BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ T[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN MÃ HĨA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ THỐNG NẤM MEN Pichia pastoris Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Thạc sĩ Nguyễn Xuân Đồng Sinh viên thực MSSV: 1051110247 : Phan Vũ Hải Yến Lớp: 10DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các nội dung nghiên cứu kết đề tài trung thực chưa công bố cơng trình trước Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng năm 2014 Sinh viên thực Phan Vũ Hải Yến LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy kiến thức truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt năm đại học Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Hai người kính mến hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập hồn thành ḷn văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Th.S Nguyễn Xuân Đồng K.S Lê Thị Huỳnh Trâm tạo điều kiện, giúp đỡ kiến thức chuyên môn tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị phịng Cơng nghệ Vi sinh - Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện hỗ trợ tơi kinh phí thiết bị để tơi thực đề tài Tơi cảm ơn bạn nhóm ESS ln cổ vũ động viên tơi lúc khó khăn để vượt qua hoàn thành tốt luận văn Và cuối cùng, hết, từ đáy lòng cảm ơn ba mẹ sinh con, nuôi dạy khôn lớn, bên nguồn động viên to lớn con, tạo điều kiện tốt tinh thần vật chất suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành ḷn văn Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng năm 2014 Phan Vũ Hải Yến Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC HÌNH vii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Mục đích nghiên cứu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứuc CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Cấu tạo lignocellulose 2.1.1 Cellulose 2.1.2 Hemicellulose 2.1.3 Lignin 2.2 Enzyme cellulase 2.2.1 Phân loại enzyme 2.2.2 Cơ chế tác dụng cellulase 2.2.3 Vi sinh vật sản xuất cellulase 10 2.3 Phức hợp cellulosome vi khuẩn Clostridium thermocellum 11 2.3.1 Tổng quan vi khuẩn Clostridium thermocellum 11 2.3.2 2.4 Đặc điểm phức hệ cellulosome 12 Hệ thống biểu Pichia pastoris 14 2.4.1 Đặc điểm hệ thống biểu Pichia pastoris 14 2.4.2 Tích hợp gen ngoại lai vào P pastoris 14 2.4.3 Ưu điểm hệ thống biểu Pichia pastoris 15 i Đồ án tốt nghiệp 2.5 Các nghiên cứu nước tạo dòng gen từ Clostridium thermocellum 16 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu: 19 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu: 19 3.1.2 Thời gian nghiên cứu: 19 3.2 Nguyên liệu 19 3.2.1 Chủng vi sinh vật 19 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 19 3.2.3 Hóa chất 20 3.2.4 Môi trường 22 3.2.4.1 Môi trường LB (Luria-Bertani): 22 3.2.4.2 Môi trường MD (Minimal Dextrose): 22 3.2.4.3 Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) 22 3.2.4.4 Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex): 22 3.2.4.5 Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC 23 3.2.5 Plasmid 23 3.2.5.1 Plasmid pJET1.2/blunt 23 3.2.5.2 Plasmid pPIC9K 24 3.2.6 Các cặp mồi sử dụng 25 3.3 Phương pháp nghiên cứu: 26 3.3.1 Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD Clostridium thermocellum 26 3.3.1.1 Thiết kế mồi 26 ii Đồ án tốt nghiệp 3.3.1.2 Thu nhận gen CelD vi khuẩn C thermocellum phản ứng PCR dựa vào cặp mồi thiết kế .27 3.3.1.3 Quy trình tinh gen theo MEGAquick – spin Total Fragment DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy 28 3.3.1.4 Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt 28 3.3.1.5 Chuẩn bị tế bào E coli DH5α khả nạp .29 3.3.1.6 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ phương pháp hóa biến nạp 30 3.3.1.7 Kiểm tra dòng biến nạp PCR khuẩn lạc 31 3.3.1.8 Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E coli 32 3.3.1.9 Kiểm tra dòng biến nạp enzyme cắt giới hạn 33 3.3.1.10 Xác định trình tự gen so sánh trình tự gen thu với trình tự tương ứng GenBank 34 3.3.2.Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD 34 3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp phản ứng cắt giới hạn 34 3.3.2.2 Quy trình tinh gen plasmid theo MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction System – INTRON 35 3.3.2.3 Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD 36 3.3.2.4 Chuẩn bị tế bào E coli DH5α khả nạp .36 3.3.2.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E coli DH5α 36 3.3.2.6 Kiểm tra dòng biến nạp phản ứng PCR khuẩn lạc 37 3.3.2.7 Kiểm tra dòng biến nạp enzyme cắt giới hạn 37 3.3.2.8 Xác định trình tự gen so sánh trình tự gen thu với trình tự tương ứng GenBank 38 iii Đồ án tốt nghiệp 3.3.3 Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D 38 3.3.3.1 Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp 39 3.3.3.2 Phương pháp điện biến nạp 39 3.3.3.3 Chọn lọc dòng Pichia pastoris mang nhiều gen CelD có khả năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D .40 3.3.3.4 Phương pháp ly trích DNA tổng số .40 3.3.3.5 Kiểm tra dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu phương pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 41 3.3.5 Định tính khả sinh enzyme cellulase dòng P pastoris tái tổ hợp 42 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD Clostridium thermocellum 43 4.1.1 Khuếch đại gen CelD kĩ thuật PCR 43 4.1.2 Tạo dòng E coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD 44 4.1.3 Kiểm tra thể biến nạp PCR khuẩn lạc 45 4.1.4 Phân tích plasmid tái tổ hợp phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR enzyme cắt giới hạn 46 4.1.5 Kiểm tra dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2-CelD giải trình tự 48 4.2.1 Kiểm tra thể biến nạp PCR khuẩn lạc 52 4.2.2 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR enzyme cắt giới hạn SnaBI EcoRI 53 4.2.3 Kiểm tra dòng E coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K – CelD giải trình tự 55 iv Đồ án tốt nghiệp 4.3 Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD 57 4.3.1 Biến nạp plasmid pPIC9K – CelD vào chủng Pichia pastoris GS115 58 4.3.2 Sàng lọc tế bào nấm men mang gen mã hóa cho endoglucanase D 59 4.3.3 Kiểm tra dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu phương pháp PCR với mồi AOX1F/ AOX1R 60 4.3.4 Định tính khả sinh enzyme cellulase dòng P pastoris tái tổ hợp 62 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 5.1 Kết luận 65 5.2 Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO .66 PHỤ LỤC v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AOX Alcohol oxydase BMGY Buffered Glycerol-complex BMMY Buffered Methanol-complex bp Base pair CBD Cellulose binding domain CMC Carboxymethyl-cellulose dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Kb kilo base LB Luria-Bertani MD Minimal Dextrose Mut Methanol Utilisation NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus aquaticus TAE Tris – acetate – EDTA TE buffer Tris EDTA buffer YNB Yeast Nitrogen Base YPD Yeast Extract Peptone Dextrose vi Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Tỉ lệ thành phần lignocellulose Hình 2.2 Lignocellulose .4 Hình 2.3 Cấu trúc phân tử Cellulose Hình 2.4 Cấu trúc cellulose Hình 2.5 Hemicellulose Hình 2.6 Lignin Hình 2.7 Quá trình phân giải cellulose enzyme cellulase Hình 2.8 Clostridium thermocellum 11 Hình 2.9 Cơ chế hoạt động Cellulosome 12 Hình 3.1 Thang DNA Kb 21 Hình 3.2 Plasmid pJET 1.2 .24 Hình 3.3 Plasmid pPIC9K 25 Hình 3.4 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR .27 Hình 3.5 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R 32 Hình 3.6 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/ AOX1R .37 Hình 3.7 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 41 Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD .43 Hình 4.2 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2CelD mơi trường LB/ Ampicillin (50 µg/ml) 444 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định dòng E coli DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R 45 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid pJET1.2-CelD enzyme SnaBI EcoRI sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR 46 Hình 4.5 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5𝛼 chứa pPIC9K-CelD mơi trường LB/ ampicillin (50 µg/ml) .51 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định dòng E coli DH5α/pPIC9K-CelD với cặp mồi AOX1F/AOX1R 52 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi CelDF/ CelDR sản phẩm cắt pPIC9K-CelD SnaBI EcoRI 53 Hình 4.8 Kết blast trình tự protein trình tự plasmid pPIC9K-CelD NCBI 56 Hình 4.9 Sàng lọc thể biến nạp P pastoris GS115 chứa pPIC9K-CelD 58 Hình 4.10 Sàng lọc tế bào P pastoris mang gen CelD môi trường YPD/ G418 .60 Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra sát nhập plasmid pPIC9K-CelD vào gen P pastoris GS115 61 Hình 4.12 Vịng phân giải CMC dịng Pichia pastoris tái tổ hợp nhuộm với thuốc đỏ Congo 63 viii Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng có trình tự sau: .26 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR 27 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2 29 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R .31 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI EcoRI 33 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K pJET1.2-CelD với SnaBI EcoRI .35 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng nối CelD vào vector biểu pPIC9K 36 Bảng 3.8 Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD SnaBI EcoRI 38 Bảng 4.1 Đường kính vịng phân giải CMC chủng P pastoris tái tổ hợp 64 ix Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: Ethanol dung mơi quan trọng cơng nghiệp hóa học công nghệ sản xuất thực phẩm Gần đây, ethanol coi nhiên liệu có khả tái tạo, thay phần cho nguồn nhiên liệu hoá thạch ngày cạn kiệt than đá, dầu mỏ tương lai Hiện 98% ethanol sản xuất từ ngũ cốc nguyên liệu thực phẩm Điều gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến tình hình an ninh lương thực giới Trong đó, sản xuất nơng nghiệp hàng năm sinh lượng lớn phụ phế phẩm rơm rạ, cám mì, trấu, bã mía,…Việc tận dụng nguồn chất thải để sản xuất ethanol sinh học giảm khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên dần cạn kiệt mà cịn giảm nhiễm mơi trường Tuy nhiên việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu tái sinh cịn gặp nhiều khó khăn sản xuất quy mô công nghiệp Trong công nghệ sản xuất cồn sinh học, hai hướng để thủy phân cellulose phương pháp hóa học sinh học Trong thủy phân hóa học, cellulose bị phân hủy thành đường đơn tác dụng H2SO4 nhiệt độ cao Cơng nghệ có hiệu suất cao độc hại phức tạp, ảnh hưởng xấu đến mơi trường người Chính vậy, hướng ứng dụng enzyme để thủy phân cellulose hướng nghiên cứu mới, hứa hẹn đem đến đột phá mặt công nghệ Enzyme cellulase enzyme ảnh hưởng trực tiếp đến trình thủy phân cellulose thành glucose – nguyên liệu sản xuất cồn sinh học Tuy nhiên, việc sử dụng chúng hạn chế chi phí sản xuất enzyme cellulase cao hiệu suất chuyển hóa chất thấp Nguyên nhân trình thu nhận enzyme trực tiếp từ vi sinh vật tốn nhiều thời gian cơng sức, khó thực quy mô công nghiệp, enzyme khơng có đủ đặc tính mong muốn Chính thế, ứng dụng tiến kỹ thuật di truyền vào việc sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp hướng nghiên cứu tiềm để thu nhận enzyme với sản lượng lớn Đồ án tốt nghiệp Hiện giới có nghiên cứu hệ enzyme phân hủy cellulose cellulosome vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt Clostridium thermocellum Hướng biểu hệ cellulosome tái tổ hợp để thu nhận số lượng lớn cellulosome có chức phân giải cellulose coi hướng có tiềm công nghệ sản xuất cồn từ cellulose Trên sở đề tài: “Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum hệ thống nấm men Pichia pastoris” tiến hành Kết đề tài tiền đề cho nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân hủy cellulose từ nguồn phụ phế phẩm nông – lâm nghiệp ứng dụng để sản xuất cồn sinh học với giá thành hợp lý 1.2 Mục đích nghiên cứu đề tài Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D từ vi khuẩn Clostridium thermocellum 1.3 Nội dung nghiên cứu: - Thu nhận gen mã hóa endoglucanase D (CelD) từ Clostridium thermocellum phản ứng PCR - Tạo dòng tế bào E coli DH5𝛼 mang plasmid nhân dòng tái tổ hợp chứa gen CelD - Tạo dòng E coli DH5𝛼 mang vector biểu pPIC9K chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D - Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Cấu tạo lignocellulose Lignocellulose hợp chất hữu phổ biến tự nhiên Hàng năm sản lượng sinh khối thực vật Trái Đất khoảng 200 tỉ tấn, 90% lignocellulose (Himmel cộng sự, 2007) Việc chuyển hóa lignocellulose khơng quan trọng vịng tuần hồn vật chất mà ảnh hưởng đến việc tái hồi dinh dưỡng cho Lignocellulose thành phần cấu trúc thực vật thân gỗ số thực vật khác cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, lignocellulose chủ yếu có phụ phế phẩm nơng nghiệp, sản phẩm phụ công nghiệp sản xuất giấy chất thải rắn,…Về thành phần cấu tạo, lignocellulose gồm cellulose, hemicellulose lignin Số lượng loại polymer thay đổi tùy loài, tuổi phận khác Hình 2.1 Tỉ lệ thành phần lignocellulose Nguồn: Pérez cộng (2002) Với thành phần cellulose, lignocellulose nguồn nguyên liệu tiềm cho sản xuất cồn sinh học Tuy nhiên hợp chất khó phân hủy điều kiện tự nhiên có cấu trúc đa dạng phức tạp, bao gồm thành phần có độ polymer hóa cao liên kết với cách chặt chẽ Do muốn phân hủy chúng, cần phải có hệ enzyme chuyên biệt, đòi hỏi hệ vi sinh vật có khả tổng hợp hệ enzyme để phân hủy chúng (Himmel cộng sự, 2007) Đồ án tốt nghiệp Các mạch cellulose tạo thành sợi bản, sợi gắn lại với nhờ hemicellulose, tạo thành cấu trúc vi sợi Hemicellulose lignin bao bọc xung quanh vi sợi, tạo nên cấu trúc vững chắc, bảo vệ cellulose khỏi công enzyme hóa chất khác q trình thủy phân (Charles E Wyman, 1996) Hình 2.2 Lignocellulose Nguồn: Joseleau cộng (1992) 2.1.1 Cellulose Cellulose thành phần polymer phổ biến tự nhiên, chiếm 50% lượng sinh khối thực vật, giúp mơ thực vật có độ bền học tính đàn hồi Thành phần cellulose thường không quan khác thực vật Người ta thấy rằng, lượng cellulose nhiều thân Cellulose chiếm đến 90% sợi bông, 50% gỗ, 40 – 50% bã mía, 35 – 40% rơm lúa mỳ lúa gạo (Sloneker, J H., 1971; Nguyễn Đức Lượng cộng sự, 2012) Cellulose chất rắn màu trắng, khơng mùi vị, có độ bền nhiệt cao, không tan nước dung môi thông thường (rượu, ete, benzen,…) tan dung dịch Schweitzer (dung dịch Cu(OH)2 NH3) Cellulose bị phân hủy mạnh tác dụng số dung dịch axit vô mạnh như: HCl, H2SO4,… tương đối yếu với axit hữu (axit acetic, axit formic,…) bền vững tác dụng kiềm (Nguyễn Văn Lân, 2004) Đồ án tốt nghiệp Cellulose polysaccharide có cơng thức cấu tạo (C6H10O5)n, trọng lượng phân tử khoảng từ 50.103 đến 2,5.106 Da, gồm từ 5000 đến 14000 gốc β - D glucose nối lại với liên kết 𝛽 – 1,4 glucoside tạo thành dạng chuỗi Các phân tử cellulose liên kết với nhờ lực hút Van der Waals liên kết hidro tạo thành cấu trúc dạng sợi bền vững Hình 2.3 Cấu trúc phân tử Cellulose Nguồn: Gardner cộng (1974) Cellulose có cấu trúc sợi dài, đường kính khoảng nm Nhiều sợi liên kết song song với thành chùm nhờ liên kết hidro nhóm OH, tạo thành vi sợi Trong tự nhiên, vi sợi không đồng nhất, chúng thường tồn vùng: - Vùng kết tinh: có cấu trúc trật tự cao, chặt chẽ tinh thể, chiếm khoảng ¾ cấu trúc cellulose (Taiz cộng sự, 2006) Các mạch cellulose liên kết với nhờ liên kết hidro nhóm hydroxyl mạch với nhóm hydroxyl mạch khác, tạo thành mạng lưới liên kết hydro dày đặc, ngăn cản tác động enzyme điều kiện bình thường - Vùng vơ định hình: mạch liên kết với nhờ lực Van der Waals vùng có cấu trúc không chặt dễ bị tác động yếu tố bên (Charles E Wyman, 1996) Khi gặp nước, chúng dễ bị trương lên, tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme cellulase công dễ dàng, làm thay đổi toàn cấu trúc chúng Tuy vậy việc thủy phân cellulose đạt hiệu cao tách cellulose khỏi thành phần khác cấu tạo nên màng tế bào thực vật (Tô Kim Anh cộng sự, 2010) Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4 Cấu trúc cellulose Nguồn: Hsu cộng (1980) 2.1.2 Hemicellulose Hemicellulose hợp chất polysaccharide chiếm tỷ lệ lớn giới sau cellulose Đây polysaccharide phức tạp, có phân tử khối nhỏ nhiều so với cellulose Chúng cấu tạo từ gốc đường khác arabinose, galactose, glucose, mannose xylose Các gốc đường liên kết với thông qua liên kết 𝛽 – 1,4 glucoside, 𝛽 – 1,3 glucoside 𝛽 – 1,6 glucoside tạo thành cấu trúc dạng mạch nhánh Sự phân nhánh cấu trúc hemicellulose tạo điều kiện thuận lợi cho dung môi chất hóa học cơng Cấu trúc hemicellulose khơng bền, dễ bị phân hủy acid loãng kiềm Khi bị phân hủy, hemicellulose tạo thành monosaccharide (Nguyễn Đức Lượng cộng sự, 2012) Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5 Hemicellulose Nguồn: Fengel Wegener (1989) 2.1.3 Lignin Lignin hợp chất cao phân tử có nhiều thực vật bậc cao (cả thực vật hạt trần thực vật hạt kín) Hàm lượng thành phần lignin thay đổi theo tế bào, mơ theo nhóm thực vật, gỗ, lignin chiếm từ 20 – 30% Lignin có nhiệm vụ kết dính tăng độ bền học cho tế bào, tăng khả chống thấm nước, ngăn chặn độc tố xâm nhiễm vi sinh vật đồng thời cản trở tiếp xúc enzyme cellulase với cellulose (Odier cộng sự, 1992; Nguyễn Đức Lượng cộng sự, 2012) Do vậy phân hủy lignin tạo điều kiện cho thủy phân hiệu cellulose Các nghiên cứu cho thấy có tỉ lệ thuận mức độ lignin bị phân hủy mức độ thủy phân cellulose ( Kim cộng sự, 2006) Hình 2.6 Lignin Nguồn: J Pérez cộng (2002) Đồ án tốt nghiệp Lignin có cấu tạo vơ định hình, kị nước bền với tác nhân phân giải hóa học sinh học Dưới tác dụng bisulfite natri H2SO4, lignin bị phân giải tạo hợp chất thơm Đây hợp chất tạo thành từ ngưng tụ loại rượu khác nhau, có ba loại rượu conyferylic, synafilic courmarylic Các loại rượu liên kết với liên kết C – C C – O 2.2 Enzyme cellulase 2.2.1 Phân loại enzyme Cellulase enzyme sinh từ nhiều sinh vật khác nấm mốc, vi khuẩn, thực vật,…có khả thủy phân cellulose Cellulase tồn dạng enzyme đơn phức hệ enzyme gọi cellulosome Dựa vào chế thủy phân cellulose, enzyme cellulase Wood Mc Cral (1979) chia làm nhóm chủ yếu : endoglucanase, exoglucanase 𝛽 – glucosidase - Endoglucanase hay 1,4 𝛽 – D – glucanohydrolase (EC 3.2.1.4): enzyme tham gia phân giải liên kết 𝛽-1.4 glucoside cellulose Sản phẩm trình phân giải cellodextrin, cellobiose glucose Chúng tham gia tác động mạnh đến cấu trúc cellulose vơ định hình tác dụng yếu đến cấu trúc cellulose kết tinh - Exoglucanase hay 1,4 𝛽 – D – glucan – cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91): cắt đầu không khử chuỗi cellulose giải phóng cellobiose Enzyme khơng có khả phân giải cellulose dạng kết tinh mà làm thay đổi tính chất hóa lý chúng, giúp cho enzyme endoglucanase phân giải chúng - 𝛽 – D – glucoside glucohydrolase hay 𝛽 – glucosidase (EC 3.2.1.21): enzyme có tác dụng thủy phân cellobiose cellodextrine tan tạo thành D – glucose Chúng khơng có khả phân hủy cellulose ngun thủy Ba enzym xúc tác cho giai đoạn nối tiếp phụ thuộc lẫn trình thủy phân cellulose thành glucose (Cullen cộng sự, 1992) ... sản xuất cồn từ cellulose Trên sở đề tài: ? ?Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum hệ thống nấm men Pichia pastoris? ?? tiến... - Tạo d? ?ng tế bào E coli DH5