NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CONESSINE TRONG DƯỢC LIỆU MỨC HOA TRẮNG (Holarrhena pubescens Wall.ex G.Don)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA HÓA HỌC BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CONESSINE TRONG DƯỢC LIỆU MỨC HOA TRẮNG (Holarrhena pubescens Wall ex G Don) Cán bộ hướng dẫn Nơi thực hiện Viện Dược liệu HÀ NỘI 2021 LỜI CẢM ƠN Báo cáo Nghiên cứu khoa học được thực hiện tại Khoa Hóa Thực vật I – Viện Dược liệu Trung Ương; số 3B, Quang Trung, phường Tràng Tiền, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội; tháng 8 năm 2020 – tháng 4 năm 2021 Với tấm lòng trân.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA HÓA HỌC . BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CONESSINE TRONG DƯỢC LIỆU MỨC HOA TRẮNG (Holarrhena pubescens Wall.ex G.Don) Cán hướng dẫn: Nơi thực hiện: HÀ NỘI - 2021 Viện Dược liệu LỜI CẢM ƠN Báo cáo Nghiên cứu khoa học thực Khoa Hóa Thực vật I – Viện Dược liệu Trung Ương; số 3B, Quang Trung, phường Tràng Tiền, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội; tháng năm 2020 – tháng năm 2021 Với lòng trân trọng lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới: – Trưởng khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu giao đề tài tạo điều kiện giúp đỡ em trình viết luận – mơn Hóa học hữu cơ, khoa Hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tin tưởng giới thiệu cho em có hội thực đề tài Viện Dược liệu – Nghiên cứu viên, khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu tận tình bảo, tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian qua Em xin gửi lời cảm ơn đến tất anh chị, bạn bè khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu tạo điều kiện, giúp đỡ để em hoàn thành đề tài cách tốt Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, tháng năm 2021 Sinh viên ĐẶT VẤN ĐỀ Mức hoa trắng thuốc nam quý Việt Nam, tìm thấy nhiều quốc gia Ấn Độ, Thái Lan, Malaysia hay Miễn Điện… Riêng nước ta, mọc hoang khắp nơi Điển hình tỉnh miền Bắc Cao Bằng, Vĩnh Phúc, Lạng Sơn, Phú Thọ, Hịa Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang… Được sử dụng rộng rãi để làm thuốc phục vụ đời sống người Theo Y học cổ truyền, Mức hoa trắng có thành phần hóa học đa dạng dược tính cao để điều trị bệnh kiết lỵ viêm đại tràng Để góp phần nâng cao giá trị sử dụng dược liệu này, thực đề tài: “Nghiên cứu phương pháp phân lập xác định conessine dược liệu Mức hoa trắng (Holarrhena pubescens Wall.ex G.Don)” Contents ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC LỤC HÌNH ẢNH I TỔNG QUAN I.1 Đặc điểm thực vật phân bố sinh thái .7 I.1.1 Vị trí phân loại chi Holarrhena I.1.2 Đặc điểm chung họ Trúc đào (Apocynaceae) .7 I.1.3 Chi Holarrhena Việt Nam I.1.4 Đặc điểm thực vật loài Mức hoa trắng (Holarrhena pubescens Wall.ex) G.Don I.2 Thành phần hóa học Mức hoa trắng ( Holarrhena pubescens Wall.ex) .11 I.3 Tác dụng dược lý 12 I.3.1 Chữa bệnh kiết lỵ 12 I.3.2 Ngăn ngừa điều trị bệnh viêm đại tràng 12 I.3.3 Chữa lỵ amip .12 I.4 Về Alcaloid 13 I.4.1 Khái niệm alcaloid 13 I.4.2 Các phương pháp định tính định lượng alcaloid 13 I.5 Về alcaloid mức hoa trắng 15 I.5.1 Một số phương pháp phân lập alcaloid toàn phần 15 I.5.2 Các phương pháp phân lập conessine dược liệu .16 II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 II.1 Đối tượng nghiên cứu 17 II.2 Trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 17 II.3 Hóa chất, dung mơi 18 II.5 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật sử dụng 18 III Thực nghiệm 18 IV Kết bàn luận 19 IV.1 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH = 7/3 19 IV.2 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH/TMA= 7/3/1% 19 IV.3 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH/TMA= 7/3/0,5% 20 IV.4 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH/TMA= 7/3/0,25% 21 V Tài liệu tham khảo 23 MỤC LỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT P L C L C Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) Sắc kí đồ K Đ Ethylacetate tO A c Cloroform H Cl Dichloromethane C M Methanol e O H Trimethylamine M A Natri cacbonat a2 C O I TỔNG QUAN I.1 Đặc điểm thực vật phân bố sinh thái I.1.1 Vị trí phân loại chi Holarrhena Theo hệ thống phân loại Takhtajan 1987, chi Holarrhena thuộc[3],[4], [6]: - Giới thực vật (Plantae) - Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) - Lớp Ngọc lan (Magroliopsida) - Phân lớp Hoa môi (Lamiidae) - Liên Long đởm (Gentiananae) - Bộ Long đởm (Gentianales) - Họ Trúc đào (Apocynaceae) - Chi Holarrhena I.1.2 Đặc điểm chung họ Trúc đào (Apocynaceae) Họ Trúc đào có đặc điểm sau: - Cây gỗ, bụi, có dây leo cỏ Cây có nhựa mủ trắng - Lá đơn, nguyên, mọc đối hay mọc vịng, khơng kèm (ít mọc cách) - Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5, xếp thành chùm gồm nhiều cụm hoa đơn vị xim Lá đài thường có vảy tuyến Cánh hoa có thùy phần trên, xếp xoắn ốc hợp lại thành ống Ống tràng có phần phụ phía trong, thùy tràng xếp vặn (ít xếp lợp) Nhị đẳng số, đính ống tràng xen kẽ với thùy tràng Chỉ nhị ngắn hình mũi tên, bao phấn dài nhọn chụm lại đỉnh hay dính với đầu nhụy Có triền hình vịng hay hình chén tuyến mật riêng rẽ Bộ nhụy thường gồm nỗn, nỗn thường dính gốc đỉnh vịi, với núm nhụy phình rộng Hạt phấn rời Đĩa tuyến mật bao quanh bầu Bầu có hai noãn gắn liền với phần trên.[3],[4],[6] - Quả gồm đại dài hay hình cầu chỗi ra, khơ khơng mở Hạt thường có cánh hay có chùm lơng ở đầu Hình I.1.2 Cành, lá, hoa, Mức hoa Trắng(Holarrhena pubescens Wall.ex) Họ Trúc đào có khoảng 200 chi với 2000 loài, phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, số vùng ôn đới, Việt Nam có khoảng 52 chi, 170 lồi, phần lớn mọc hoang, số trồng làm cảnh I.1.3 Chi Holarrhena Việt Nam Holarrhena R.Br chi nhỏ, có lồi vùng nhiệt đới châu Phi châu Á Ở Việt Nam có lồi: - H antidysenterica Wall (H pubescens Wall ; H malaccensis Wight.) - H curtisii King et Gamble (H crassifolia Pierre in spire) - H similis Craib Trong đó, H curtisii H similis loài chưa nghiên cứu.[1] I.1.4 Đặc điểm thực vật loài Mức hoa trắng (Holarrhena pubescens Wall.ex) G.Don I.1.4.1 Tên gọi - Tên khoa học: Holarrhena antidysenterica Wall., họ Trúc đào (Apocynaceae).[3] - Tên khác: Mức lông, Sừng trâu, Thừng mực to, Mực hoa trắng.[4] - Tên đồng nghĩa: Echites antidysenterica Roxb ex Flem., Holarrhena antidysenterica (Roxb ex Flem.) A DC - Tên nước ngoài: Conessi bark, kurchi bark, bitter oleander, dysentery rose-bay, tellicherry bark (Anh); ecorce de codagapala (Pháp) I.1.4.2 Đặc điểm thực vật Cây gỗ to mọc thẳng đứng cao 10 m, có nhựa mủ trắng Thân già màu nâu đen xù xì có lớp vỏ dày, thân non màu xanh màu đỏ nâu có nhiều lơng che chở màu trắng [3],[4],[6] Lá đơn, nguyên, mọc đối; phiến hình xoan hình trứng đỉnh kéo dài thành mũi nhọn dài 0,5-1 cm, màu xanh đậm mặt mặt dưới, có lơng trắng mặt nhiều mặt trên, kích thước dài 7-11 cm, rộng 5-6 cm Gân hình lơng chim, 9-13 cặp gân phụ cấp chếch không đối chạy sát mép nối mép mờ, gân phụ cấp hình lưới rõ Cuống ngắn, hình trụ, dài 0,5-0,6 cm, màu xanh, nhiều lơng Khơng có kèm Cụm hoa xim ngả mọc nách cành, cuống cụm hoa dài 1,5-2 cm Hoa màu trắng, thơm, đều, lưỡng tính, mẫu Cuống hoa dài 1-1,5 cm, màu xanh, có lơng dày Lá bắc bắc dạng vẩy màu xanh có lơng, tồn lâu Đài hoa: đài nhỏ, đều, rời, màu xanh, dạng vẩy dài 0,15-0,2 cm, rộng 0,7-1 cm, mặt ngồi có nhiều lơng màu trắng; có tuyến hình vảy màu vàng gốc mặt đài, tiền khai năm điểm Tràng hoa: cánh hoa đều, màu trắng, dính phía tạo thành ống phình to gần đáy dài 0,4-0,5 cm, phiến phía hình thn dài đầu tù, dài 1,3-1,5cm, rộng 0,3-0,4 cm, mặt phiến có lơng tiết dính, mặt ngồi có lơng che chở, tiền khai vặn theo chiều kim đồng hồ; họng tràng có tràng phụ dạng mỏng chia 2-3 thùy, dài 0,8-1 cm, rộng 0,2-0,3 cm, màu hồng, có lơng Bộ nhị: nhị đều, rời; nhị ngắn đính họng tràng; bao phấn màu vàng chụm vào nhau, chung đới kéo dài thành mũi nhọn dính với đầu nhụy, dài 0,7-0,8 cm Hạt phấn rời, hình cầu màu vàng, đường kính 52,5 µm Bộ nhụy: noãn rời, bầu trên, màu xanh, hình trứng cao 0,1-0,15 cm, nhiều nỗn đính bên vịi nhụy hình trụ trịn, màu trắng, dài 0,6 -0,7 cm; đầu nhụy hình nón dài 0,5 mm màu vàng nhẵn 10 I.1.4.3 Phân bố, sinh thái Mức hoa trắng phân bố rải rác vùng Nam Á Đông Nam Á, bao gồm Ấn Độ, Srilanca Mianma, Thái Lan, Bắc Malaysia, Campuchia, Lào, Việt Nam Nam Trung Quốc Cây có vùng nhiệt đới châu Phi Ở Việt Nam mức hoa trắng thường thấy vùng núi thấp trung du, thuộc tỉnh từ Tây Ninh, Bình Dương, Đồng Nai, Lâm Đồng dọc theo miền Trung đến tỉnh giáp biên giới Trung Quốc Cao Bằng, Quảng Ninh, Lạng Sơn Độ cao phân bố 600m.[6] Mức hoa trắng ưa sáng, chịu hạn tốt có rễ cọc phát triển Cây thường mọc quần hệ thứ sinh có gỗ to, đồi hay kiểu rừng thưa nửa rụng tỉnh Nam Tây Ngun (Đắc Lắc, Bình Thuận, Đồng Nai,…) Đơi gặp kiểu rừng xen tre nứa Cây sinh trưởng mạnh mùa mưa ẩm, rụng vào mùa đơng Sau lá, có hoa; hoa thụ phấn nhờ côn trùng Lượng hoa thường lớn Quả già tách thành hai mảnh, hạt có túm lơng, phát tán nhờ gió Ở Ấn Độ người ta xác định kg hạt có từ 32.000 – 35.000 hạt; hạt tươi có sức nảy mầm cao vòng 2-3 tuần Hạt để sau năm khơng cịn khả nảy mầm Mức hoa trắng có khả tái sinh chồi khỏe sau bị chặt Cây tồn qua đợt cháy rừng, có phần vỏ thân dày nhiều nhựa mủ, tái sinh vơ tính từ đoạn thân, cành hay rễ Nguồn mức hoa trắng Việt Nam tương đối dồi dào, tỉnh phía nam, từ Nghệ An trở vào I.2 Thành phần hóa học Mức hoa trắng ( Holarrhena pubescens Wall.ex) Vỏ thân chứa 9,5% gôm; 6,2% chất nhựa; 1,14% tannin; triterpen alcol; lupeol; β-sitosterol; ankan nhiều alcaloid [3],[4] Hàm lượng alcaloid thay đổi tùy theo phát triển cây, cao vào lúc – 12 tuổi Hàm lượng alcaloid toàn phần: 0,22 – 4,2% vỏ Cho tới tìm thấy nhiều alcaloid như: 11 - Conessimin (C23H28N2) - Isoconessimin (C23H38N2) - Holarimin (C21H34N2O) - Conimin (C22H36N2) - Conarimin (C21H34N2) - Holaremin (C24H38ON2) - Cokurchin (C21H32N2) - Conessine (C24H40N2)… Trong conessine Hình I.2.1- Cơng thức phân tử Conessine alcaloid chủ yếu Conessine có tinh thể hình lăng trụ (kết tinh acetone) điểm chảy 125°, [a]D= -l,9°(CHCl3) +21°6(C2H5OH) Muối chlohydrat, bromhydrat oxalat conessine tồn dạng tinh thể Độ tan nước Conessine base 1/5, độ tan ethanol 90° 1/11, tan ether - Thành phần hóa học khác cây: + Chất nhựa: Chất nhựa mủ (chứa nước chất tan nước) chiếm 57,91%, cao su chiếm 1,5-9,7%, chất tủa keo có cao su chiếm 15-22,8%, nhựa chiếm 74,1 - 82,8%, chất không tan chiếm 0,9-5,9% Hai chất alcol nhựa (resinol) tách từ nhựa mủ là: Lettoresinol A (C 28H50O5) độ chảy 227280°C, Lettoresinol B (C28H56O2) độ chảy 136-137°C Ngồi ra, mức hoa trắng cịn chứa triterpen alcol, lupeol (3 –sitosterol) + Gơm: Chất gơm có màu nâu, vị đắng, có tỷ trọng 1,092; số acid 65,28; số ether 106; số xà phòng 171,42 số acetyl 150,52 + Glycosid: Nhóm tác giả Pháp phân lập từ vỏ glycosid: Normitiphyllin, holarosin A holarosin B 12 + Các hợp chất vô cơ: Tro từ gỗ mức hoa trắng giàu chất kali gồm 17,5% chất tan có: K2CO3 (10,82%), KC1 (4,2%), K2SO4 (2,48%) chất tro không tan 80,24% I.3 Tác dụng dược lý I.3.1 Chữa bệnh kiết lỵ - Kiết lỵ bệnh đường ruột gây vi khuẩn salmonella shigella Để chữa bệnh kiết lỵ, bạn cần bổ sung chất lỏng bị tiêu chảy Cách chữa kiết lỵ từ mộc hoa trắng đơn giản: + Chuẩn bị: Phần vỏ mộc hoa trắng với lượng tùy ý + Thực hiện: Đem phơi khô dược liệu tán thành bột mịn Có thể sắc với nước hịa với nước sơi ấm uống ngày 10 – 15g Dùng liên tục đặn đến triệu chứng bệnh thuyên giảm I.3.2 Ngăn ngừa điều trị bệnh viêm đại tràng - Là bệnh phổ biến hệ tiêu hố, khó để điều trị dứt điểm Người bệnh thường xuyên bị làm phiền đau đại tràng tình trạng rối loạn tiêu hố Ngun nhân bắt nguồn từ việc nhiễm khuẩn đường tiêu hố thói quen ăn uống thiếu vệ sinh Một số thuốc trị viêm đại tràng từ mộc hoa trắng: + Bài thuốc 1: Cần chuẩn bị vỏ mộc hoa trắng với lượng tùy ý Đem tán thành bột mịn Mỗi ngày dùng 10g sắc chung với nước để uống ấm + Bài thuốc 2: Cần chuẩn bị phần hạt mộc hoa trắng Cũng đem tán dược liệu thành bột ngày lấy khoảng 10 -15g sắc lấy nước uống ngày Mỗi ngày uống nhiều lần cần trì thời gian dài I.3.3 Chữa lỵ amip - Là bệnh nhiễm ký sinh trùng đường ruột gây sinh vật đơn bào (entamoeba histolytica) Bệnh tiến triển kéo dài trở thành mạn tính khơng điều trị cách Do việc kiểm sốt thực phẩm cần nghiêm ngặt, nguồn rau, củ, 13 + Vỏ cây, vỏ cành lớn mức hoa trắng tán bột mịn, lần uống 10g bột Hoặc sắc với nước + Mức hoa trắng, hoàng đằng, vị 10g, sắc uống trước bữa ăn khoảng 1,5 Không nên uống lúc đói, để tránh bị nơn nao, cồn cào ruột gan Khi uống cần kiêng ăn thức ăn có tính tanh, lạnh cua, cá, ốc + Hạt mức hoa trắng 3-6g, tán bột sắc nước uống + Cao lỏng hạt mức hoa trắng uống ngày 1-3g Trên lâm sàng sử dụng dạng bào chế conessine hydroclorid hay hydrobromid để chữa lỵ amip, đạt hiệu lực thuốc trị lỵ amip truyền thống emetin, độc tiện dùng emetin Vì conessine có tác dụng với kén amip I.4 Về Alcaloid I.4.1 Khái niệm alcaloid Alcaloid có nguốn gốc từ chữ: alkali tiếng Ả rập kiềm Alcaloid là: - Những hợp chất hữu có chứa dị vịng nitơ, có tính bazơ thường gặp nhiều lồi thực vật đơi cịn tìm thấy vài lồi động vật - Có phản ứng kiềm cho muối với acid muối dễ kết tinh - Có hoạt tính sinh học quan trọng - Có số phản ứng chung tạo “ kết tủa” cần thiết cho xác định chúng I.4.2 Các phương pháp định tính định lượng alcaloid Người ta định tính, định lượng tồn alcaloid hay vài alcaloid hoạt chất dược liệu Có nhiều phương pháp định tính, định lượng phương pháp cân, phương pháp HPLC, phương pháp sắc ký mỏng TLC.[5] I.4.2.1 Phương pháp cân - Phạm vi sử dụng: alcaloid có tính base yếu, alcaloid khơng chuẩn độ phương pháp acid – base, số điện ly bé khơng có bước nhảy đường cong chuẩn độ nên không quan sát 14 chuyển màu rõ rệt thị Ngoài ra, phương pháp cân dung trường hợp định lượng alcaloid chưa xác định rõ cấu trúc hóa học hỗn hợp nhiều alcaloid có phân tử lượng khác Để định lượng alcaloid phương pháp, cần phải chiết alcaloid tinh khiết dung mơi thích hợp, đem cô dung môi, sấy cắn tới khối lượng không đổi đem cân (Nếu hàm lượng alcaloid thấp định lượng phương pháp cân trực tiếp khó xác, tạo dẫn xuất có khối lượng phân tử lớn cách cho alcaloid tác dụng với thuốc thử tạo kết tủa) I.4.2.2 Phương pháp HPLC [5] - Ưu điểm: Phương pháp HPLC có độ xác độ nhạy cao, có tính đặc hiệu, thực tương đối nhanh thuận tiện Cách tiến hành định lượng alcaloid phương pháp HPLC: - Alcaloid tinh khiết làm chất chuẩn - Xây dựng phương pháp chiết alcaloid dược liệu đáp ứng yêu cầu định lượng - Xây dựng chương trình phân tích máy HPLC (pha tĩnh, pha động, detceter, tốc độ dòng, thể tích tiêm, nhiệt độ phân tích) - Tính kết quả: hàm lượng alcaloid cần định lượng tính dựa diện tích pic chất chuẩn chất thử thu sắc ký đồ theo công thức: Sr: diện tích pic alcaloid cần định lượng thu sắc ký đồ dung dịch thử Sc: diện tích pic alcaloid chuẩn thu sắc ký đồ dung dịch chuẩn mc: lượng cân mẫu chuẩn (mg) mr: lượng cân mẫu thử (mg) Cc: hàm lượng alcaloid chuẩn (%) b: độ ẩm dược liệu 15 I.4.2.3 Phương pháp sắc kí mỏng (TLC) Muốn định tính alcaloid phải chiết xuất alcaloid ra, loại chất trở ngại cho phản ứng, sau làm phản ứng tạo tủa, tạo màu thuốc thử chung alcaloid Ngày nay, kết hợp phương pháp sắc ký lớp mỏng có alcaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh Trong sắc ký mỏng dùng: - Chất hấp phụ silicagel, nhôm oxit, bột cellulose… - Tùy theo alcaloid mà người ta chọn hệ dung môi khai triển cho thích hợp Một hệ dung mơi hay dung như: CHCl – MeOH – NH4OH = (50:9:1), Toluene: ethyl acetate: đietyl amin = (6,5:2,5:1) - Thuốc thử: + Thuốc thử Mayer (K2HgI4 = Kali tetra iodo mercurat): cho tủa trắng, vàng nhạt + Thuốc thử Bouchardat (Ido - iodua): cho tủa nâu + Thuốc thử Dragendorff (KBiI4): cho tủa màu vàng da cam đến đỏ gạch + Thuốc thử Bertrand (acid silicotungstic): cho màu vàng hay trắng + Thuốc thử muối Reinecket {NH4Cr(CNS)4 (NH3)2} =Ammoni tetra sulfocyanur diamin cromat III + Thuốc thử acid picric bão hòa: cho tinh thể picrat alcaloid + Ngồi cịn thuốc thử AuCl3; PtCl3; picrolonic Thuốc thử bắt màu thường dung Dragendorff (KBiI4) I.5 Về alcaloid mức hoa trắng I.5.1 Một số phương pháp phân lập alcaloid toàn phần I.5.1.1 Nghiên cứu nước Phạm Thanh Kỳ cộng [1] phân lập Conessin Norconessin alcaloid toàn phần chiết xuất từ vỏ thân Mức hoa trắng sắc kí cột theo qui trình sau: Cột sắc ký kích thước 2cm x 50cm lắp thẳng đứng giá Vặn chặt khóa cột Lót lớp mỏng đáy cột Cho từ từ silicagel cloroform vào cột Lót miếng giấy lọc có đường kính đường kính cột 16 bề mặt silicagel Cuối đặt lớp mỏng miếng giấy lọc Mở khóa cho dung mơi chảy từ từ đến lớp cloroform cột vừa đến bề mặt bơng Vặn khóa cột lại Hịa 0,471 g cắn alcaloid toàn phần lượng tối thiểu cloroform vào cốc có mỏ Đổ từ từ dịch cloroform vào cột Rửa giải alcaloid cột cloroform methanol, tăng dần độ phân cực sau: CHCl3 (99,5 ml) : MeOH (0,5 ml) (I) CHCl3 (99 ml) : MeOH (1 ml) (II) CHCl3 (98,5 ml) : MeOH (1,5 ml) (III) CHCl3 (98 ml) : MeOH (2,0 ml) (IV) Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm, ống ml Kiểm tra dịch rửa giải TLC, thu phân đoạn tinh khiết cho vết SKĐ, từ ống 33 – 36 xác định Conessin, từ ống 85–98 xác định Norconessin I.5.1.2 Nghiên cứu nước Kumar N [7] phân lập Conessin từ cắn alcaloid tồn phần sắc kí cột theo qui trình sau: 11,9 g cắn alcaloid nạp vào cột, pha tĩnh alumina, pha động benzen dầu hỏa (60-80 ◦C) : EtOAc với tỉ lệ EtOAc tăng dần Kiểm tra phân đoạn TLC Phân đoạn từ ống 19–23, có tỉ lệ dung mơi benzen dầu hỏa : EtOAc (95 : 5) cho vết SKĐ, xác định Conessin I.5.2 Các phương pháp phân lập conessine dược liệu I.5.2.1 Nghiên cứu nước Hoàng Thị Tuyết Nhung [2] phân lập conessine từ alcaloid toàn phần: 12,0 g cắn alcaloid toàn phần hòa tan 300 ml ether dầu hỏa, rửa giấy lọc tủa 50 ml ether dầu hỏa Lắc lần dịch chiết ether dầu hỏa với dung dịch HCl 10%, lần 150 ml Gộp dịch chiết nước acid kiềm hóa dịch chiết nước acid Na2CO3 đến pH = - 10 cách cho từ từ Na 2CO3 vào dung dịch, đồng thời khuấy đến dung dịch khơng có bọt Chiết 17 ether dầu hỏa lần, lần 300 ml Gộp dịch chiết ether dầu hỏa làm khan dịch chiết cách lọc dịch chiết ether dầu hỏa qua giấy lọc khô, cất thu hồi ether dầu hỏa, cắn thu hòa tan 50 ml dung dịch acid oxalic 17,5% ethanol Để yên nhiệt độ phòng để thu tinh thể Conessine hydrooxalat, lọc lấy tinh thể Hòa tan tinh thể thu 300 ml nước Kiềm hóa dung dịch đến pH = - 10 cách cho từ từ Na2CO3 đến hết bọt để tạo tủa Conessine base Chiết Conessine base lần ether dầu hỏa, lần 50 ml Gộp dịch chiết ether dầu hỏa làm khan dịch chiết cách lọc dịch chiết ether dầu hỏa qua giấy lọc khô, cất thu hồi ether dầu hỏa, thu sản phẩm Đem kết tinh sản phẩm acetone, để yên nhiệt độ phòng thu Conessine tương đối tinh khiết Lọc lấy tinh thể, sấy áp suất giảm 60◦C giờ, sử dụng chất hút ẩm phosphor pentoxyd (P 2O5) thu 2,55 g sản phẩm Xác định hàm lượng Conessine phân lập đạt độ tinh khiết khoảng 82,50% II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu: Mẫu cao chiết Mức hoa trắng Thời gian nhận mẫu: tháng năm 2020 Mẫu giám định tên khoa học khoa Tài nguyên, Viện Dược liệu II.2 Trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu - Hóa chất: Dung môi dùng chiết xuất dung môi công nghiệp cất lại Các hóa chất, dung mơi dùng cho kết tinh, tinh chế dung môi tinh khiết Trung Quốc - Các dụng cụ cần thiết trình thực nghiệm bình nón, cốc có mỏ, ống nghiệm, pipet, phễu, - Thu hồi dung môi máy cất quay Rotavapor R-114 hãng BUCHI – Viện Dược liệu - Cân phân tích PRECISA 262SMA-FR – Viện Dược liệu 18 II.3 Hóa chất, dung mơi - Dung môi: methanol, trimethylamine, ethyl acetate, toluen, dichloromethane… dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn phân tích, dung mơi dùng chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp chưng cất lại trước dùng - Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck) - Silicagel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck) - Hóa chất: hóa chất để làm phản ứng định tính phương pháp hóa học, định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) II.5 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật sử dụng - Phân lập conessine từ cao chiết Mức hoa trắng III Thực nghiệm III.1 Phân lập conessine từ thân vỏ Mức hoa trắng Từ cao chiết Mức hoa trắng, phân lập sắc ký cột với: + Chất nhồi cột Silicagel có cỡ hạt 40 - 63 µm (Merck) + Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký có kích thước cm x 50 cm Lắp thẳng đứng cột giá Vặn chặt khoá cột lại Lót lớp bơng mỏng đáy cột Cho từ từ sillicagel dichloromethane vào cột Mở khoá cho dung môi chảy qua cột nhiều lần Để cột ổn định 12 + Tiến hành sắc ký cột: Mở khố cho dung mơi chảy từ từ đến lớp dichloromethane cột vừa đến bề mặt Vặn khoá cột lại Nghiền 3g cao Mức hoa trắng với lượng tối thiểu sillicagel cối đổ vào cốc có mỏ Đổ từ từ hỗn hợp vào cột Rửa giải conessine cột dichloromethane, methanol, trimethylamine tăng dần độ phân cực Xác định sơ độ tinh khiết chất phân lập kiểm tra sơ TLC 19 IV Kết bàn luận IV.1 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH = 7/3 Hứng dịch rửa giải hệ (1) vào bình nón, bình nón 100 ml Kiểm tra dịch rửa giải TLC, khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : thu kết sau: + Từ bình nón đến bình nón 10 có vết phun thuốc thử Dragendorff Gộp bình nón đến bình nón 10 đem cơ, thu cắn (1) Hịa tan cắn thu lượng tối thiểu Acetonitrile tiếp tục kiểm tra TLC khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : thu kết sau: - Dung dịch cắn (1) xuất vết phun thuốc thử Dragendorff Nhận xét: vết xuất dung dịch cắn (1) conessine R f khác so với Rf conessine mẫu chuẩn cao chiết IV.2 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH/TMA= 7/3/1% Thêm TMA để tăng dần độ phân cực dung môi Hứng dịch rửa giải hệ (2) vào ống nghiệm, ống nghiệm ml Kiểm tra dịch rửa giải TLC, khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : thu kết sau: + Từ ống nghiệm đến ống nghiệm 10 có vết phun thuốc thử Dragendorff Gộp ống nghiệm đến ống nghiệm 10 đem cô, thu cắn (2) Hòa tan cắn thu lượng tối thiểu Acetonitrile tiếp tục kiểm tra TLC khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : thu kết sau: - Dung dịch cắn (2) xuất vết phun thuốc thử Dragendorff Nhận xét: vết xuất dung dịch cắn (2) IV.3 Khai triển hệ dung mơi DCM/MeOH/TMA= 7/3/0,5% Giảm thiểu lượng TMA TMA gây độc cấp tính mãn tính đề xuất tài liệu y khoa kỷ 19 TMA có mùi khai (ở nồng độ cao), gây kích ứng mắt da 20 Hứng dịch rửa giải hệ (3) vào ống nghiệm, ống nghiệm ml Kiểm tra dịch rửa giải TLC, khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : thu kết sau: + Từ ống nghiệm đến ống nghiệm không thấy xuất vết phun thuốc thử Dragendorff + Từ ống nghiệm đến ống nghiệm 23 thấy xuất vết phun thuốc thử Dragendorff + Từ ống nghiệm 24 đến ống nghiệm 40 thấy xuất vết phun thuốc thử Dragendorff Gộp từ ống nghiệm đến ống nghiệm 8, từ ống nghiệm 24 đến ống nghiệm 40 đem cô, thu cắn (3.1) Gộp từ ống nghiệm đến ống nghiệm 23, đem cơ, thu cắn (3.2) Hịa tan cắn thu lượng tối thiểu Acetonitrile tiếp tục kiểm tra TLC khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : thu kết sau: - Dung dịch cắn (3.1) không thấy xuất vết phun thuốc thử Dragendorff - Dung dịch cắn (3.2) thấy xuất vết phun thuốc thử Dragendorff Hình IV.3 - SKĐ hệ dung môi (3) Nhận xét: vết xuất dung dịch cắn (3.2) có R f trùng với Rf conessine mẫu chuẩn conessine cao chiết 21 IV.4 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH/TMA= 7/3/0,25% Hứng dịch rửa giải hệ (4) vào ống nghiệm, ống nghiệm ml Kiểm tra dịch rửa giải TLC, khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : thu kết sau: + Từ ống nghiệm đến ống nghiệm 41 không thấy xuất vết phun thuốc thử Dragendorff + Từ ống nghiệm 42 đến ống nghiệm 46 thấy xuất vết phun thuốc thử Dragendorff + Từ ống nghiệm 47 đến ống nghiệm 58 thấy xuất vết phun thuốc thử Dragendorff Gộp từ ống nghiệm đến ống nghiệm 41, từ ống nghiệm 47 đến ống nghiệm 58 đem cô, thu cắn (4.1) Gộp từ ống nghiệm 42 đến ống nghiệm 46, đem cô, thu cắn (4.2) Hòa tan cắn thu lượng tối thiểu Acetonitrile tiếp tục kiểm tra TLC khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : thu kết sau: - Dung dịch cắn (4.1) không thấy xuất vết phun thuốc thử Dragendorff - Dung dịch cắn (4.2) thấy xuất vết phun thuốc thử Hình IV.4 - SKĐ hệ dung môi (4) Dragendorff Nhận xét: vết xuất dung dịch cắn (4.2) có R f trùng với Rf conessine mẫu chuẩn conessine cao chiết 22 Kết luận: Quá trình phân lập với hệ dung mơi tăng dần tính phân cực phân lập conessine lẫn số tạp chất nên conessine chưa kết tinh theo yêu cầu V Tài liệu tham khảo Tài liệu Tiếng Việt 23 Phạm Thanh Kỳ, Chu Đình Kính, Phí Tùng Lâm (2006), “Phân lập nhận dạng conessine norconessine vỏ Mức hoa trắng thu hái Hải Dương”, Tạp chí dược liệu, 11 (1), 6-8 Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Viết Thân, Nguyễn Thị Thu Hương, Hoàng Thị Tuyết Nhung (2010), “Nghiên cứu chiết xuất conessine từ mộc hoa trắng dùng làm chất đối chiếu kiểm nghiệm”, Tạp chí Dược học, 407, 32 - 35 Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Bộ Y tế, Dược liệu học, Tập II, Nxb Y học, Hà Nội Võ Duy Lê Sơn (2012),” Nghiên cứu định tính, định lượng – chiết tách khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hợp chất alcaloid thuốc thượng”, – 14 Bộ Y tế, Tra cứu dược liệu, Nxb Y học, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Chakraborty A., Brantner A H (1999), “Antibacterial steroid alcaloids from the stem bark of Holarrhena pubescens”, J Ethnopharmacol., 68 (13), 339-344 Houghton P J., Dias Diogo M L (1996), “The conessine content of Holarrhena pubescens from Malawi”, Pharmaceutical Biology, (34), 305-307 Kuma N., Singh B., Bhandari P., Gupta A P., Kaul V K (2007), “Steroidal Alcaloids from Holarrhena antidysenterica (L.), Wall”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin 55 (6), 912-914 24 ... Các phương pháp định tính định lượng alcaloid 13 I.5 Về alcaloid mức hoa trắng 15 I.5.1 Một số phương pháp phân lập alcaloid toàn phần 15 I.5.2 Các phương pháp phân lập conessine dược. .. định tính phương pháp hóa học, định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) II.5 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật sử dụng - Phân lập conessine từ cao chiết Mức hoa trắng III Thực nghiệm III.1 Phân. .. TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu: Mẫu cao chiết Mức hoa trắng Thời gian nhận mẫu: tháng năm 2020 Mẫu giám định tên khoa học khoa Tài nguyên, Viện Dược liệu