Đồ án tốt nghiệp thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens sh1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH1 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Ts Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực : Nguyễn Thị Tâm MSSV: 1051110142 Lớp: 10DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2014 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đồ án kết nghiên cứu em, tiến hành phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học thuộc khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Đại học Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Các kết quả, số liệu đồ án hoàn tồn trung thực, chưa có cơng bố Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thị Tâm Đồ án tốt nghiệp Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy cô Trường Đại Học Công Nghệ TpHCM, đặc biệt Thầy cô Khoa Môi trường Công nghệ sinh học tận tình dạy bảo cho em bao năm qua, trang bị cho em kiến thức quý giá tạo dựng cho em nhiều kinh nghiệm suốt trình học tập Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Nguyễn Hồi Hương, Cơ bên cạnh giúp đỡ bảo, hướng dẫn cho em suốt trình triển khai nghiên cứu hoàn thành đề tài tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy phịng thí nghiệm tạo điều kiện cung cấp hóa chất để em thực thí nghiệm Và cuối em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân ln bên em động viên, ủng hộ em suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Kiến thức nhiều hạn chế, chắn không tránh khỏi sai sót, em mong thơng cảm góp ý chân thành thầy bạn Xin chân thành cảm ơn! Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thị Tâm Đồ án tốt nghiệp Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 Đặt vấn đề Mục đích để tài Mục tiêu, nhiệm vụ đề tài Nội dung đề tài Phƣơng pháp xử lí số liệu Các kết đạt đƣợc đề tài CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu thuốc bảo vệ thực vật sinh học 2.1.1 Khái niệm phân loại 2.1.2 Ứng dụng tuyến trùng diệt sâu 2.1.3 Ứng dụng vi khuẩn diệt sâu 2.2 Mối quan hệ vi khuẩn tuyến trùng EPN 2.2.1 Vai trò vi khuẩn cộng sinh tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn 10 2.2.2 Vi khuẩn cộng sinh tạo độc tố diệt côn trùng 11 2.3 Giới thiệu Serratia marcescens 12 2.3.1 Lịch sử phát Serratia marcescens 12 2.3.2 Phân loại Serratia marcescens 13 2.3.3 Đặc điểm sinh lí 13 2.3.4 Đặc điểm sinh hóa 14 2.3.5 Đặc điểm phân bố 17 2.3.6 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 19 2.4 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp Serratia marcescens 20 2.4.1 Sắc tố 20 2.4.2 Enzyme 21 2.4.3 Biosurfactants 22 2.5 Khả diệt sâu Serratia marcescens 23 2.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men thu sinh khối 25 2.6.1 Quá trình lên men 25 2.6.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng điều kiện lên men 27 i Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng 29 2.6.2.2 Ảnh hƣởng điều kiện lên men 30 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 32 3.2 Vật liệu – môi trƣờng – thiết bị sử dụng nghiên cứu 32 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 32 3.2.2 Môi trƣờng 32 3.2.3 Hóa chất 32 3.2.4 Dụng cụ 33 3.2.5 Thiết bị 33 3.3 Phƣơng pháp luận 34 3.4 Bố trí thí nghiệm 34 3.5 Phƣơng pháp khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh chủng SH1 38 3.5.1 Phƣơng pháp quan sát hình thái sinh lý 38 3.5.2 Thử nghiệm sinh hóa định danh chủng SH1 Kit API 20E 39 3.5.3 Thử nghiệm hoạt tính enzyme 42 3.6 Phƣơng pháp khảo sát môi trƣờng nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 42 3.6.1 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng môi trƣờng Nutrient broth 43 3.6.2 Xác định nguồn Nitơ tốt cho phát triển Serratia marcescen SH1 44 3.6.3 Xác định nguồn Cacbon tốt phát triển Serratia marcescens SH1 45 3.7 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy S marcescens SH1 46 3.7.1 Khảo sát ảnh hƣởng pH lên phát triển S marcescensSH1 47 3.7.2 Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện oxy lên phát triển S marcescens SH1 47 3.7.3 Khảo sát ảnh hƣởng mật độ cấy giống lên phát triển S marcescens SH1 47 ii Đồ án tốt nghiệp 3.7.4 3.7.5 Khảo sát ảnh hƣởng việc bổ sung đệm lên phát triển S marcescens SH1 48 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng S marcescens SH1 môi trƣờng mớivà điều kiện nuôi cấy 49 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BỆNH LUẬN 4.1 Kết quan sát hình thái sinh lý thử nghiệm hóa sinh 50 4.1.1 Quan sát hình thái, sinh lý 50 4.1.2 Kết hóa sinh với Kit API 20E 51 4.1.3 Kết thử nghiệm enzyme 53 4.2 Kết khảo sát môi trƣờng nuôi cấy S marcescens SH1 56 4.2.1 Đƣờng cong tăng trƣởng môi trƣờng Nutrient broth 56 4.2.2 Ảnh hƣởng nguồn Nito lên phát triển S marcescens SH1 57 4.2.3 Ảnh hƣởng nguồn Cacbon lên phát triển S marcescens SH1 58 4.3 Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy S marcescens SH1 59 4.3.1 Ảnh hƣởng pH lên phát triển S marcescens SH1 59 4.3.2 Ảnh hƣởng điều kiện Oxy phát triển S marcescens SH1 61 4.3.3 Ảnh hƣởng mật độ cấy giống lên phát triển S marcescens SH1 62 4.3.4 Ảnh hƣởng việc bổ sung đệm lên phát triển S marcescens SH1 63 4.3.5 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng S marcescens SH1 môi trƣờng điều kiện nuôi cấy 65 CHƢƠNG 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 5.2 Kết 69 Kiến nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG PHỤ LỤC B: XỬ LÝ THỐNG KÊ iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Một số đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens 15 Bảng 2.2 Đặc điểm loài thuộc chi Serratia 16 Bảng 2.3 Tỉ lệ loài Serratia phân lập đƣợc từ môi trƣờng khác 18 Bảng 2.4 Tỉ lệ chủng Serratia marcescens phân lập đƣợc từ môi trƣờng khác 18 Bảng 3.1 Các tiêu định danh S marcescens SH1 Kit API 20E 40 Bảng 3.2 Hàm lƣợng % nitơ tổng nguồn nitơ 44 Bảng 3.3 Thành phần môi trƣờng nguồn nitơ khảo sát 44 Bảng 3.4 Thành phần môi trƣờng nguồn cacbon khảo sát 45 Bảng 3.5 Tỉ lệ mật độ giống khảo sát 48 Bảng 4.1 Kết sinh hóa Kit API chủng S marcescens SH1 52 Bảng 4.2 Mật độ tế bào (cfu/ml) sử dụng nguồn nitơ 57 Bảng 4.3 Mật độ tế bào (cfu/ml) sử dụng nguồn Cacbon 59 Bảng 4.4 Mật độ tế bào (cfu/ml) với độ pH 60 Bảng 4.5 Mật độ tế bào (cfu/ml) với điều kiện lắc 61 Bảng 4.6 Mật độ tế bào (cfu/ml) với tỉ lệ cấy giống 63 Bảng 4.7 Mật độ tế bào (cfu/ml) với nồng độ đệm môi trƣờng nuôi cấy 64 Bảng 4.8 Các thông số động học nuôi cấy S marcescens SH1 mơi trƣờng 66 Bảng 4.9 Tính tốn giá thành môi trƣờng 67 Bảng 4.10 Chi phí sản xuất sinh khối môi trƣờng 67 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Serratia marcescens dƣới kính hiển vi 13 Hình 2.2 Khuẩn lạc S.marcescens môi trƣờng XLD 17 Hình 2.3 Khuẩn lạc S marcescens NA 17 Hình 2.4 Quy trình cơng nghệ lên men thu sinh khối 24 Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa S marcescens SH1 35 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát, chọn thành phần cho môi trƣờng tốt cho phát triển S marcescen SH1 36 Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm, khảo sát điều kiện ni cấy 37 Hình 4.1 Khuẩn lạc S marcescens SH1 môi trƣờng NA 50 Hình 4.2 Kết nhuộm Gram 51 Hình 4.3 Kết sinh hóa Kit API 20E 52 Hình 4.4 Thử nghiệm hoạt tính lipase SH1 Tween 20 54 Hình 4.5 Thử nghiệm hoạt tính protease 54 Hình 4.6 Khả phân giải chitin 55 Hình 4.7 Đƣờng cong tăng trƣởng S marcesces SH1 môi trƣờng NB 56 Hình 4.8 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ lên phát triển S marcescens SH1 57 Hình 4.9 Ảnh hƣởng nguồn Cacbon lên phát triển S marcescens SH1 58 Hình 4.10 Ảnh hƣởng pH lên phát triển S marcescens SH1 60 Hình 4.11 Ảnh hƣởng Oxy lên phát triển S marcescens SH1 61 Hình 4.12 Ảnh hƣởng tỉ lệ cấy giống lên phát triển S marcescens SH1 62 Hình 4.13 Ảnh hƣởng việc bổ sung đệm lên trình lên men phát triển S marcescens SH1 64 v Đồ án tốt nghiệp Hình 4.14 Đƣờng cong tăng trƣởng S marcescens SH1 môi trƣờng NB môi trƣờng 65 vi Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ xa xưa người biết sử dụng vi sinh vật đời sống ngày Các trình làm rượu, làm giấm, làm tương, muối chua… ứng dụng đặc tính sinh học nhóm vi sinh vật Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò vi sinh vật việc ứng dụng sản xuất đời sống ngày rộng rãi có hiệu Ví dụ việc chế vắc xin phịng bệnh, sản xuất kháng sinh Sử dụng vi sinh vật việc tạo phân bón sinh học, thuốc bảo vệ thực vật không gây hại môi trường, làm cân sinh thái Trong tự nhiên, ngồi vi sinh vật có lợi cịn có vi sinh vật gây hại, ví dụ nhóm vi sinh vật gây bệnh cho người, động vật thực vật, lồi gây nhiễm nước, thực phẩm Nhưng ta nắm vững mặt lợi hay hại nó, ta đưa biện pháp khoa học để phát huy mặt lợi hạn chế mặt hại chúng gây Serratia marcescens biết đến lồi vi khuẩn hội, bên cạnh biết đến với nhiều khả ứng dụng công nghệ sinh học khả diệt sâu, khả kháng khuẩn kháng nấm hợp chất thứ cấp sinh ra… Ngày để tăng suất sản lượng trồng trọt người dân thường sử dụng loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học Tuy nhiên, việc sử dụng đem lại lợi ích trước mắt mà không đảm bảo thâm canh bền vững, bên cạnh đó, sản phẩm làm cho đất đai ngày bị nhiễm, diệt trừ nhiều lồi thiên địch có lợi cho trồng, cân sinh thái đất số vi sinh vật đất bị tiêu diệt Các thuốc trừ sâu hóa học tồn dư lâu, chúng khơng dễ dàng bị phân hủy dẫn đến tình trạng tồn dư tích đọng lại, ngấm sâu vào lịng đất nước gây hại cho động vật, trồng mà người sống sống gần Nếu người hoăc loài động vật ăn loại Đồ án tốt nghiệp trồng tồn đọng lượng khơng nhỏ thuốc trừ sâu hóa học lâu dần ảnh hưởng tai hại đến sức khỏe họ Các ngành hố học cơng nghiệp hố chất khơng ngừng phát triển ngày sản xuất nhiều loại sản phẩm với mục đích diệt sâu – bệnh hại trồng Nhưng hiệu thời gian ngắn Sau đó, liều lượng người pha ngày tăng, loại sâu bệnh ngày thích nghi lại có tìm kiếm loại thuốc để diệt chúng Vịng tuần hồn tiếp tục, lâu dần, hệ sinh thái nông nghiệp bị phá hủy giết chết loai thiên địch có ích làm ô nhiễm môi trường sống người lồi động vật khác Trước tình hình đó, biện pháp phòng trừ bệnh hại trồng phương pháp sinh học “thân thiện với người môi trường” nhà khoa học quan tâm nghiên cứu sản xuất loại sản phẩm xuất phát từ sinh học Việc sử dụng tác nhân sinh học bảo vệ thực vật có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bênh hại cho trồng, cân hệ sinh thái (các lồi thiên địch, vi sinh vật có lợi, dinh dưỡng…) mơi trường đất nói riêng mơi trường sống nói chung mà khơng làm ảnh hưởng đến mơi trường thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học khác Khơng gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người trồng trước mắt lâu dài Do việc ứng dụng Serratia marcescens bảo vệ thực vật triển vọng to lớn nông nghiệp Bên canh vi khuẩn Serratia marcescens cịn biết đến với khả sản xuất sắc tố tự nhiên (prodigiosin) Prodigiosin sắc tố màu đỏ, có hoạt tính kháng vi sinh vật bắt đầu nghiên cứu từ năm 1960, thu hút nhiều quan tâm khả sử dụng làm màu tự nhiên ứng dụng lĩnh vực bảo vệ thực vật hoạt chất kháng ức chế miễn dịch chống khối u (D’Alessio Rossi, 1996; Azuma cộng sự, 2000; Bennet Bentley, 2000; Melvin cộng sự, 2000, Tsuji cộng sự, 1990; Kataoka cộng sự, 1992; Đồ án tốt nghiệp Tsuji, 1992; Songia cộng sự, 1997) Ngồi ra, prodigiosin cịn sử dụng để tạo mùa tự nhiên nghành dệt may (Chidambaram Perumalsamy, 2009) Dựa sở lợi ích quan trọng chủng Serratia marcescens sản phẩm trao đổi chất Serratia marcescens mà em chọn đề tài: “Thiết lập môi trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn Serratia marcescens SH1” Mục đích đề tài 1.2 Xác định môi trường điều kiện nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 để thu sinh khối cực đại Nội dung đề tài 1.3 - Định danh khảo sát số hoạt tính enzyme chủng SH1 - Khảo sát nguồn cacbon nitơ phù hợp với phát triển Serratia marcescens SH1 - Khảo sát điều kiện lên men (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống, thời gian thu sinh khối) thích hợp với phát triển Serratia marcescens SH1 Phƣơng pháp xử lí số liệu 1.4 - Sử dụng phần mềm excel để tính tốn biểu diễn đồ thị - Sử dụng phần mềm staghaphics để xử lí số liệu Các kết đạt đƣợc đề tài 1.5 - Chọn môi trường tốt cho phát triển Serratia marcescens SH1 - Khảo sát điều kiện nuôi cấy (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống) tốt cho phát triển Serratia marcescens SH1 1.6 Kết cấu đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp gồm có chương:  Chương 1: Mở đầu  Chương 2: Tổng quan  Chương 3: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Đồ án tốt nghiệp  Chương 4: Kết thảo luận  Chương 5: Kết luận đề nghị Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu thuốc bảo vệ thực vật sinh học 2.1.1 Khái niệm phân loại Khái niệm: Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học sản xuất từ loại thảo dược hay chủng vi sinh vật nuôi cấy môi trường dinh dưỡng khác theo phương pháp thủ công, bán thủ công phương pháp lên men công nghiệp để tạo chế phẩm có chất lượng cao, có khả phòng trừ loại sâu bọ gây hại trồng nơng, lâm nghiệp Thành phần giết sâu có thuốc sinh học vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) chất vi sinh vật tiết ra, chất có cỏ (là chất độc dầu thực vật) Với thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học chia thành hai nhóm là: - Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu vi sinh vật nấm, vi khuẩn, virus - Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu chất độc có cỏ dầu thực vật Như biết, thuốc trừ sâu hóa học có ưu điểm rõ rệt hiệu diệt sâu nhanh có nhược điểm quan trọng có độ độc cao với người động vật có ích (trong có lồi thiên địch), gây nhiễm mơi trường Vì vậy, yêu cầu bảo vệ sức khỏe người mơi trường, thuốc trừ sâu hóa học cần hạn chế sử dụng dần thay vào thuốc trừ sâu sinh học Ưu điểm bật thuốc trừ sâu sinh học độc với người mơi trường Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu dầu thực vật không độc với người sinh vật có ích Do độc với lồi thiên địch nên thuốc sinh học bảo vệ cân sinh học tự nhiên (cân thiên địch sâu hại), gây tình trạng bùng phát sâu hại Do thời gian cách ly ngắn nên thích hợp sử dụng cho nơng sản u cầu có độ cao loại rau, chè… Muốn Đồ án tốt nghiệp có nơng sản an toàn, biện pháp quan trọng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật sinh học 2.1.2 Ứng dụng tuyến trùng diệt sâu Tuyến trùng sống đất ký sinh trùng đất, nên chúng nguyên liệu tuyệt vời để sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh Sau vào đất, tuyến trùng phân tán công côn trùng Tuyến trùng xâm nhập vào thể côn trùng thức ăn qua lỗ thở hậu môn côn trùng Ở ruột côn trùng, tuyến trùng chui qua vách ruột vào hệ tuần hoàn Ở đây, tuyến trùng sinh trưởng phát triển nhanh, gây chết cho côn trùng 1-2 ngày Trừ số tuyến trùng sống điều kiện khô dạng bào nang, hầu hết tuyến trùng hoạt động điều kiện có màng nước bao quanh Vì thế, tuyến trùng tác động đến lồi trùng sống đất, nơi chúng sống lâu Trong số hàng nghìn lồi tuyến trùng ký sinh trùng có nhóm Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả vừa ký sinh vừa gây bệnh cho côn trùng, gọi tuyến trình ký sinh gây bệnh côn trùng Bao gồm giống Steinernema Heterorhabditis Bình thường EPN sống tự đất mang theo vi khuẩn cộng sinh Khi tìm vật chủ (sâu hại), tuyến trùng thâm nhập vào xoang máu qua lỗ mở tự nhiên trực tiếp qua lớp vỏ giải phóng vi khuẩn Vi khuẩn sinh sôi, tiết protein độc, giết chết vật chủ vòng 24 - 48 Do vậy, tuyến trùng sử dụng làm tác nhân sinh học để sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng Hiện có 17 loài tuyến trùng thuộc giống Steinernema loài thuộc giống Heterorhabditis thuộc Rhabditida có khả Sau xâm nhập, chúng có khả gây bệnh làm chết vật chủ 48 Các EPN có khả ký sinh 200 lồi trùng thí nghiệm (có phần đời sống đất) Đồ án tốt nghiệp 2.1.3 Ứng dụng vi khuẩn diệt sâu Côn trùng chết tự nhiên chiếm khoảng 80-90%, hầu hết chết vi sinh vật mà vi khuẩn loài vi sinh vật chiếm đa số Do đó, điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có tác dụng khơng nhỏ việc điều chỉnh số lượng quần thể sâu hại Trong số quần thể vi khuẩn sản xuất thành chế phẩm dùng để phòng trừ sâu hại rừng Người ta phát hàng trăm loài vi khuẩn có quan hệ với trùng, có 90 lồi gây bệnh cho trùng Trong tự nhiên, lồi vi khuẩn gây bệnh khơng phải tạo thành chế phẩm trừ sâu cần có số tính chất độ độc, tính ổn định, khả lây lan, tác dụng nhanh, chọn lọc tốt, sản xuất hàng loạt, kinh tế an toàn  Một số loài vi khuẩn sinh bào tử điển hình có khả diệt sâu hại - Clostridium brevifaciens - Clostridium malacosomae - Bacillus cereus - Bacillus thuringienis - Bacillus papillae  Một số loài vi khuẩn khơng sinh bào tử điển hình có khả diệt sâu hại - Serratia marcescens Giới thiệu chế phẩm thuốc trừ sâu sản xuất từ vi khuẩn Bacillus thuringienis (Bt) Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) : Phân lập lần đầu năm 1870 trừ côn trùng năm 1915 Đến 1971, có 30 chủng Bt, chia thành 20 serotyp khác gây hại cho 400 lồi trùng Sản phẩm Bt diệt trùng có thị trường từ đầu năm 60 kỷ 20 Bt nhóm vi khuẩn háo khí, gram dương, bào tử hình que, kích thước 3-6 x 0,8-13µ, đơn hay xếp chuỗi Vi khuẩn di chuyển nhờ roi dài - 8µ Bào tử hình trứng, chịu nhiệt, có kích thước 1-1,5 x 0,8 - 0,9µ Đồ án tốt nghiệp Trong môi trường, bào tử sinh tế bào dinh dưỡng hình que Hầu hết chủng Bt thời gian hình thành bào tử, sản sinh tinh thể độc delta-endotoxin ( tiền độc tố) độc tố hoạt hoá ruột men phân giải protein Ngồi ra, delta-endotoxin cịn gây rối màng biểu mơ ruột giữa, làm cân tính thấm tế bào, trùng bị liệt chết Delta-endotoxin cịn tương tác với liposome màng tế bào biểu mô, làm tăng rối loạn màng biểu mô ruột Delta-endotoxin có hiệu lực trừ sâu non cánh phấn Lepidoptera số loài Diptera Coleoptera Các thuốc thương phẩm Bacillus thuringiensis chứa bào tử delta-endotoxin có hiệu lực trừ nhiều lồi dịch hại nông lâm nghiệp Phương thức tác động: Bacillus thuringiensis sản sinh bào tử bên, protein kết tinh tạo bào tử trình bào tử nảy mầm Khi vào bụng côn trùng, vi khuẩn thể hoạt tính trừ sâu với sâu non trưởng thành cánh vảy Lepidoptera số loài thuộc cánh cứng Coleoptera Trong thể côn trùng, tinh thể protein bị hoà tan men protease ruột côn trùng biến tinh thể độc(tiền độc tố) thành chất độc nhỏ Các chất độc bị thuỷ phân bao vây tế bào ruột côn trùng, đặc biệt phía chất nhận, nơi tạo amino axit Q trình phụ thuộc vào hàm lượng ion kali Sự tác động tạo lỗ hổng, cho phép lựa chọn cation, làm tăng tính thấm màng tế bào Tính thấm nước tăng, tế bào bị phồng lên chí bị vỡ, phá vỡ thành ruột Tính chọn lọc đặc trưng chủng Bt với lồi trùng phụ thuộc vào cường độ chất độc bao vây chất nhận Ngoài ra, bào tử Bt ruột côn trùng tiếp tục phát triển sản sinh tinh thể độc bào tử mới, làm tăng hiệu lực Bt Bt thuốc trừ sâu có tác động đường ruột; khơng có tác động tiếp xúc, xông nội hấp Vào thể côn trùng, tinh thể nội độc tố bị hồ tan, huỷ hoại tế bào biểu mơ (epithelial cell) ruột côn trùng, côn trùng chán hay ngừng ăn tử vong Đồ án tốt nghiệp 2.2 Mối quan hệ vi khuẩn cộng sinh tuyến trùng Theo Gouge Snyder (2006), EPN (Entomopathogenic nematodes) động vật khơng xương sống, thuộc ngành giun trịn (Nematoda), thường gọi “roundworms” EPN có khả ký sinh gây chết côn trùng đặc biệt côn trùng sống mơi trường đất (do gọi tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng), tên gọi chúng gây bệnh cho côn trùng, vô hại với người, trồng vật nuôi EPN sống bên thể vật chủ nên gọi “nội ký sinh” Chúng lây nhiễm cho nhiều loại côn trùng khác sống đất, bao gồm dạng ấu trùng bướm, ngài, bọ cánh cứng, ruồi, dế trũi châu chấu trưởng thành, số ấu trùng trùng có kích thước nhỏ, có vịng đời ngắn ấu trùng muỗi, rầy nâu hại lúa Tiêu biểu hai họ Steinernematidae Heterorhabditidae sử dụng nhóm tác nhân phịng trừ sinh học sâu hại có hiệu giới (Poinar, 1966) Cả họ đánh giá lây nhiễm cao, đa dạng ký chủ (Gaugler Kaya, 1990) với vi khuẩn cộng sinh ruột chúng có khả gây nhiễm trùng huyết cho ký chủ Các vi khuẩn cộng sinh chi Steinernema Heterorhabditis tương ứng thuộc chi Xenorhabdus Photorhabdus (Boemare cộng sự, 1997) Ở giai đoạn IJs (infective juveniles) tuyến trùng xâm nhập vào xoang máu trùng giải phóng vi khuẩn cộng sinh gây nhiễm trùng huyết ký chủ Vi khuẩn phân hủy ký chủ tạo thức ăn cho tuyến trùng sản xuất kháng sinh chống lại xâm nhập vi sinh vật khác Các kháng sinh vi khuẩn cộng sinh sản xuất xenorhabdins, xenocoumacins, hydroxystilbens antraquinons (Li cộng sự, 1998; Fodor cộng sự, 2010) Mặc dù mối quan hệ cụ thể phụ thuộc lẫn tuyến trùng EPN vi khuẩn cộng sinh số vi khuẩn phụ thuộc báo cáo có liên quan đến tuyến trùng ký chủ bị nhiễm tuyến trùng EPN Poinar (1966) phân lập Achromobacter nematophilus từ Galleria mellonella bị lây nhiễm S.(Neoplectana) carpocapsae tìm thấy Alcaligenes Đồ án tốt nghiệp sp., Aerobacter sp., Proteus sp Pseudomonas aeruginosa Thêm Alcaligenes dorans, Pseudomonas fluorescens, P maltophilia, P alcaligenes Acinetobacter sp phân lập từ loài tuyến trùng (Lysenko Weiser, 1974) Các vi khuẩn khác Escherichia coli, Ochrobactrum anthropi, Paracoccus denitrificans, Pseudomonas aureofaciens, P fluorescens Biovar B Xanthomonas maltophilia tìm thấy liên quan đến S scapterisci (Aguilera Smart, 1993; Aguilera cộng sự, 1993) Ngồi ra, với chi Heterorhadibditis tìm thấy có vi khuẩn khác cộng sinh với nó, bao gồm Providencia rettgeri (Jackson cộng sự, 1995), Ochrobactrum anthropi O Intermedium (Babic cộng sự, 2000) Một loài vi khuẩn không cộng sinh từ chi Serratia, S liquefaciens, phát liên quan đến Steinernema spp Heterorhabditis spp (Boemare cộng sự, 1997) Ngoài S proteomaculans S marcescens tìm thấy lồi Steinernema Heterorhabditis (Gouge Snyder, 2006) Mặc dù tất nghiên cứu, báo cáo kết hợp vi khuẩn không cộng sinh với tuyến trùng EPN mơ tả độc lực vi khuẩn liên quan, vận chuyển vi khuẩn tuyến trùng vào bên côn trùng, làm chúng vận chuyển mức độ liên kết tuyến trùng vi khuẩn Trong báo cáo Estrada cộng (2012) nêu mối quan hệ Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae 2.2.1 Vai trò vi khuẩn cộng sinh tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn Trong tổ hợp cộng sinh vi khuẩn có vai trò lớn tuyến trùng, thể qua mặt sau: - Sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm: Độc tố vi khuẩn cộng sinh tiết số protein độc có khả nhiễm xoang máu côn trùng vật chủ làm cho trùng chết cách nhanh chóng vịng 24 - 48 Như vậy, thời gian chết trùng vật chủ khác cịn tùy loại tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn 10 Đồ án tốt nghiệp thuộc phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ thường không chậm 48 - Cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng: Tuyến trùng sử dụng vi khuẩn cộng sinh vừa giải phóng từ thể chúng sinh sôi trông xoang máu côn trùng nguồn dinh dưỡng chúng Nhờ mà IJs nhanh chóng phát triển sang tuổi đạt đến tuổi trưởng thành Từ hệ 2, tuyến trùng chuyển sang dinh dưỡng hoạt hóa xác chết trùng Nhờ enzyme vi khuẩn tiết mà mô thể côn trùng trở thành nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng Từ hệ thứ tuyến trùng tiếp tục phát triển, sinh khối hệ Thông thường thể cơng trùng, tuyến trùng phát triển đến hệ, phụ thuộc vào sinh khối côn trùng làm nguồn thức ăn cho chúng - Ngăn cản vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng: vi khuẩn cộng sinh có khả sinh hoạt chất kháng sinh để ngăn cản tác nhân sinh học khác nấm, vi khuẩn xâm nhập phát triển xác côn trùng Nhờ mà chúng bảo vệ nguyên vẹn nguồn thức ăn giành cho tuyến trùng cộng sinh chúng 2.2.2 Vi khuẩn cộng sinh tạo độc tố giết chết côn trùng Mỗi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn tiêu diệt phổ lớn lồi trùng vật chủ chúng có khả vượt qua hệ thống bảo vệ côn trùng sản xuất chất độc tố (toxin) để giết côn trùng bị nhiễm Cũng giống vi khuẩn gram âm khác loài Xenorhabdus spp Photorhabdus spp có khả sản sinh nội độc tố Nội độc tố X poinarii sinh hợp chất lipopolisacharide thành tế bào, chất gây độc huyết cầu (haemocytes) côn trùng Tuy nhiên, chưa rõ ràng nội độc tố có hiệu lực giết chết trùng vật chủ hay cịn nhiều yếu tố khác Sự gây nhiễm huyết cầu vật chủ cho phép X enorhabdus nhân nhanh số lượng sản sinh ngoại độc tố (exotoxin), ngoại độc tố chứng minh P Luminescens (Bowen cộng sự, 1998) X Nematiphilus cách tiêm dịch nuôi cấy vi khuẩn vào thể côn trùng trùng chết nhanh chóng 11 ... chủng Serratia marcescens sản phẩm trao đổi chất Serratia marcescens mà em chọn đề tài: ? ?Thiết lập môi trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn Serratia marcescens SH1? ??... phóng vi khuẩn cộng sinh gây nhiễm trùng huyết ký chủ Vi khuẩn phân hủy ký chủ tạo thức ăn cho tuyến trùng sản xuất kháng sinh chống lại xâm nhập vi sinh vật khác Các kháng sinh vi khuẩn cộng sinh. .. ii Đồ án tốt nghiệp 3.7.4 3.7.5 Khảo sát ảnh hƣởng vi? ??c bổ sung đệm lên phát triển S marcescens SH1 48 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng S marcescens SH1 môi trƣờng mớivà điều kiện nuôi