Kỹ thuật xét nghiệm điện hoá phát quang ECLIA xác định viêm gan B

Xác định các dấu ấn huyết thanh học của nhiễm virus viêm gan B bằng kỹ thuật miễn dịch điện hoá phát quang ECLIA 1 Nhiễm Virus viêm gan B Viêm gan B gây ra do virus HBV (Hepatitis B Virus) Đây là loại virus có hình cầu, vỏ bao quanh của HBV là lipoprotein có chứa kháng nguyên bề mặt HBsAg Cho đến nay, virus HBV được xác định có 8 tuýp kháng nguyên khác nhau Virus HBV có thời gian ủ bệnh từ 3 đến 6 tháng Giai đoạn đầu hoạt động, virus gây bệnh viêm gan B cấp tính Sau 6 tháng, nếu cơ thể.

Xác định dấu ấn huyết học nhiễm virus viêm gan B kỹ thuật miễn dịch điện hoá phát quang ECLIA Nhiễm Virus viêm gan B Viêm gan B gây virus HBV (Hepatitis B Virus) Đây loại virus có hình cầu, vỏ bao quanh HBV lipoprotein có chứa kháng nguyên bề mặt HBsAg Cho đến nay, virus HBV xác định có tuýp kháng nguyên khác Virus HBV có thời gian ủ bệnh từ đến tháng Giai đoạn đầu hoạt động, virus gây bệnh viêm gan B cấp tính Sau tháng, thể khơng thể tự miễn dịch với virus, bệnh chuyển sang giai đoạn mãn tính, nguy cao đối mặt với nhiều biến chứng nguy hiểm xơ gan, ung thư gan chịu nhiều gánh nặng bệnh tật suốt đời Viêm gan B lây qua đường nào? • Lây qua đường máu • Lây từ mẹ sang • Lây qua đường tình dục Hiện nay, sở y tế sở nghiên cứu, đào tạo y học ứng dụng nhiều kỹ thuật xét nghiệm để xác định dấu ấn huyết học nhiễm virus viêm gan B như: • Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động ngược (RPHA: Reversed Passive Hemagglutination Assay) • Kỹ thuật miễn dịch sắc ký (Chromatography Immuno Assay) • Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA: Radio Immuno Assay) • Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym (ELISA: Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) • Kỹ thuật miễn dịch enzym vi hạt (MEIA: Microparticles Enzyme Immuno Assay) • Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA: Electrochemiluminescence Immunoassay) Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA) Kỹ thuật thực máy tự động hoàn toàn Nguyên lý - Dùng kháng thể biết để phát kháng nguyên chưa biết, ngược lại - Dùng hệ thống phát điện hoá phát quang để nhận biết diện phức hợp kháng nguyên- kháng thể Kỹ thuật bao gồm phản ứng: Hình Phản ứng điện hóa phát quang bề mặt điện cực - Phản ứng miễn dịch: kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể đánh dấu ruthenium Sử dụng tương tác biotin streptavidin với vi hạt có từ tính để gắn phức hợp kháng nguyên-kháng thể (đánh dấu ruthenium) vào pha rắn Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang sử dụng chất đánh dấu ruthenium khởi phát từ điện từ phản ứng hóa học, có khả phát chất có nồng độ thấp cho kết nhanh, khoảng 18 phút Các kháng thể (hoặc kháng nguyên) gắn biotin chất đánh dấu ruthenium vi hạt phủ streptavidin ủ hỗn hợp phản ứng Khi đặt điện lên điện cực buồng đo, phức hợp ruthenium tác dụng với prophylamine, chuyển sang trạng thái kích thích, tín hiệu phát quang hình thành Tín hiệu ánh sáng đo kết xét nghiệm xác định qua đường chuẩn xét nghiệm thiết lập Một đường cong qui chiếu ghi nhớ mã hóa thuốc thử xác định lần máy phân tích tự động đường chuẩn hai điểm [1], [2], [3] - Phản ứng điện hoá phát quang: để phát diện phức hợp kháng nguyên- kháng thể đánh dấu ruthenium Dưới tác dụng điện, phức hợp ruthenium phản ứng với tripropylamine (TPA) phát quang Kết phản ứng điện hóa phát quang tín hiệu ánh sáng máy ghi nhận suy nồng độ ban đầu kháng nguyên kháng thể có mẫu thử Nguyên lý ECLIA kiểu sandwich Hình Nguyên lý sandwich kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang [3] + Ở bước đầu tiên, ống phản ứng, mẫu thử cho vào với antiHBs đơn dòng gắn biotin hỗn hợp antiHBs đơn dòng- đa dòng đánh dấu ruthenium Trong trình ủ phút, kháng thể bắt giữ HBsAg có mẫu thử + Ở bước thứ hai, vi hạt từ tính có áo lớp streptavidin thêm vào Trong trình ủ phút, phức hợp kháng nguyên kháng thể gắn vào pha rắn tương tác biotin streptavidin + Sau ủ lần 2, hỗn hợp phản ứng chứa phức hợp miễn dịch chuyển đến buồng đo; phức hợp miễn dịch có từ tính bị bắt giữ từ trường bề mặt điện cực, thành phần thuốc thử mẫu thử khác bị rửa trôi + Trong phản ứng điện hóa phát quang, phức hợp miễn dịch giữ lại điện cực có chứa ruthenium, tác dụng kích thích điện, tác dụng với triprophylamine (TPA) phát quang Tín hiệu ánh sáng thu tỉ lệ thuận với lượng HBsAg có mẫu thử [1], [2], [3], [4] Kỹ thuật lấy mẫu • Lấy máu đầu ngón tay • Lấy máu tĩnh mạch Xử lý mẫu Tách huyết thanh/huyết tương Giữ ống máu ổn định nhiệt độ phòng tối thiểu 30 phút tiến hành tách huyết thanh/huyết tương không Khi khơng tách huyết thanh/huyết tương vịng giờ, mẫu sau để ổn định nhiệt độ phòng 30 phút chuyển bảo quản nhiệt độ 4oC - 8oC Tách huyết thanh/huyết tương vòng tối đa 24 Mẫu xét nghiệm sinh học phân tử, tách huyết thanh/huyết tương thực vòng theo hướng dẫn sinh phẩm xét nghiệm Nếu có máy ly tâm: Tốc độ thời gian ly tâm 2.000 – 2.500 vòng/phút 10 phút Khi xếp ống máu vào máy phải đảm bảo cân vị trí đối xứng Dùng pipette hút phần huyết thanh/huyết tương sang ống lưu mẫu có mã số tương ứng Khơng có máy ly tâm: Tách huyết thanh/huyết tương thấy mẫu phân tách rõ ràng Kiểm tra thể tích huyết thanh/huyết Qui trình kỹ thuật Đặt hóa chất cần thử vào máy, chạy mẫu chuẩn mẫu chứng Tách 200 µl huyết cho vào ống eppendort, đặt vào máy Khai báo thông tin mẫu thử, yêu cầu xét nghiệm, ấn nút khởi động Máy tự động đưa kết sau làm xong Thời gian: 18 phút Đọc kết quả: + Kết máy xác định tự động phần mềm, cách so sánh tín hiệu ánh sáng có từ sản phẩm phản ứng với tín hiệu giá trị cắt có trước chuẩn biết trước nồng độ + Kết dương tính số cắt (coi: cut off index) mẫu thử ≥ + Kết âm tính coi mẫu thử < 0,9 + Khi 0,9 ≤ coi < 1: lặp lại xét nghiệm lần Khi mẫu lần hai có coi ≥ 0,9 xem dương tính Ưu điểm kỹ thuật ECLIA • Độ nhạy độ đặc hiệu cao [1], [3], [4] • Qui trình thực xét nghiệm đơn giản • Thời gian xét nghiệm nhanh • Chèn mẫu ưu tiên máy thực xét nghiệm • Được xem phương pháp đại xét nghiệm chất nội tiết tố, chất điểm ung thư Nhược điểm kỹ thuật ECLIA: • Thiết bị đắt tiền, giá thành cao • Khơng phát dấu ấn huyết trường hợp mức độ nhân lên virus thấp, đột biến preS/S đột biến core/precore [3], [4] • Việc lựa chọn định sử dụng kỹ thuật tùy thuộc vào mức độ trang bị yêu cầu lâm sàng, trường hợp sàng lọc truyền máu phải tuân thủ theo quy định để đảm bảo an toàn truyền máu [5] Tài liệu tham khảo: Louisirirotchanakul S, Khupulsup K, Akraekthalin S, Chan KP, Saw S, Aw TC, Cho DH, Shin MG, Lim J (2010), "Comparison of the technical and clinical performance of the Elecsys HBsAg II assay with the Architect, AxSym, and Advia Centaur HBsAg screening assays", J Med Virol., 82(5), pp 755-762 Maylin S, Boyd A, Martinot-Peignoux M, Delaugerre C, Bagnard G, Lapalus M, Zoulim F, Lavocat F, Marcellin P, Simon F, Girard PM, Lacombe K (2013), "Quantification of hepatitis B e antigen between Elecsys HBeAg and Architect HBeAg assays among patients infected with hepatitis B virus", J Clin Virol., 56(4), pp 306-311 Wursthorn K, Jaroszewicz J, Zacher BJ, Darnedde M, Raupach R, Mederacke I, Cornberg M, Manns MP, Wedemeyer H (2011), "Correlation between the Elecsys HBsAg II assay and the Architect assay for the quantification of hepatitis B surface antigen (HBsAg) in the serum", J Clin Virol, 50(4), pp 292-306 Xu W, Li Y, Wang M, Gu J (2011), "Comparison of two immunoassays for determining hepatitis B virus serum markers", Clin Chem Lab Med, 50(1), pp.153-157 WHO (2014), "Blood safety and availability", Fact sheet No279, Updated June 2014 ... Microparticles Enzyme Immuno Assay) • Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA: Electrochemiluminescence Immunoassay) Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA) Kỹ thuật thực máy tự động hoàn... thể biết để phát kháng nguyên chưa biết, ngược lại - Dùng hệ thống phát điện hoá phát quang để nhận biết diện phức hợp kháng nguyên- kháng thể Kỹ thuật bao gồm phản ứng: Hình Phản ứng điện hóa phát. .. thích, tín hiệu phát quang hình thành Tín hiệu ánh sáng đo kết xét nghiệm xác định qua đường chuẩn xét nghiệm thiết lập Một đường cong qui chiếu ghi nhớ mã hóa thuốc thử xác định lần máy phân