1 GIÁO TRÌNH THỰC TẬP CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ ĐỊNH LƯỢNG PHẦN 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG CÔNG CỤ (Các bài TT trong phần này được trích từ giáo trình “Thực tập phân tích công cụ” 2 BUỔI 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ PHÂN TỬ BÀI 1 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UV VIS) Xác định hàm lượng amoni, nitơ hữu cơ và tổng nitơ trong mẫu nước 1 1 Mục đích thí nghiệm Nitơ trong môi trường tồn tại ở nhiều dạng hóa học khác nhau bao gồm nitơ vô cơ như ammoni (NH4 +), nitrit (NO2.
GIÁO TRÌNH TH C T P CÁC PH NG PHÁP PHÂN TÍCH C U TRÚC VÀ PH N 1: CÁC PH NG PHÁP (Các TT ph n đ NH L NH L NG NG B NG CÔNG C c trích t giáo trình ắTh c t p phân tích cơng c Ằ BU I 1: CÁC PH BÀI 1: PH NG PHÁP PHÂN TÍCH PH PHÂN T NG PHÁP QUANG PH Xác đ nh hƠm l H P TH PHÂN T (UV-VIS) ng amoni, nit h u c vƠ t ng nit m u n c 1.1 M c đích thí nghi m Nit môi tr ng t n t i nhi u d ng hóa h c khác bao g m nit vô c nh ammoni (NH4+), nitrit (NO2-), nitrat (NO3-), nit ôxit (N2O), nit ôxit (NO), ho c nit vô c nh khí nit (N2) Nit h u c có th t n t i sinh v t s ng, đ t mùn, ho c s n ph m trung gian c a trình phân h y v t ch t h u c nh protein, ure, axit nucleic, hóa ch t t ng h p ch a nit , Các trình chu trình nit s chuy n đ i nit t m t d ng sang d ng khác M t s trình nƠy đ c ti n hành b i vi khu n, qua q trình ho c đ chúng l y n ng l thành m t d ng c n thi t cho s phát tri n c a chúng L ng l n nit , v i photpho, t n ng ho c đ tích t nit c th i sinh ho t, n c th i t ho t đ ng s n xu t công nghi p vƠ nông nghi p lƠ nguyên nhơn gơy hi n t ng phú d ng (eutrophication) ơy lƠ m t d ng suy gi m ch t l ng n c th ng x y h ch a n ng đ N, P h t ng cao lƠm bùng phát lo i th c v t n c (nh rong, t o, l c bình, bèo v.v ), lƠm t ng ch t l l ng, ch t h u c , lƠm suy gi m l ng ôxy n c, nh t lƠ t ng d i sơu, d n đ n s suy gi m đa d ng sinh h c môi tr ng n c vƠ gia t ng m c đ ô nhi m môi tr ng không khí gơy nh ng khó kh n, t n cho ngƠnh kinh t qu c dơn i v i phơn tích mơi tr ng, hƠm l ng nit t ng s m t ch tiêu quan tr ng đ đánh giá ch t l ng n c, góp ph n xác đ nh ngu n phát th i nit , ki m soát hàm l ng nit n c th i đ u vƠo vƠ đ u đ đánh giá hi u qu x lí Tùy theo lo i đ i t ng m u n c mà s có m t d ng c a N ch y u c ng nh m c hƠm l ng c a chúng mà có cách phân tích t ng N phù h p Trong th c t p này, sinh viên s s d ng ph ng pháp đo quang vùng VIS đ đ nh l ng amoni sau t o h p ch t có màu v i thu c th h u c Hai ch tiêu khác lƠ xác đ nh nitrat nitrit b ng ph ng pháp đo quang, sinh viên có th tham kh o thêm qui trình tiêu chu n HƠm l ph ng pháp: Ph ng pháp A: Xác đ nh t ng hƠm l ng ni t h u c đ c xác đ nh b ng hai ng Ni t m u n c m t ho c n c ng m c s oxi hóa t t các d ng ni t thƠnh nitrat b ng cách đun m u v i h n h p K2S2O8 / KOH n i h p (autoclave) vƠ đo quang vùng UV đ xác đ nh nitrat t o thƠnh HƠm l ng ni t h u c b ng t ng hƠm l ng ni t tr d ng nit vô c amoni, nitrat nitrit Ph ng pháp B: iv im un c th i có hƠm l ng ch t h u c cao vƠ t ng hƠm l ng N l n có th xác đ nh t ng ni t h u c vƠ amoni theo ph ng pháp Kendal (g i t ng ni t Kendal TNK) sau chuy n t t c d ng ni t h u c vƠ amoni thành NH4+, thêm ki m chuy n thành NH3 (c t đ m) s c vào dung d ch H2SO4 Xác đ nh l ng amoni thu đ c b ng cách chu n đ l ng H2SO4 d b ng dung d ch chu n NaOH (n u l ng N l n) ho c đo quang xác đ nh amoni n u l 1.2 C s lý thuy t c a ph ng nit nh ng pháp phơn tích 1.2.1 S h p th phân t UV-Vis l u ki n th ng phân t t n t i tr ng thái c b n b n v ng có n ng ng th p Khi chúng đ c cung c p n ng l ng, ch ng h n nh có ngu n sáng kích thích v i b l c sóng thích h p, electron hóa tr phân t s h p th n ng ng c a ngu n sáng chuy n lên tr ng thái kích thích có n ng l ng cao h n Theo c h c l ng t , phân t tr ng thái c b n, electron đ c x p đ y vào obitan liên k t , ho c c p electron hóa tr ch a tham gia liên k t n có m c n ng l ng th p N u chi u chùm sáng có b c sóng thích h p vào phân t electron s chuy n lên obitan ph n liên k t có m c n ng l ng cao h n nh *, *,n *, n * Tr ng thái nƠy đ c g i tr ng thái kích thích, khơng b n ch t n t i kho ng th i gian r t ng n (kho ng 10-8 giây) N ng l ng h c a photon b ng hi u c a hai m c n ng l ng c a hai obitan S d ch chuy n c a m t electron gi a hai obitan đ c g i s d ch chuy n electron trình h p th đ c g i s h p th electron S chuy n d ch m c n ng l ng c a electron m t phân t hai nguyên t khác h p th b c x t ngo i kh ki n đ c th hi n Hình 1.1 Hình 1.1 S đ b B c chuy n d i n ng l ng c chuy n n ng l (nm) N ng l ng c a electron ng kích thích E(Kcal/mol) n n * 120 230 * 160 184 * 180 162 280 82 * Thông th ng q trình kích thích electron có kèm theo trình quay dao đ ng c a phân t Do n ng l ng chung c a h phân t b ng t ng n ng l ng c a trình trên: E = Ee + Ed + Eq Trong đó: Ee lƠ n ng l ng c a electron obitan l p v c a phân t Ed lƠ n ng l ng dao đ ng gi a nguyên t toàn b phân t Eq n ng l ng liên quan v i s quay c a phân t quanh tr ng tâm c a chúng l B c nh y n ng l ng đ i v i s kích thích electron l n h n b c nh y n ng ng đ i v i s dao đ ng l n h n b c nh y n ng l ng ng v i s quay phân t : Ee >> Ed >> Eq (1.4) S h p th phân t vùng t ngo i kh ki n g m nh ng d i h p th đ c t o r t nhi u v ch có kho ng cách r t g n nhau, v y ph UV-VIS không ph i ph v ch nh ph phát x ho c h p th nguyên t mà ph đám Nh v y ph h p th phân t UV-VIS ph xu t hi n s t ng tác c a electron hóa tr phân t hay nhóm phân t v i chùm sáng kích thích có b c sóng n m vùng UV-VIS t o 1.2.2 Màu s c ph h p th vùng VIS Ánh sáng m t b c x n t có đ dƠi sóng khác (hay nói khác lƠ m t dịng phơton có n ng l ng khác nhau) Trong ph ng pháp ph h p th phân t UV-Vis, vùng ph th áp d ng lƠ vùng có b c sóng n m kho ng 200÷800 nm: 200 400 Vùng t ngo i chân không Vùng t ngo i 800 Vùng kh ki n ng đ c (nm) Vùng h ng ngo i Trong : lƠ đ dài sóng (1nm = 10 A = 10-9m) Các ch t nghiên c u th ng h p th ch n l c ánh sáng m t vùng ph nh t đ nh Ch ng h n, m i quan h gi a màu s c c a m t ch t kh n ng h p th ánh sáng c a vùng ánh sáng kh ki n (ánh sáng nhìn th y) có th đ gi n đ màu (Hình 1.2) c bi u di n qua Hình 1.2 Gi n đ màu c a vùng ánh sáng nhìn th y Trong gi n đ mƠu, mƠu đ i di n màu bù T h p màu bù t o nên màu g n tr ng Ví d v t có màu tím h p th tia sáng l c ánh vàng vƠ ng c l i 1.2.3.Nguyên t c đ nh l đ nh l ng ch t b ng ph ng c u t X b ng ph ng pháp đo quang ng pháp ph h p th phân t UV-VIS, c n chuy n thành h p ch t có kh n ng h p th ánh sáng r i đo s h p th ánh sáng c a m t vùng ph nh t đ nh ng v i m t b c sóng xác đ nh, t suy hƠm l ng c a ch t nghiên c u X +) đ nh l ng h p ch t h u c ng i ta th ng d a ph n ng t ng h p ch t màu Ngoài cịn dùng ph n ng oxihố kh , ph n ng xúc tácầ Nh v y, ph n ng hố h c chi m vai trị quan tr ng ph ng pháp ph h p th phân t Th i gian phơn tích, đ xác tính ch n l c c a ph ng pháp ph thu c ch y u vào vi c l a ch n ph n ng hoá h c vƠ u ki n t i u đ hình thành h p ch t h p th ánh sáng * nh lu t Bouguer-Lambert (Buge-Lambe) S ph thu c gi a s gi m c ng đ dòng sáng đ n s c vào b dày c a l p dung d ch màu h p th ánh sáng đ c nhà Bác h c Bouguer (ng i Pháp) thi t l p n m 1729 vƠ đ c nhà Bác h c Lambert (ng i c) xác nh n vƠo n m 1760 T hình thƠnh lên đ nh lu t BouguerậLambert (Buge- Lambe ) có n i dung nh sau: ắL ng t ng đ i c a dòng ánh sáng b h p th b i môi tr không ph thu c vƠo c ng mƠ qua ng đ tia t i M i m t l p dung d ch có b dƠy nh h p th m t ph n dòng đ n s c qua dung d ch nh nhauẰ Ngh a lƠ: I = I0 I I I , I = = 02 I n = 0n (1.16) n n n n V i n s l n giá tr c có b dƠy nh - ng d dịng sáng y u qua m i l p dung d ch nh lu t Beer nh lu t Beer mô t s ph thu c đ h p th quang c a dung d ch vào n ng đ c a ti u phân h p th ánh sáng có dung d ch nh lu t nƠy đ c thi t l p vƠo n m 1852 v i n i dung: ắS h p th dòng sáng t l b c nh t v i s ph n t c a ch t h p th mà dịng ánh sáng qua nóẰ Hay có th phát bi u theo cách khác ắ h p th ánh sáng c a dung d ch màu (đ h p th quang) t l b c nh t v i n ng đ c a dung d ch ch t h p th ánh sángẰ A = lg I0 = Kl C (1.17) Il Trong đó: Kl h s t l , ph thu c b n ch t ch t h p th ánh sáng C n ng đ h p ch t màu - nh lu t h p nh t Bouguer - Lambert- Beer nh lu t Bouguer - Lambert vƠ đ nh lu t Beer cho th y đ h p th ánh sáng (đ h p th quang A) c a dung d ch màu t l b c nh t v i b dày (l) c a l p dung d ch màu n ng đ (C) c a ch t h p th ánh sáng T h p hai đ nh lu t ng i ta đ c đ nh lu t h p nh t Bouguer - LambertBeer (th ng g i lƠ đ nh lu t Bouguer - Lambert- Beer, g i t t lƠ đ nh lu t Beer) Bi u th c toán h c c a đ nh lu t Bouguer - Lambert- Beer có d ng: Il = I 10− lC (1.18) , hay: A = lg I0 = lC (1.19) Il Trong đó: l b dày l p dung d ch màu h p th ánh sáng (cm) C n ng đ ch t màu h p th ánh sáng (mol/L) h s h p th mol phân t c a ch t màu h p th ánh sáng lƠ m t hàm s c a đ dài sóng ( = f ( ) ), *H s h p th mol phân t không ph thu c vào n ng đ c a h p ch t màu h p th ánh sáng mà ch ph thu c vào b n ch t c a ch t h p th vƠ b nh y c a ph n ng đo quang c sóng c a ánh sáng t i, đ m tb c dùng đ xác đ nh đ c sóng xác đ nh H s h p th mol phân t th c khác v i h s h p th phân t bi u ki n ch : H s h p th phân t bi u ki n xác đ nh đ s h p th mol phân t th c đ c u ki n th c nghi m, cịn h c tính tốn theo ph ng trình lý thuy t: = A (1.20) lC ch dao đ ng kho ng l n nh t t 105 Theo Brauđe h s h p th phân t đ n 1,2.105, h s >>105 theo tính tốn c a hố l ng t có xác su t Nh v y đ nh lu t Bouguer - Lambert- Beer mô t s ph thu c c a đ i l ng đ h p th quang c a dung d ch vào n ng đ b dày l p dung d ch màu h p th ánh sáng NgoƠi đ i l ng đ h p th quang A, ph phân t dùng đ i l ng đ truy n quang T truy n quang T t s c c ng pháp phơn tích ph h p th ng đ dòng sáng đ n s c qua dung d ch Il ng đ dòng sáng ban đ u I0 Il = 10 −lC I0 (1.21) A = − lg T = lC (1.22) T= T (1.20) (1.21) ta có: Các đ i l ng A T ph thu c vƠo b c sóng vào n ng đ C c a ch t h p th ánh sáng dung d ch S ph thu c n tính A =f(C) A =f(l) có ý ngh a l n đ i v i m c đích th c hành A ph thu c n tính theo C, cịn đ i l ng T dùng hàm l y th a c a C Các phép xác đ nh có đ nh y, đ xác cao Trong tr ng h p ch t h p th ánh sáng tuơn theo đ nh lu t Beer, s ph thu c A =f(C) A =f(l) s ph thu c n tính Th c t cho th y r ng n ng đ dung d ch h p th ánh sáng có giá tr l n, đ th khơng cịn lƠ đ ng th ng ph thu c b c nh t mà có d ng đ ng cong Do v y phân tích ph h p th phân t ph i ch n xây d ng đ ng chu n khu v c có s ph thu c n tính Các đ ng ph i đ c x lý th ng kê vƠ đ i l ng đ h p th quang ph i đ c đo b c sóng max *Các nguyên nhân sai l ch kh i đ nh lu t h p nh t nh lu t h p nh t xây d ng đ c d a ba gi thi t: + Dòng sáng chi u vào dung d ch lƠ dòng sáng đ n s c + H s khúc x dung d ch h ng s + Không có q trình ph x y dung d ch Các nguyên nhân không tho mãn gi thi t đ u gây s h p th c a dung d ch không tuân theo (sai l ch kh i) đ nh lu t h p nh t g m: - S có m t c a ch t n li l dung d ch màu Các ch t n li l có m t dung d ch màu h p th ánh sáng làm bi n d ng ph n t ho c ion ph c màu, làm nh h ng đ n s h p th ánh sáng c a ti u phân h p th ánh sáng - Do hi u ng Solvát hoá (ho c hyđrát hoá) Các hi u ng làm gi m n ng đ phân t dung môi t do, lƠm thay đ i n ng đ dung d ch mƠu lƠm nh h ng đ n s h p th ánh sáng c a dung d ch màu - Do hi u ng liên h p Trong m t s tr ng h p x y s t ng tác c a ti u phân h p th ánh sáng đ t o ti u phơn polime lƠm thay đ i n ng đ h p ch t màu - nh h Trong tr ng m c đ đ n s c c a ánh sáng ng h p dùng ánh sáng đa s c làm ngu n chi u s h p th ánh sáng c a dung d ch không tuơn theo đ nh lu t h p nh t, b i m i ch t ch h p th ch n l c tia sáng - nh h ng c a pH c a dung d ch S thay đ i [H+] hay pH c a dung d ch s d n t i s l ch kh i đ nh lu t Beer + S thay đ i [H+] làm chuy n d ch cân b ng t o thành ch t màu HnR + Men+ MeR + nH+ + Thay đ i pH d n t i s thay đ i thành ph n h p ch t màu: *Khi t ng pả ph c màu có th b phân hu có s t o thành ph c hiđroxo theo ph n ng c nh tranh: MeR + nOH- Me(OH )n + Rn- Hi n t ng c n đ c bi t l u ý đ i v i ch t có tính ch t thu phân m nh nh : Ti4+; Zr4+; Hf4+ *Thay đ i pH d n t i thay đ i tr ng thái h p ch t màu h p th ánh sáng Do nh h ng c a H +, tr ng thái t n t i màu c a dung d ch c ng thay đ i, u gây s sai l nh kh i đ nh lu t h p nh t, VD : 2CrO42- + 2H+ Cr2O72- + H2O Màu vàng - nh h màu da cam ng c a s pha loãng dung d ch ph c màu Khi pha loãng dung d ch ph c màu có hi n t ng phân li c a ph c màu d n t i s h p th ánh sáng c a dung d ch màu không tuân theo đ nh lu t h p nh t 1.2.4.C u t o c a thi t b đo quang UV-VIS Các thi t b đo quang có nhi u lo i có c u t o khác nhau, song chúng đ u có m t s đ kh i chung nh (Hình 1.3) 7 X D a D D b 2 c Hình 1.3 S đ kh i chung c a thi t b đo quang 1- Ngu n sáng; 3- B ph n t o tia đ n s c; 2- V t kính đ h i t t o tia song song; 4- Cuvet đ ng dung d ch; 5- T bào quang n; 6- B ph n ghi tín hi u; 7- Các khe sáng; 8- B ghi đo (a- n k ; b- thi t b t ghi hay hi n s ; c- thi t b tính) - Ngu n sáng (source) Tu theo yêu c u, n u dùng tia sáng vùng kh ki n dùng đèn s i tóc nung (đèn vonfram) cịn n u dùng tia sáng vùng t ngo i (200 350 nm) ph i dùng đèn d teri ho c đèn thu ngân - B phân t o tia sáng có vùng ph h p (monochromator) ta th t o nh ng chùm sáng có vùng ph h p, thi t b đo quang ng i ng dùng l ng kính (prism), cách t (grating) hay kính l c sáng (filter) N u dùng kính l c đ t o tia đ n s c xa l ng kính vƠ cách t , ta ch t o đ c m t chùm tia có vùng ph h p, ví d n u dùng kính l c sáng có màu l c ánh sáng tr ng chi u qua, s ch cho chùm sáng có b c sóng t 500 560 nm qua Ta bi t ánh sáng không đ n s c s lƠm cho phép đo nh y H u h t thi t b quang hi n s d ng b tán s c cách t nhi u x - Cuvet Khi đo mi n ph kh ki n t t nh t dùng cuvet làm b ng thu tinh quang h c hay b ng thu tinh h u c Nh ng đo mi n ph t ngo i ph i dùng cuvet b ng th ch anh (không đ c dùng cuvet b ng thu tinh thu tinh h p th tia t ngo i) Khi làm vi c v i dung môi d bay h i ph i đ y n p cuvet Khi đo, tu theo mƠu đ m nh t c a dung d ch ph c mà ta ch n b dày c a cuvet cho giá tr đ h p th quang n m kho ng có sai s phép đo nh nh t Hi n ph bi n thi t b đo quang cuvet có b dày cm -Detector: Detector có nhi m v bi n dòng quang thƠnh dòng n r i chuy n vào b ph n ghi đo Tu theo mi n ph c n đo mƠ ta ch n lo i t bƠo quang n có đ nh y cao vùng ph k t qu m i xác Khi dịng sáng đ p vào t bƠo quang n y u, ta thay t bƠo quang n b ng t bƠo nhơn quang n T bƠo nhơn quang n c ng có tác d ng bi n dịng quang thƠnh dòng n nh t bƠo quang n mà cịn có tác d ng khu ch đ i dịng n lên 10a l n, v y có th đo đ c nh ng dịng sáng có c ng đ nh V i thi t b đo quang c , detector th ng dùng t bƠo quang n (photo tube) Hi n ph bi n thi t b quang s d ng nhơn quang n (photomultiplier tube) (Hình 1.4) ho c m ng điot quang (PDA) (Hình 1.5) 10 Hình 2.1 Gi n đ n ng l Hình 2.2 B ng trình hu nh quang lân quang c chuy n m c n ng l ng nguyên nhân gây ph hu nh quang lân quang C ph hu nh quang vƠ lơn quang đ u q trình phát x có b n ch t lƠ ắquang phát quangẰ nh ng th i gian t n t i tr ng thái kích thích c a b c x lân quang kho ng 10-4-10-2 s v i ph hu nh quang 10-9- 10-6 s v y b c x hu nh quang t t t t ánh sáng kích thích Hình d ng ph hu nh quang c ng gi ng ph h p th có đ c m c a phân b Gauss, không ph thu c vƠo ánh sáng kích thích, đ c xác đ nh b i thành ph n, c u trúc c a tâm hu nh quang (nhóm mang màu C=C, C=O, C=S, -N=N-ầ) b nh h ng b i môi tr ng Ph hu nh quang th ng d ch chuy n v phía sóng dài so v i ph h p th m t n ng l ng b i dao đ ng quay c a phân t Các h p ch t h u c phát hu nh quang th ng h p ch t th m ho c d vịng có n i đơi liên h p, phân t có tính đ i x ng, ph ng th ng phát hu nh quang m nh dung d ch d ch nhi t đ phòng C ng đ hu nh quang c a m t ch t t l v i hi u su t hu nh quang c a Hi u su t hu nh quang ph thu c vào r t nhi u y u t nh : - Ánh sáng kích thích 27 Nhi t đ nh t dung d ch N ng đ ch t phát hu nh quang pH dung d ch Các ion c n tr kèm Dung môi Oxi vƠ ch t khí khác dung d ch Do đó, phơn tích m t ch t b ng ph ng pháp ph hu nh quang phơn t c n t i u hóa u ki n phơn tích vƠ gi y u t khác nh h ng không đ i q trình phơn tích, cho c ng đ hu nh quang ch ph thu c vƠ n ng đ c a ch t phơn tích S đ kh i c a thi t b ph hu nh quang phân t nh Hình 2.3 - Hình 2.3 S đ kh i c a thi t b ph hu nh quang phân t 2.3 Nguyên t c thí nghi m Quinin có cơng th c c u t o nh Hình 2.4 Ph h p th ph hu nh quang c a phân t quinin dung d ch H2SO4 0,5 M đ c trình bày Hình 2.5 28 H C H H2C H HO N H MW = 324.41 g mole-1 H3CO N Hình 2.4 Cơng th c c u t o c a quinine (a) (b) Hình 2.5 Ph h p th (a) ph hu nh quang (b) c a quinine H2SO4 0,5M Phân t quinine h p th ánh sáng b c sóng c c đ i 366 nm (hình 2.4a), phân t có ch a h electron liên h p nên có th phát hu nh quang (hình 2.4b) C ng đ hu nh quang (F) c a dung d ch quinine t l thu n v i c ng đ ánh sáng kích thích P0, h s h p th mol n ng đ C (mo/l) F = P0Ω c 29 Tham s Ω đ c tr ng cho s l ng t phát hu nh quang N u n ng đ ch t phân tích l n (l n h n 5.10-5M) n ng l ng chùm sáng qua m u gi m theo hàm s m v i n ng đ theo đ nh lu t Lambe- Beer F= P010- bcΩ B ng cách xây d ng đ ng chu n bi u th s ph thu c c a c ng đ hu nh quang t i b c sóng c c đ i (kho ng 450nm -hình 2.4b) theo n ng đ quinine có th xác đ nh đ c n ng đ quinine n c t ng l c nh h ng c a n n m u đ c đánh giá thông qua vi c xác đ nh quine theo ph ng pháp thêm chu n 2.4 Hóa ch t, d ng c , thi t b - D ng c , thi t b (a) Thi t b quang ph h p th phơn t thi t b Shimadzu RF-5301 PC spectrofluorometer ho c thi t b F-2700 Fluorescence Spectrophotometer (Hitachi) s d ng ngu n đèn Xenon-arc, b đ n s c s d ng h cách t đa v ch đ ch n b c sóng kích thích chi u vƠo dung d ch m u ( ex), b đ n s c đ tán s c ph hu nh quang ( em) h ng t i Detector lƠ ng nhơn quang n (b) Cuvet th ch anh (4 m t su t) (c) Các pipet chia v ch 10 mL, mL mL (d) Bình đ nh m c th y tinh (đư đ c tráng r a s ch tr mL 50 mL (e) Các v t d ng khác a H p đ ng pipet đư s d ng b H p gi y lau c G ng tay Nitrile * Hóa ch t c s d ng) dung tích 25 - Quinine sulfate (chu n c a Sigma-Aldrich, anhydrous, ≥ 98,0% d ng mu i) - Dung d ch H2SO4 3M đ c pha t H2SO4 đ c (p.A) - N c Tonic 2.5 N i dung thí nghi m 2.5.1 Chu n b dung d ch chu n m u phân tích - - Pha dung d ch chu n g c quinine 100 mg/L H2SO4 1M t quinine sunfate H2SO4 3M bình đ nh m c 100 mL, đ nh m c đ n v ch b ng n c c t Pha 500 mL dung d ch H2SO4 0,05 M T dung d ch chu n g c, pha dung d ch chu n quinine 50 mg/L, đ nh m c b ng H2SO4 0,05 M Pha dãy dung d ch chu n quinine n ng đ 0,0, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 4,0 mg/L b ng cách pha loãng t dung d ch chu n 50 mg/L v i H2SO4 bình đinh m c 25 mL Ti n hƠnh xơy d ng đ ng chu n v i n ng đ : 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 ppm 30 H2SO4 0,05M đ đo hu nh quang - Chu n b m u phơn tích: Pha loưng m u n c Tonic 50 -100 l n bình đ nh m c 100mL, thêm 1,5 mL dung d ch H2SO4 3M vƠ đ nh m c t i v ch b ng n c c t - D ng đ ng thêm chu n b ng cách thêm th tích phù h p dung d ch quinine 50 ppm vƠo bình đ nh m c 25 mL đ sau đ nh m c có n ng đ quinine thêm chu n lƠ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 ppm N ng đ H2SO4 vƠ quinie m u gi nh phơn tích b ng ph ng pháp đ ng chu n 2.5.2 Cài đ t thông s thi t b hu nh quang phân t đ quét ph tìm b c sóng kích thích b c sóng phát hu nh quang B t công t c đ kh i đ ng thi t b , b t máy tính vƠ mƠn hình Ch n ph n m m FluoroEssence (click bi u t ng destop) Ki m tra b c sóng kích thích (Excitation) vƠ b c sóng phát x (Emission) Ch n bi u t ng cƠi đ t Method (M) L a ch n ch đ qt ph (Spectra) đ tìm b c sóng c c đ i ph h p th vƠ ph hu nh quang - Sau tìm đ c Ex vƠ Em (xem thêm b n ti ng Anh) cƠi đ t vƠ ch n ch đ đ nh l ng 2.5.3 o m u xác đ nh quinine b ng ph ng pháp hu nh quang phân t - • t Ex vƠ Em t i b c sóng c c đ i tìm đ c • Xác đ nh gi i h n phát hi n (LOD) c a thi t b vƠ đ ng chu n Tr c tri t tiêu tín hi u m u tr ng (zero) đo c ng đ hu nh quang c a m u tr ng đ ng chu n 20 l n, tính LOD theo cơng th c Imin = Ibl + sbl Trong Imin tín hi u th p nh t mà thi t b phát hi n đ Ibl lƠ c c ng đ hu nh quang c a m u tr ng sbl lƠ đ l ch chu n c a m u tr ng (sau 20 l n đo) • Tri t tiêu tín hi u c a dung d ch m u tr ng (zero) vƠ đo c ng đ hu nh quang c a t ng dung d ch D ng đ th đ ng chu n bi u di n s ph thu c c a c ng đ hu nh quang (y) theo n ng đ quinine dung d ch chu n (x) theo ph ng trình y= a+bx • Tính LOD c a thi t b (IDL) theo công th c: IDL= (Imin – a) /b • o c ng đ hu nh quang c a m u thêm chu n vƠ d ng đ th đ ng thêm chu n • So sánh h s góc c a hai đ th đ ng chu n vƠ thêm chu n đ k t lu n có nh h ng c a n n m u hay khơng 31 • Tính n ng đ quine m u theo hai ph ng pháp đ ng chu n vƠ thêm chu n ; so sánh đ ch ch t ng đ i c a k t qu hƠm l ng xác đ nh đ c theo hai ph ng pháp 2.6 Câu h i chu n b Câu Nêu nguyên t c xác đ nh ch t theo ph ng pháp hu nh quang phân t Câu V s đ kh i c a thi t b đo ph hu nh quang phân t ch rõ c u t o b ph n Câu Cách l a ch n b c sóng kích thích vƠ b pháp phân tích ph hu nh quang? Câu Trình bày y u t hu nh quang nh h c sóng phát x ph ng đ n hi u su t hu nh quang vƠ c Câu Nêu cách xác đ nh n ng đ quinine m u n đ ng chu n thêm chu n ng ng đ b c x c t ng l c theo ph ng pháp Câu Có th xác đ nh quinine b ng ph ng pháp ph h p th phân t UV-VIS không? N u đ c trình bày ngun t c phân tích 2.7 T ng trình th c t p Cách chu n b vƠ s li u v pha ch dung d ch chu n, dung d ch m u phơn tích, đ ng chu n vƠ thêm chu n th đ ng chu n vƠ thêm chu n đ i v i ph ng pháp hu nh quang Xác đ nh n ng đ Quinine m u n c Tonic theo hai ph ng pháp (chú ý cơng th c c a quinine sulphate có ng m H2O) Th o lu n k t qu phơn tích: - Các nguyên nhơn gơy sai s ph ng pháp phơn tích - Th c t có th áp d ng ph ng pháp ph h p th đ phơn tích quinine n c t ng l c khơng? tính phù h p c a so v i ph ng pháp ph hu nh quang phơn t - T i ph hu nh quang có đ nh y cao Tài li u tham kh o Tr n T Hi u- Phơn tích tr c quang-Ph h p th UV-VIS- NXB HQG HN2003 Douglas A Skoog, F James Holler, Stanley R Crouch Principles of Instrumental Analysis 7th Edition Cengage Learning; 7th edition,2017) + Chapter 15A - 15C2, ắMolecular Luminescence SpectroscopyẰ, + Section 1E-2, ắStandard Addition MethodsẰ 32 Kellner, R.; Mermet, J.- M.; Otto, M.; Widmer, H M.) Analytical Chemistry Wiley VCH, Weinheim, Germany, 1998 + Section 9.1.5, ắMolecular Fluorescence, Phosphorescence and ChemiluminescenceẰ (pp 535-539) + Section 7.8.3, p 393 (Stern-Volmer relationship) + Section 7.9.3, pp 419-423, (ắFluorescent and Chemiluminescent LabelsẰ section only), + Section 12.2.7, pp 743-744 (standard addition method), 33 Ph l c 1: H ng d n s d ng thi t b hu nh quang F2700- Fluorescence Spectrophotometer Hitachi WAVELENGTH SCAN 34 PHOTOMETRY 35 36 Ph l c 2: H ng d n s d ng thi t b hu nh quang Varian Cary-Eclipse Fluorescence Scan Mode Open the Varian Cary-Eclipse folder Double-click the Shortcut to Scan icon Click Setup Select Emission Setup parameters as: a Excitation wavelength: 350 nm b Scan from Start 350.0 nm to Stop 600.0 nm Make sure Scan control mode is Medium Click OK to accept parameters Always wipe cuvettes with Kimwipes to remove fingerprints or anything else that might interfere with your measurements Wear gloves when handling cuvettes! Place the cuvette with your blank into the cell holder, close compartment, and click Zero 10 Remove blank after scan is complete Insert cuvette with sample (use most concentrated of your dilutions) into the holder and close the compartment Click Start This should show you the optimum value of the Emission wavelength Fluorescence Simple Reads Mode Close the Scan mode Double click Simple Reads Click Setup a Ex (excitation wavelength) should be the same used in scan mode b Em (emission wavelength) is the value you obtained in scan mode Click OK to accept the parameters Place cuvette with blank into the cell holder, close the compartment, and click ZERO Insert your sample into the holder and scan Repeat for all samples 37 Ph l c 3: H ng d n s d ng thi t b (RF-5301 PC spectrofluorometer Shimadzu) Turn on the RF-5301 PC spectrofluorometer Flip the white switch on the right side of the instrument to turn on both the spectrofluorometer and the Xe lamp Never touch the Xe lamp switch! The green power light on the front of the fluorometer is illuminated when the power is on Double click on the RF-50XPC icon on the computer desktop to open the spectrofluorometer software In the software go to Configure in the main menu and choose Instrument… Make sure that the On button next to the fluorometer option is highlighted The other instrument parameters should be: -HV Control: on PMT Protect: on Auto Shutter: off Click OK Allow at least 20 minutes for the lamp to warm up and stabilize Prepare samples Set parameters Go to Acquire Mode in the software main menu and make sure that Spectrum is checked Go to Configure in the main menu and choose Parameters… Set the following parameters: Spectrum Type: Emission EX Wavelength: 366 nm EM Wavelength Range: Start: 350 Recording Range: Low: Scanning Speed: Fast Sample Interval (nm): End: 500 High: 600 1.0 Slit Width (nm): EX: Sensitivity: High Response Time (sec): Auto EM: 1.5 Click OK Rinse the sample cell with small amounts of solution and let it drain nearly dry by turning it upside down and touching the corner to a paper towel Pipet 3.0 mL of the anthracene solution with no CCl4 into the sample cell Wipe the exterior of the 38 cell with a Kimwipe and place the cell carefully in the sample chamber (Be careful with the sample cuvette; it is very expensive!!!) Zero the instrument Click on the Go To WL button on the bottom right of the main screen A window entitled ắWavelength SelectionẰ will pop up Set the following: EX Wavelength: 366 nm EM Wavelength: 450 nm Click Set Click on Auto Zero button on the bottom right of the main screen Scanning the emission spectrum Click on Start button The emission spectrum should appear in the main window After the scan has been completed a window will pop up Give the spectrum a name (for example your initials and the run number) Click on Save This will not save the spectrum on the hard drive It will only save it in a channel in temporary memory Recording intensities Consult a TA about overlaying multiple spectra on a graph Go to Manipulate and choose Peak Pick If you have more than one spectrum displayed you will be asked to choose the spectrum you wish to peak pick A Peak Pick Window will pop up Maximize the Peak Pick Window and scroll down to find the intensity information and record this in your lab notebook The peaks of interest are near 382, 402, and 430 nm Go to File, Data Transition, and ASCII Export to convert data to notepad format for easy import into Excel Then save the data after completion of the experiment All data can be compressed in a Zip file and emailed or uploaded to Netfiles Consult a TA if you need help Close the Peak Pick window Repeat steps and for the other five CCl4/anthracene samples Note: as the amount of quencher increases the position of the peak maxima may shift slightly After you have completed all of the CCl4 samples and have the intensity data for each of the samples for all three wavelengths, go to File and choose Channel and then choose Erase Channel… Select All and click OK (A warning about saving the data to disk may pop up Click Yes and continue.) This will erase all of the data Make sure you have all the information you need and it is saved on the hard drive Note: After erasing the channel, go to Configure in the main menu and choose Instrument Make sure the On button next to the fluorometer is highlighted Sometimes, after erasing channels, the Fluorometer On button switches to Off 10 Disposal of wastes Dispose of all wastes in the waste container marked "HALOGENATED ORGANIC WASTE." Do not pour anything in the sink 11 Prepare samples 12 Repeat steps 3-10 with the samples prepared in step 11 Experimental directions (Part Two) 39 Prepare samples Place 2.00 mL of one brand of tonic water in a 100 mL volumetric flask Add 1.0 mL of 3M H2SO4 and dilute to the mark with distilled water Set parameters Go to the Acquire Mode in the software main menu and make sure that Spectrum is checked Go to Configure in the main menu and choose Parameters… Set the following parameters: Spectrum Type: Emission EX Wavelength: 337 nm EM Wavelength Range: Start: 350 Recording Range: Low: Scanning Speed: Fast Sample Interval (nm): End: 500 High: 600 1.0 Slit Width (nm): EX: Sensitivity: High Response Time (sec): Auto EM: 1.5 Click OK Pipet 3.0 mL of the sample into the sample cuvette Zero the instrument Click on the Go To WL button on the bottom right of the main screen A window entitled ắWavelength SelectionẰ will pop up Set the following: EX Wavelength: 337 nm EM Wavelength: 350 nm Click Set Click on Auto Zero button on the bottom right of the main screen Scanning the emission spectrum Click on the Start button The emission spectrum should appear in the main window After the scan has been completed a window will pop up Give the spectrum a name (for example your initials and the run number) Click on Save This will not save the spectrum on the hard drive It will only save it in a channel in temporary memory Recording intensities Go to Manipulate and choose Peak Pick If you have more than one spectrum displayed you will be asked to choose the spectrum you wish to peak pick A Peak Pick Window will pop up In the Peak Pick Window scroll down and find the intensity information and record this in your lab notebook The peak of interest is around 450 nm Go to File, Data Transition, and ASCII Export to convert data to notepad format for easy import into Excel Then save the data 40 All data can be compressed in a Zip file and emailed or uploaded to Netfiles Close the Peak Pick window Perform the standard addition Add 0.100 mL of the 50.0 ppm quinine sulfate stock solution to the sample cuvette Mix the sample solution with a disposable pipet by drawing in the solution and expelling it Be extremely careful not to scratch the inside of the cuvette with the pipet tip Repeat steps and Repeat step until five standard additions have been made After you have completed all of the standard additions and have the intensity data for each addition, go to File and choose Channel and the choose Erase Channel… Select All and click OK (A warning about saving the data to disk may pop up Click Yes and continue.) This will erase all of the data The data is not saved on the hard drive so make sure you have all the information you need Note: After erasing the channel, go to Configure in the main menu and choose Instrument Make sure the On button next to the fluorometer is highlighted Sometimes, after erasing channels, the Fluorometer On button switches to Off 10 Correct the fluorescence readings for dilution using the formula given in the Experiment Introduction 11 Dispose of all wastes in the waste container marked "Fluorescence-Hal." Do not put anything in the sink 12 Repeat steps - 11 for the other brand of tonic water If there are suspended solids in the commercial tonic waters, try not to transfer them to the volumetric flask BEFORE YOU LEAVE: Turn off the RF-5301 PC spectrofluorometer Be sure you are finished Flip the white switch on the right side of the instrument to turn off both the spectrofluorometer and the Xe lamp Never touch the black Xe lamp switch! Exit the software Return sample cell to its box Clean and dry all glassware that you used and return them to the appropriate drawer Return all solvents and stock solutions to the proper cabinet 41 ... kh ki n đ c th hi n Hình 1. 1 Hình 1. 1 S đ b B c chuy n d i n ng l ng c chuy n n ng l (nm) N ng l ng c a electron ng kích thích E(Kcal/mol) n n * 12 0 230 * 16 0 18 4 * 18 0 16 2 280 82 * Thơng th ng... amoni 10 0,0 ppm, c n pha loưng n chu n làm vi c 10 ppm + 12 H2O cđ đ c dung d ch *Dung d ch natri nitropussiat 0 ,1% (w/v): Cân 0,1g natri nitropussiat (Na2[Fe(CN)5NO].2H2O ), cho vƠo bình 10 0ml... cu i c a N-NH4+ (ppm) t 0 ,1- ppm, l n l t thêm th 4ml dung d ch natri nitroprussiat 0 ,1% lƠm xúc tác; 0,25ml dung d ch NaClO 0 ,1% pha đ m pH = 11 theo t l th tích 1: 10 ; ml dung d ch thu c th