu “α-Amylase from B amyloliquefaciens: purification, characterization, raw starch degradation and expression in E.coli ” Nghiên cứu công bố, xuất vào năm 2004 Elsevier Ltd, Elif Sarikaya Demirkan đến từ khoa Sinh học, Đại học Ankara (Thổ Nhĩ Kỳ) Bunzo Mikami, Motoyasu Adachi, Takahiko Higasa, Shigeru Utsumi đến từ Học viện Khoa học Thực phẩm, Đại học Kyoto (Nhật Bản) hợp tác thực Vũ Thu Hằng NỘI DUNG I GIỚI THIỆU 1.1 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu báo cáo quy trình tinh sạch, phân loại khả thủy phân tinh bột thô α-amylase từ B.amyloliquefaciens sp kiểu dại kiểu đột biến Cùng bước thực biểu E coli chủng enzyme kiểu dại 1.2 Khái niệm vai trò α-Amylase α-Amylase (E.C 3.2.1.1) enzym ngoại bào phổ biến loài thực vật, động vật bậc cao vi sinh vật Nó xúc tác q trình thủy phân liên kết α-δ- (1,4) glycosidic thành phần tinh bột cacbohydrat khác Hình Phản ứng thủy phân tinh bột tạo glucose chất xúc tác enzyme α-Amylase Enzyme sử dụng khử cặn vải, công nghiệp làm bánh, dược phẩm chất tẩy rửa Các amylase điều nhiệt quan trọng công nghiệp sử dụng Đặc biệt, B amyloliquefaciens, B licheniformis, B sterothermophilus số chủng B subtilis amylase B amylolifuefaciens B licheniformis tạo enzym dạng lỏng [1] Từ đó, amylases số Bacillus sp tinh chế phân loại [2,3] 1.3 α-Amylase tái tổ hợp từ Bacillus sp E coli Dey cộng đưa nghiên cứu α-amylase chịu nhiệt từ Bacillus sp N-1 [4] Gen α-amylase biểu từ nhiều loại Bacillus sp E coli để tăng sản xuất amylase Một số sản phẩm gen báo cáo tiết vào môi trường nuôi cấy E coli., chẳng hạn penicillinase xylanase Bacillus sp Một α-amylase chịu nhiệt từ B stearothermophilus nhân E coli tăng sinh sản phẩm enzyme Vũ Thu Hằng ngoại bào [59] Sự phân lập phân loại đoạn 2,2 kb DNA ngược dòng gen amylase từ B amyloliquefaciens báo cáo [6] Enzyme amylase không hiệu hạt tinh bột thơ hạt chống lại tiêu hóa ly giải tinh bột [7] Vùng liên kết đầu C-terminal đóng vai trị liên kết tinh bột thô Glucoamylase nấm Aspergillus spp Rhizopus spp hiệu với tinh bột thô, chúng dường có vùng liên kết tinh bột COOH-terminal Các enzym từ vi khuẩn β-amylase B.polymyxa cylodextrin glucanotransferase B macerans chứa miền [8, 9] Vũ Thu Hằng II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu bước tinh enzyme Một dòng B amyloliqefaciens phân lập từ đất Thổ Nhĩ Kỳ định danh nhà máy ORBA Biochemicals (Istanbul, Thổ Nhĩ Kỳ) Từ đó, dịng đột biến tạo phương pháp xử lý với ethidium bromide/ UV [10] Vi khuẩn phát triển môi trường xác định 72 h [11] Tiếp theo, enzyme vi khuẩn có bề mặt ni cấy tinh chế loạt bốn bước: + Đầu tiên, 80% amoni sunfat thêm vào phần phía trên, ta thu kết tủa Đem kết tủa hòa tan dung dịch đệm Tris – HCl 20 mM (pH 7,6) thẩm tách qua đêm + Sau thẩm tách, dung dịch nạp vào cột Q Sepharose tách rửa với dung dịch đệm thu chứa 0,5 M NaCl + Các phân đoạn thu thập, thẩm tách với đệm Na-acetate 20 mM (pH 5,0) cô đặc siêu lọc thông qua cô đặc Centriprep-10 (Amicon) + Các mẫu cô đặc áp dụng cho cột SP Sepharose tách rửa với dung dịch đệm axetat Na 50 mM (pH 5,4) có chứa NaCl M Các phân đoạn thu thập tập trung siêu lọc máy cô đặc Centricon-10 (Amicon) Dung dịch đệm chứa mM CaCl 0,5 mM PMFS 2.2 Phân tích enzyme α-Amylase hoạt động phân tích phương pháp tinh bột-iod [12] Một đơn vị enzyme (đơn vị/ml) xác định lượng enzyme tham gia thủy phân 1mg tinh bột (0,1%) 10 phút 37oC pH 5,9 Sự cô đặc protein tính tốn phương pháp Bradford [13] với albumin huyết bò tiêu chuẩn 2.3 Xác định khối lượng phân tử Điện di tiến hành dung dịch đệm sodium dodecyl sulphate gel polyacrylamide (SDS-PAGE) theo Laemmli [14] 2.4 Phân tích nguyên tố canxi Sau thẩm tách enzym tinh sạch, nguyên tố canxi liên kết với αamylase xác định cách hấp thụ nguyên tử bước sóng 239,9 nm với máy đo quang phổ nguyên tử Zeimman 2.5 Ảnh hưởng nhiệt độ pH Các mẫu enzyme ủ 10 phút khoảng tăng nhiệt 30 90 oC Để đánh giá độ ổn định, enzym giữ h hoạt độ lại xác định Giá trị pH tối ưu cho enzym xác định hệ đệm Britton Robinson từ pH đến Độ ổn định pH enzyme xác định cách ủ chất đệm (pH 8) Vũ Thu Hằng 2.6 Ảnh hưởng số ion kim loại Các mẫu enzyme ủ với số ion kim loại mM Các hoạt động tương đối thể dạng phần trăm hoạt động kiểm soát chưa xử lý coi 100% 2.7 Tính chất động học enzym Hằng số động học Km Vmax đo cách ước tính q trình thủy phân với phương pháp tinh bột – iod sử dụng số nồng độ tinh bột Giá trị Km Vmax xác định cách sử dụng phương trình Michaelis-Menten 2.8 Độ đặc hiệu chất Tính đặc hiệu chất với enzym tinh khiết nghiên cứu, diện chất khác Các nồng độ đường khử tạo xác định phương pháp axit dinitrosalicylic [15] với maltose tiêu chuẩn 2.9 Thủy phân tinh bột hịa tan Sản phẩm q trình thủy phân tinh bột α-amylase hiển thị silica gel (dày 0,5 mm 20 cm x20 cm) phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 2.10 Sự suy thối hạt tinh bột thơ Các loại hạt tinh bột thơ bao gồm khoai tây, khoai lang, lúa mì, gạo ngô rửa lần nước Milli-Q Các ngũ cốc làm khô 5% loại hạt tinh bột lơ lửng 400 mL dung dịch đệm axetat 50 mM (pH 5,5) chứa 10 mM 2-ME (mercaptoethanol) mMCaCl2 Phản ứng bắt đầu cách thêm 100 ml enzym dung dịch Hỗn hợp chất enzyme ủ 12,18 24 giờ, sau ly tâm chất sử dụng đểxác định đường giải phóng axit dinitrosalicylic phương pháp với maltose làm tiêu chuẩn Tất loại hạt tinh bột rửa hai lần etanol nguyên chất t-butylbrượu bia Sau đông khô, chúng kiểm tra cách quét kính hiển vi điện tử [16] Vũ Thu Hằng III TẠO ENZYME TÁI TỔ HỢP 3.1 Khuếch đại gen α-Amylase Trình tự DNA gen B amyloliquefaciens sp kiểu dại chuẩn bị theo quy trình Maeda et al [17] Silhavy et al [18] Gen α-amylase mã hóa enzyme trưởng thành khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi (Pharmacia Amersham Biochem): N-5’GAATTCCATGGTAAATGGCACGCTGATGCAGTA TTTTG3’ C-5’TTTCTGCAGTTATTTCTGAACATAA ATGGAGACGG3’ Phản ứng PCR thực với ExTaq polymerase chất xúc tác từ Takara (Nhật Bản, Kyoto) với chu kỳ có chương trình: biến tính 95 oC 20 giây, ủ 60oC 20s, độ giãn dài 72oC 30s, tổng cộng 35 chu kỳ 3.2 Chèn đoạn gen vào vector nhân Sản phẩm PCR cắt loại enzym cắt giới hạn PstI NcoI Sau sản phẩm tinh điện di Gel agarose 1,2% sử dụng lọc microcon 50 (Amicon) Đoạn DNA sản phẩm sau tinh chèn vào đoạn PstI-NcoI vectơ pKK233-2 (Pharmacia Amersham Biochem.), cuối tạo plasmid sản phẩm pKKAM Plasmid pKKAM biến nạp thành E coli JM109 3.3 Giải trình tự sản phẩm PCR Trình tự DNA xác định máy phân tích giải trình tự DNA (model 377 A, Perkin-Elmer) 3.4 Đưa gen nhân vào vectơ biểu Để tạo plasmid biểu khác, gen enzyme trưởng thành chèn vào plasmid pET21d (Novagen) có chứa promoter T7 Đầu tiên, pKKAM cắt PstI điền vào phân đoạn Klenow trước cắt NcoI Đoạn DNA gắn vào vectơ pET21d NcoI vị trí EcoRI Kết tạo plasmid biểu đặt tên pETAM 3.5 Biến nạp plasmid biểu vào E coli Plasmid pETAM chuyển vào E coli HB101 sau chuyển vào HMS174 (DE3) BL21 (DE3) 3.6 Tối ưu hóa biểu α-amylase Vi khuẩn phát triển 37oC môi trường chứa 2L LB-broth bổ sung 50 mg/ml ampicillin máy quay lắc 200 vòng/phút Isopropyl-β-δ thiogalactopyranoside (IPTG) thêm vào nồng độ cuối mM để cảm ứng biểu α-amylase Vũ Thu Hằng Vi khuẩn phát triển 200 vòng/phút 18 oC ngày Môi trường nuôi cấy ly tâm phần phía bị loại bỏ Các tế bào bị treo 50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl mM EDTA ly giải với 0,1 mg/ml enzyme lysozyme 30oC Các huyền phù hình cầu tách ly tâm (15.000 vịng/phút, 15 phút) phần phía sử dụng làm mẫu α-amylase Vũ Thu Hằng Hình Cấu trúc plasmid pET21d, pKKAM, pETAM với vị trí cắt giới hạn Đoạn gen amylase gồm 1,4kb chèn vào plasmid pKK232-2 Plasmid tạo pKKAM Plasmid pET21d có promoter lac pKKAM nhân pET21d, tạo pETAM IV KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Vũ Thu Hằng 4.1 Kết đặc tính α-amylase từ B amyloliquefaciens Các α-amylase thu từ B amyloliquefaciens chủng dại chủng đột biến tinh qua bốn bước phần 2.1 Sản lượng enzyme thấp Có thể số protease liên kết với enzyme Do đó, chất ức chế protease phenyl methlysulphonyl fluoride (PMFS) sử dụng Sau tinh sạch, enzyme cho thấy dải đơn gel điện di SDSpolyacrylamide Bảng Các số đặc tính α-amylase từ B amyloliquefaciens Đặc tính pH cao Tính ổn định pH o C cao Tính bền nhiệt Km (mg/ml) Vmax (U/ml) Phân tử khối Sản phẩm sau ly giải Số nguyên tử Ca liên kết với enzyme Ion kim loại hoạt hóa Chất đặc hiệu Chủng dại 6.0 5.0-8.0, 1h 55 69%, 40oC, 4h 1.92 351 52 kDa Glucose, maltose, maltotriose,… Chủng đột biến 6.0 5.0-8.0, 2h 55 70%, 50oC, 4h 3.74 401 52 kDa Glucose, maltose, maltotriose,… Mg, Ba Maltopentaose Mg Maltopentaose 4.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt động α-amylase từ B amyloliquefaciens Một số số loại enzym tinh thống kê cho thấy α-amylase đột biến có phạm vi pH nhiệt độ khác để kết thúc hoạt động ổn định khoảng từ đến pH sau h so với chủng dại (Bảng 1, hình 3) Độ pH tối ưu nhiệt độ tối ưu hai enzym 6,0 55oC Enzyme đột biến ổn định nhiệt (70% 50 oC giờ) so với loại tự nhiên Enzyme đột biến có độ ổn định cao so với loại tự nhiên pH điều kiện nhiệt độ Người ta thấy hai amylase hoạt động mạnh pH kiềm pH axit 10 Vũ Thu Hằng Hình Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt động enzyme 4.1.2 Kết động học enzyme Enzyme cho thấy động học kiểu Michaelis thủy phân tinh bột hòa tan Các loại amylase hoang dã đột biến có Km Vmax khác (Bảng1) 4.1.3 Các sản phẩm từ phản ứng thủy phân α-amylase Các sản phẩm sau phản ứng α-amylase từ tinh bột hòa tan maltooligosaccharides [23] Tác dụng enzym tinh bột hòa tan hai enzyme tuân theo mơ hình hoạt động, kể từ sản phẩm thủy phân tinh bột hòa tan hai amylase maltose sản phẩm chính, oligosaccharid malto nhỏ lượng nhỏ glucose (Hình 4) Enzyme đường hóa từ B subtilis tạo phần lớn glucose maltose từ tinh bột amylase dạng lỏng từ B amyloliquefaciens tạo chủ yếu maltosaccharid [24] Một số nhà nghiên cứu thu kết tương tự với chủng Bacillus khác [25,26] Hình Phân tích sắc ký lớp mỏng sản phẩm từ phản ứng thủy phân tinh bột hòa tan amylase chủng dại đột biến Glucose (G1), maltose (G2), maltotriose (G3), maltotetraose (G4), maltopentaose (G5), maltohexaose (G6) maltoheptaose (G7) 4.1.4 Phân tử khối enzyme Trọng lượng phân tử enzym ước tính vào khoảng 52 kDa điện di gel SDS-polyacrylamide 4.1.5 Số lượng nguyên tử Canxi cấu trúc enzyme α-amylase Tất amylase canxi metalloenzyme [27] Các nguyên tử Canxi liên kết chặt chẽ với phân tử enzyme, chúng có ảnh hưởng lớn đến cấu tạo tính ổn định enzyme [28] Người ta thấy amylase B amyloliquefaciens chủng dại chứa ion Ca2+ enzyme đột biến tiếp nhận hai ion Đây lý giải thích cho việc enzym từ chủng 11 Vũ Thu Hằng đột biến chịu nhiệt độ cao so với chủng dại Vì canxi có ảnh hưởng đến ổn định enzyme 4.1.6 Cơ chất tạo độ đặc hiệu tốt Độ đặc hiệu chất amylase cho thấy maltopentaose chất tốt αAmylase chủng đột biến cho thấy khác biệt với loại hoang dã amylase hoạt động tích cực chất lớn amylopectin tinh bột hòa tan chứa mối liên kết α-1,6 1,4 glycosidic 4.1.7 Ion hoạt hóa ion ức chế Hoạt động amylase tăng tốc số kim loại ion (Bảng 2) mM ion kim loại hiệu mM Mg, Ba Cu kích thích hoạt động chủng dại, có Mg có hiệu với chủng đột biến Hg, Fe, Zn Ag chất ức chế mạnh hoạt động hai loại enzym Bảng Hiệu ion kim loại khác hoạt động của α-amylase từ B.amyloliquefaciens (% hoạt động) Chủng dại None MgSO4 CaCl2 LiSO4 CuSO4 Ba(C2H3O2)2 HgCl2 MnSO4 AgNO3 FeCl2 ZnSO4 1mM 100 101 95 98 104 104 98 26 11 12 5mM 100 109 103 97 95 103 0.0 100 12 10 12 Chủng đột biến 1mM 5mM 100 100 100 103 85 105 71 103 69 78 77 104 0.0 0.0 85 103 25 20 0.0 10 4.2 Kết biểu α-amylase từ B amyloliquefaciens E coli Gen α-amylase B amyloliquefaciens chủng dại biểu E coli Plasmid pKKAM khuếch đại PCR trình tự nucleotide DNA đoạn 1452 cặp bazơ có chứa amylase trưởng thành gen xác định Kết cho thấy gen α-amylase chủng dại từ B amyloliquefeciens tương tự với gen α-amylase tái tổ hợp B amyloliquefaciens Hai plasmid biểu pKKAM pETAM xây dựng thành cơng (Hình 2) Để thu hệ thống biểu mức độ cao tạo protein tái tổ hợp đồng nhất, vùng peptit tín hiệu xóa Enzyme tái tổ hợp biểu E coli Hoạt động enzyme điều hòa Lac Zpo Plasmid pETAM chuyển vào chủng vi khuẩn HMS174 (DE3) 12 Vũ Thu Hằng BL21 (DE3) Ba chủng E coli sử dụng cho hệ thống biểu so sánh với Vi khuẩn nuôi môi trường LB IPTG sử dụng làm chất cảm ứng để thể α-amylase gen promoter trc pKKAM promoter T7 pETAM Vi khuẩn tạo α-amylase hiệu sau giai đoạn tăng trưởng tĩnh Hoạt động enzym xác định sau ly giải chủng E coli lysozyme Bảng So sánh lượng enzyme α-amylase protn biểu dịng E.coli khác 18oC Chủng gốc HB101 HMS174 BL21 JM109 Hoạt động enzyme (U/ml) 30100 11195 8500 4857 6774 Protein (mg/ml) 0.96 1.2 1.8 0.61 1.5 Hoạt độ đặc hiệu (U/mg) 31354 9329 4722 7962 4496 Bảng cho thấy hoạt động cụ thể JM109 HMS174 chủng thấp chủng khác Chủng HB101 tạo lượng enzyme protein nhiều khoảng 2,5 lần so với Chủng BL21, hoạt tính cụ thể khơng cao Vi khuẩn phát triển 30oC, nhiệt độ không hiệu cho trình sản xuất enzyme Hoạt động enzym 95% sản xuất 18oC Vì lý này, chủng HB101 chủng ni 18oC để sản xuất enzyme Sau ly giải vi khuẩn, hoạt động enzym tái tổ hợp nhiều lần so với chủng gốc Hoạt động enzyme chủng gốc cao 70% so với chủng HB101 Tại hoạt động enzym biểu vừa phải HB101 không phát Mức độ biểu chủng JM103 (pUC-8) thấp nhiệt độ cao (ở 42 8C) [5] 13 Vũ Thu Hằng KẾT LUẬN Nghiên cứu thành công tạo tinh chủng B Amyloliquefaciens đột biến mà α-amylase có đặc điểm khác biệt với chủng dại như: pH, nhiệt độ, độ ổn định, Km Vmax liên kết với ion Canxi, khả thủy phân hạt tinh bột từ nguồn thực vật khác (khoai tây, khoai lang, ngơ, lúa mì gạo) thử nghiệm có kết ban đầu  Một enzyme tái tổ hợp tạo thành công thông qua khuếch đại PCR biểu dòng E Coli khác promoter trc T7  14 Vũ Thu Hằng Tài liệu tham khảo Elif Sarikaya Demirkan, Bunzo Mikami, Motoyasu Adachi, Takahiko Higasa, Shigeru Utsumi α-Amylase from B amyloliquefaciens: Purification, characterization, raw starch degradation and expression in E coli Process Biochemistry, Volume 40, Issue 8, July 2005, Pages 2629-2636 1] Uhling H, Industrial enzymes and their applications Translated and update by Elfried M Linsmaier-bednar, Ph.D New York; 1998 [2] Uguru GC, Robb DD, Akinyanju JA, Sani A Purification, characterization and mutagenic enhancenment of a termoactive alpha-amylase from Bacillus subtilis J Indust Microbiol Biotech 1997;19:273–9 [3] Bolton DJ, Kelly CT, Fogarty WM Purification and characterization of the alpha-amylase of Bacillus flavothermus Enzyme Microbial Technol 1997;20:340–3 [4] Dey N, Soni R, Soni SK A novel thermostable alpha-amylase from thermophilic Bacillus sp SN-1 and its application in the liquefaction of sorghum starch for ethanol fermentation Asian J Microbiol Biotech Environ Sci 2002;4:59–164 [5] Suominen I, Karp M, Lahde M, Kopio A, Glumoff T, Meyer P, et al Extracellular production of cloned a-amylase by E.coli Gene 1987; 61:165–76 [6] Kallio P, Ulmanen I, Palva Isolation and characterization of a 2.2-kb operon preceding the a-amylase gene of B amyloliquefaciens Eur J Biochem 1986;158:497–504 [7] Hyun HH, Zekius JG Biochemical characterization of thermostable extracellular b-amylase from Clostridium thermosulfurogenes Appl Environ Microbiol 1985;49:1162–7 [8] Jespersen HM, MacGregor EA, Sierks MR, Svensson B Comparison of the domain-level organisation of starch hydrolyses and related enzymes Biochem J 1991;280:51–5 [9] Friedman RB Biotechnology of amylodextrin oligosaccharides In: Priest FG, Stark JR, editors Starch-hydrolyzing enzymes with novel properties 1991 [chapter 6] [10] Sarikaya E Obtaining a-amylase producing mutants from some bacillus strains using mutagenic agents Biotechnology 1999;22:27– 34 [in Turkish] [11] Sarikaya E, Gurgun V Investigation of relationship between amylase and protease production and production of Bacillus a-amylase in the rich media of carbon/nitrogen Kukem J 1998;21:49–54 [in Turkish] [12] Yoo YJ, Hong J, Hatch RT Comparison of a-amylase activities from different assay methods Biotechnol Bioeng 1987;147–51 [13] Bradford MM A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of proteindye binding Anal Biochem 1976;72:248–54 [14] Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 1970;227:680–5 [London] [15] Berfeld P Amylases a and b Methods Enzymol 1955;1:149–58 [16] Sarikaya E, Higasa T, Adachi M, Mikami B Comparison of the abilities of a-and b- amylases to degrade raw starch granules Process Biochem 2000;35:711–5 [17] Maeda HM, Long SR, Ruvkun CB, Brown SE, Ausulbel FM Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhiobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis J Bacteriol 1982;149:114–22 [18] Silhavy TJ, Berman ML, Enquist LW Experiments with gene fusion Cold Spring Harbor Laboratory NY: Cold spring Harbor, 1984 [19] Yuuki T, Nomura T, Tezuka H, Tsuboi A, Yamagata H, Tsukagoshi N, et al Complete nucleotide sequence of a gene coding for heat and pHstable a-amylase of B licheniformis: comparison of the amino acid sequences of three bacterial liquefying a-amylase deduced from the DNA sequences J Biochem 1985;98:1147–56 [20] Dobreva E, Ivanova V, Emanuliova E Effect of temperature on some characteristics of the thermostable a-amylase from B licheniformis World J Microbiol Biotechnol 1994;10:547–50 [21] Saito N A thermophilic extracellular from B licheniformis Arch Biochem Biophys 1973;15:290–8 [22] Ogasahara K, Imanishi A, Isemura T Studies on thermophilic aamylase from B stearothermophilus I Some general and physiochemcal properties of thermophilic a-amylase J Biochem 1970;67:65–75 [23] Matsuzaki H, Yamane K, Yamaguchi K, Nagata Y, Maruo B Hybrid a-amylases produced by transformants of Bacillus subtilis I Purification and characterization of extracellular amylases produced by the parental strains and transformants Biochim Biophys Acta 1974; 365:235–47 [24] Morgan FJ, Priest FG Characterization of a thermostable a-amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 J Appl Bacteriol 1981;50:107–14 [25] Kanno MA Bacillus acidocaldorius a-amylase that is highly stable to heat under acidic conditions Agric Biol Chem 1986;50:23–31 [26] Takasaki Y An amylase producing maltotriose from B subtilis Agric Biol Chem 1985;49:1091–7 [27] Priest FG Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus Bacteriol Rev 1977;41:711–53 [28] Vihinen M, Maăntsaălaă P Characterization of a thermostable B stearothermophilus a-amylase Biotechnol Appl Biochem 1990;12:427–35 15 Vũ Thu Hằng ... nghệ sinh học Việt Nam coi hướng phát triển mũi nhọn nhiều nước Trong có trọng đầu tư cho lĩnh vực công nghệ enzyme Trong cơng nghệ enzyme tái tổ hợp hướng Có nhiều loại enzyme tái tổ hợp nghiên... xuất enzyme Hoạt động enzym 95% sản xuất 18oC Vì lý này, chủng HB101 chủng ni 18oC để sản xuất enzyme Sau ly giải vi khuẩn, hoạt động enzym tái tổ hợp nhiều lần so với chủng gốc Hoạt động enzyme. .. α-amylase tái tổ hợp B amyloliquefaciens Hai plasmid biểu pKKAM pETAM xây dựng thành cơng (Hình 2) Để thu hệ thống biểu mức độ cao tạo protein tái tổ hợp đồng nhất, vùng peptit tín hiệu xóa Enzyme tái