mức độ tồn lưu của malachite green và leucomalachite trong nguyên liệu cá tra

Việc xác định được dư lượng các chất kháng sinh còn tồn lưu trong các loài động vật thủy sản cũng đã được nghiên cứu nhiều trong và ngoài nước, nhưng sự tồn lưu MG trong cá tra, ứng với

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN

VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN

LIỆU CÁ TRA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

2009

MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN

VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN

LIỆU CÁ TRA

Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài: “MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN LIỆU

CÁ TRA” do sinh viên Bùi Thị Thu Cúc thực hiện và báo cáo ngày 16 tháng 07 năm 2009, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua Luận văn đã chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng và được giáo viên hướng dẫn xét duyệt

Cán bộ hướng dẫn

Th.S Vương Thanh Tùng

LỜI CẢM TẠ

Luận văn là bước đánh giá cuối cùng của quá trình học tập, rèn luyện một sinh viên trong môi trường đại học Thực hiện tốt luận văn không chỉ nhờ sự cố gắng bản thân mà còn nhờ nhiều vào sự giúp đỡ từ thầy cô cán bộ

Để hoàn thành được đề tài luận văn này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Vương Thanh Tùng đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện Ghi lòng biết ơn đến cô cố vấn học tập Lê Thị Minh Thủy vì đã hết lòng giúp đỡ không chỉ trong đợt luận văn mà còn trong suốt khóa học

Chân thành cảm ơn đến thầy cô giảng dạy bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến đã truyền đạt những kiến thức quý báu và bổ ích Cảm ơn đến chị Lương Diễm Trang học viên cao học K13 và anh Nguyễn Thanh Phong cán bộ phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ thực hiện các thao tác thực nghiệm cho tôi hoàn thành đề tài

Cám ơn cha mẹ và gia đình đã quan tâm, chăm sóc và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài này

Gởi lời cảm ơn và chúc thành công đến tất cả các bạn lớp Chế Biến Thủy Sản K31, những người luôn giúp đỡ tôi trong khi thực hiện đề tài

Cần Thơ, tháng 05 năm 2009

Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Thu Cúc

TÓM TẮT

Trong tình hình hiện nay, xuất khẩu thủy sản của nước ta phải đối mặt với một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dịch bệnh và dư lượng hóa chất, kháng sinh trong thủy sản Dư lượng các hóa chất, kháng sinh còn tồn đọng trong thủy sản rất có hại đối với sức khỏe con người và nền kinh tế nước nhà Vì vậy, việc xác định “mức độ tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite trong nguyên liệu cá tra” được thực hiện nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite trong cá tra Đề tài bao gồm hai thí nghiệm:

Thí nghiệm (1) Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh

MG trong cá tươi bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ Từ đó, có thể chọn ra một phương pháp cho hiệu suất tốt nhất để tiến hành thí nghiệm (2) xác định mức

độ tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite green trong cá tra

Thí nghiệm (2) cá được gây nhiễm hai lần gồm ba nồng độ MG gây

tích sau khi chiết tách được xác định bằng LC-MS

Kết quả cho thấy phương pháp 2 là phương pháp tốt nhất với hiệu suất đạt

và chọn làm thí nghiệm (2) Ở thí nghiệm (2) nồng độ MG tìm thấy trong cơ và

da cá khi gây nhiễm ở tất cả các nghiệm thức đều giảm xuống sau 72 giờ gây nhiễm lần Hàm lượng MG phát hiện trong cá ở nghiệm thức 0,1 ppm và 0,15 ppm cho thấy sau 28 ngày gây nhiễm nồng độ MG thấp hơn mức ấn định dư lượng tối đa của MG và LMG (không được vượt quá hai phần tỉ (ppb)) trong sản phẩm thủy sản của các quốc gia trong khối Liên hiệp Âu Châu và Úc Châu (Quyết định số 2002/657/EC ngày 22/12/2003) Sau 56 ngày sau gây nhiễm thì nồng độ MG vẫn còn tồn lưu trên cá tra với nồng độ thấp (0,31-2,42 ppb)

ppb Parts per billion

ppm Parts per million

HPLC High pressure Liquid chromatography

MS Mass spectrometry

LC-MS Liquid chromatography- Mass spectrometry

EU Thị trường Châu Âu

BTS Bộ Thủy Sản

GDP Gross Domestic Product

ACN Acetonitrile

HA Hydroxylamine.HCl

DEG Diethylene glycol

TSA p-toluen sulfonic acid monohydrate

TMPD N,N,N,N-tetramethyl- 1,4- phenilenediamine dihydrochloride

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 15

Hình 3.2: Hệ thống cô quay chân không 18

Hình 3.3: Qui trình li trích MG ở phương pháp 1 19

Hình 3.4: Thiết bị li tâm lạnh 22

Hình 3.5: Bình chiết 23

Hình 3.6: Qui trình li trích MG ở phương pháp 2 24

Hình 3.7: Qui trình li trích MG ở phương pháp 33.2.3 Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra 27

Hình 3.8: Bể nuôi 29

Hình 3.9: Sơ đồ bố trí nghiệm xác định mức độ tồn lưu của MG và LMG trong nguyên liệu cá tra 30

Hình 4.10: Đồ thị đường chuẩn 33

Hình 4.11: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm 37

Hình 4.12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm 40

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1: Tín hiệu trên máy LC-MS đọc được ứng với nồng độ chuẩn 33

Bảng 4.2: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn MG, LMG 39 ppb 34

Bảng 4.3: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG và LMG 35

Bảng 4.4: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG, LMG 36

Bảng 4.5: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm 37

Bảng 4.6: Sự tồn lưu của MG theo thời gian thí nghiệm 39

Bảng 4.7: Sự tồn lưu của LMG theo thời gian thí nghiệm 40

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ I TÓM TẮT II CÁC TỪ VIẾT TẮT III DANH SÁCH HÌNH IV DANH SÁCH BẢNG V DANH SÁCH BẢNG V MỤC LỤC VI

CHƯƠNG 1 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Thời gian thực hiện 2

CHƯƠNG 2 3

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tìm hiểu về malachite green 3

2.1.1 Sơ lược về malachite green 3

2.1.2 Tình hình sử dụng MG 4

2.1.3 Các ứng dụng của Malachite green 5

2.1.4 Tác hại của Malachite green 6

2.1.5 Công dụng của Malachite green sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 7

2.1.6 Chất thay thế malachite green 7

2.2 Nguyên liệu cá tra 7

2.2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra 7

2.2.2 Tình hình phát triển ngành nuôi cá tra 8

2.3 Các phương pháp xác định dư lượng Malachite green 8

2.3.1 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong các sản phẩm cá bằng sắc kì lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) 10

2.3.2 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG bằng sắc kí lỏng (LC) với sự oxi hóa LMG 11

2.3.3 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng 11

2.4 Mức độ tồn lưu của chất kháng sinh 11

2.5 Một số qui định của các quốc gia về việc cấm sử dụng một số loại thuốc và hoá chất 12

CHƯƠNG 3 14

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 14

3.1 Phương tiện nghiên cứu 14

3.1.1 Địa điểm 14

3.2 Phương pháp thí nghiệm 14

3.2.1 Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tra bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ 14

3.2.2 Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra.28 3.3 Xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 4 33

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Xây dựng đường chuẩn MG, LMG 33

4.2 Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tra bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ 33

4.2.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) 34

4.2.2 Phương pháp 2: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) 35

4.2.3 Phương pháp 3: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) 36

4.3 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống 37

4.3.1 Sự tồn lưu của MG + LMG 37

4.3.2 Sự tồn lưu của MG 39

4.3.3 Sự tồn lưu của LMG 40

CHƯƠNG 5 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề xuất 43

PHỤ LỤC 1 44

PHỤ LỤC 2 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Như chúng ta đã biết biểu hiện gây ung thư của LMG trên chuột nhắt cái

và là chất gây đột biến trong cơ thể của các loài động vật, ngoài ra MG còn là 1 hoá chất có thể gây bệnh ung thư cho con người nên đã bị cấm sử dụng và được kiểm tra nghiêm ngặt về dư lượng có trong thực phẩm ở nhiều nước trên thế giới

(www.thanhnien.easyvn.com) Sự kiện một số container sản phẩm thuỷ sản xuất

khẩu từ Việt Nam bị từ chối ở thị trường Châu Âu, Mỹ và Canada trong thời gian qua do phát hiện có dư lượng MG Những tháng cuối năm 2004, trên 10 container

cá da trơn, cá rô phi và cá trê xuất khẩu sang thị trường Châu Âu của các doanh nghiệp ở An Giang, Đồng Tháp…bị trả về do phát hiện chất MG Chỉ riêng năm

2005, EU đã phát hiện 12 lô hàng về dư lượng MG Tất cả lô hàng bị phát hiện đều bị trả lại Việt Nam Điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành xuất khẩu thủy sản trong nước và đời sống của người dân lao động nước ta

Việc xác định được dư lượng các chất kháng sinh còn tồn lưu trong các loài động vật thủy sản cũng đã được nghiên cứu nhiều trong và ngoài nước, nhưng sự tồn lưu MG trong cá tra, ứng với điều kiện nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long thì ít được nghiên cứu Nên những thông số về “mức độ tồn lưu Malachite green và Leucomalachite green trong nguyên liệu cá tra” rất cần thiết cho người nuôi cũng như nhà chế biến

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Thông qua việc phân tích dư luợng MG trong nguyên liệu cá tra sau các

trong nguyên liệu cá tra Từ đó có thêm thông tin cho các nhà nuôi trồng và chế biến trong việc hướng tới việc sử dụng hoá chất, kháng sinh hiệu quả và an toàn

để nâng cao chất lượng và độ an toàn nguyên liệu cá tra trước khi đưa vào chế biến

1.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tươi bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ

Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra

1.4 Thời gian thực hiện

Từ tháng 01/2009 đến tháng 05/2009

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tìm hiểu về malachite green

2.1.1 Sơ lược về malachite green

Các quốc gia trong khối liên hiệp Âu Châu và Úc Châu ấn định ngạch số tối đa của MG và LMG trong thủy sản là phải ở mức 2 ppb, tức là không vượt quá 0,002 mg/kg Hoa Kỳ, Canada, cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới trong đó có Trung Quốc và Việt Nam thì không chấp nhận sự hiện diện của bất kì

1 dư lượng nào dù thật thấp của MG và LMG

2.1.1.1 Malachite green là gì?

Malachite green (còn gọi là xanh malachite) có tên khoa học là Triphenylmethane MG là một hoá chất thường ở dạng bột mịn, có màu xanh, hay dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như da, sợi và giấy trong ngành sản xuất công nghiệp Ngoài ra MG cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn

và bào tử của nó Từ lâu, MG đươc xem là chất diệt nấm (loại saprolegnia ssp) và diệt kí sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa)

Leuco malachite green được sinh ra từ sự khử malachite green bới các enzyme trong cá, một hợp chất chuyển hoá rất bền của MG LMG được tích luỹ bên trong, vỗ béo cơ thịt, tồn trữ lâu dài trong cơ thịt của cá

2.1.1.2 Công thức cấu tạo của Malachite green và Leucomalachite green

- HCl

Malachite green (MG) Leucomalachite green (LMG)

Malachite green, Green malaquite, Grenoble green

Tên quốc tế (IUPAC):

[4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methylidene]-Khối lượng phân tử (MW): 364,911

Tháng 6/2005, các cơ quan chức năng Trung Quốc đã phát hiện thấy một vài tỉnh vẫn còn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay

MG vẫn được sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi như 1 chất diệt nấm Nguyên nhân là do loại chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dể mua

cả nước và đây là lần đầu tiên Hàn Quốc phát hiện thấy MG trong các trại nuôi cá

ở nước này Lượng hóa chất dao động từ 0,1-3 ppm (www.Intrafish.com)

2.1.2.2 Tình hình sử dụng MG ở Việt Nam

Sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm đã gây thiệt hại lớn về tài chính cũng như uy tín hàng thủy sản Việt Nam Nhà nước và cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt Nam đã đưa ra các qui định tương đối chặt chẽ về việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng cũng như chế biến thủy sản, nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm

cho người tiêu dùng, ổn định và phát triển xuất khẩu Tuy nhiên, việc chấp hành các qui định của nhà nước là chưa triệt để vì thỉnh thoảng vẫn còn một số lô hàng thủy sản Việt Nam xuất khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm hoặc vượt quá giới hạn đối với những kháng sinh cho phép sử dụng có giới hạn, trong chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc hại trong thủy sản nuôi do Nafiqaved thực hiện năm 2003 và 2004 thỉnh thoảng vẫn phát hiện mẫu thủy sản nhiễm thuốc hoặc hoá chất bị cấm sử dụng, MG là một điển hình

Về tình hình sử dụng thuốc, hoá chất trong nuôi cá tra công nghiệp ở Đồng Tháp (Phạm Thanh Tuấn, 2004) ghi nhận được có 90 loại thuốc, hoá chất được sử dụng trong nuôi trồng Riêng kháng sinh trị bệnh cho cá có 58 loại thì hầu hết nằm trong danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại ở dạng nguyên liệu và nguồn gốc không rõ ràng, riếng chất MG là nằm trong danh mục cấm nhưng vẫn được người nuôi sử dụng dụng ở đây

Theo một số hộ nuôi cá tra ở khu vực Thốt Nốt, Cần Thơ, An Giang thì cho biết không sử dụng MG trong quá trình nuôi nhưng qua phân tích thì hiện diện đến 10/64 mẫu trong cá thương phẩm, và nồng độ tồn lưu 2-4,9 ppb Đối với

cá đang nuôi thì hiện diện 9/30 mẫu được kiểm tra, nồng độ tồn lưu là 2,4- 4,18 ppb (Nguyễn Chính, 2005)

2.1.3 Các ứng dụng của Malachite green

2.1.3.1 Trong công nghiệp

Trong ngành công nghiệp MG hay dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như

da, tơ, sợi và giấy Ngoài ra MG cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để làm dung dịch nhuộm vi khuẩn, và bào tử của nó, làm chỉ thị màu pH, vàng (axit), xanh lục (kiềm)

2.1.3.2 Trong thủy sản

Chất MG đã được giới nuôi trồng thủy sản trên thế giới sử dụng 1 cách rộng rãi từ lâu và được dùng rất phổ biến trên thế giới để xử lý nước và để sát nấm cũng như để sát kí sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa) và các bệnh nấm kí sinh trùng trên trứng cá, cá và các loại sò hến (loài nhuyễn thể) như phòng trị các bệnh nấm mi, bệnh trùng quả dưa….Đó là một loại thuốc trừ nấm rất công hiệu và thường được dùng để tẩy trùng trong các hồ gây cá giống và trong các mô hình nuôi trồng thủy sản

2.1.4 Tác hại của Malachite green

Khi vào cơ thể cá, MG sẽ bị phân hủy thành chất chuyển hóa (metabolite)

là Leucomalachite Green Thời gian đào thải của MG nhanh, ngược lại chất LMG

có thể tồn tại trong thời gian rất lâu trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm MG

Độc tính của MG có liên hệ tới nhiệt độ nước Ở nhiệt độ thấp, cá có thể chịu đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng

sẽ dẫn đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng

MG vào lúc sáng sớm khi nhiệt độ nước chưa tăng cao là tốt nhất Đặc biệt trong các tháng mùa hè nóng bức, thời gian tiếp xúc khi xử lý MG nên giảm xuống (Lê Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004)

2.1.4.1 Tác hại đối với con người

Thí nghiệm cho thấy MG và LMG làm hại gan, làm biến đổi tuyến giáp trạng, gây ra tình trạng mất máu, làm đột biến thay đổi gen (mutagenic) và gây cancer (carcinogenic) trên loài chuột thí nghiệm Qua việc thẩm định các kết quả trên, giới khoa học đưa ra kết luận rằng MG và LMG là 2 chất nguy hại có tiềm năng gây cancer cho người

Một nghiên cứu khác về độc tính của MG và LMG được tiến hành trong thời gian 2 năm của trung tâm nghiên cứu độc tố quốc gia Hoa Kỳ cho thấy có biểu hiện gây ung thư của LMG trên chuột nhắt cái Ngoài ra, LMG còn là chất gây đột biến trong cơ thể của các loài động vật

Theo thạc sĩ Từ Thanh Dung- Khoa Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ, thì MG là một hoá chất có thể gây bệnh ung thư, ảnh hưởng đến sức khỏe con người nên đã bị cấm sử dụng và được kiểm tra nghiêm ngặt về dư lượng có trong thực phẩm ở nhiều nước trên thế giới

Trước những tác hại có thể gây ra đối với sức khỏe con người và nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm, đáp ứng yêu cầu khắc khe của thị trường xuất khẩu thủy sản, theo chỉ thị của bộ thủy sản 7/3/2005 về việc ngừng sản xuất, tiêu thụ và

sử dụng MG trong nuôi trồng thủy sản và đề nghị tất cả các hộ nuôi thủy sản không được sử dụng MG để phòng và trị bệnh cho thủy sản

2.1.4.2 Thiệt hại về kinh tế

Nếu sản phẩm thủy sản xuất khẩu có chứa các lượng tồn dư chất độc hại

và bị cấm sử dụng như MG thì toàn bộ lô hàng sẽ bị trả về và có thể bị nước sở tại kiện, dẫn đến những thiệt hại về kinh tế là không nhỏ

2.1.5 Công dụng của Malachite green sử dụng trong nuôi trồng thủy sản

MG được sử dụng như một loại thuốc kháng sinh có hiệu quả trong nghề nuôi trồng thuỷ sản từ năm 1936 (Foster and Woodurg, 1936) Nó được sử dụng

để trị bệnh ký sinh trùng ngoài da, nấm, những bệnh do các động vật nguyên sinh gây ra ( bệnh protozoa) trong cá và trứng cá Cho đến ngày nay, nó vẫn còn là một trong những hoá chất có hiệu quả nhất cho mục đích này và được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới

2.1.6 Chất thay thế malachite green

Để giải quyết tạm thời vấn đề cần phải có những chất khác thay thế MG trong công tác phòng trị bệnh trên các loài thủy sản BRONOPOL là chất có tác dụng diệt kí sinh trùng trên cá thay thế MG Đây là chất được EU cho phép sử dụng trị bệnh cho cá từ năm 2001 và không qui định giới hạn về dư lượng Theo đánh giá của cơ quan bảo vệ Môi Trường Hoa Kì (EFA) thì Bronopol không là chất gây ung thư, có thể làm chất tẩy trùng, diệt khuẩn

này là 2-Bromo-2-Nitropropane-1,3-Diol Bronopol được cung cấp ra thị trường với các tên thương mại như: Pyceze, Onyxide 500… Nhằm mục tiêu phát triển xuất khẩu thủy sản ổn định trong thời gian tới, thiết nghĩ các hộ nuôi thủy sản cần tuân thủ nghiêm các qui định của nhà nước và các cơ quan chuyên môn trong việc

sử dụng hóa chất và kháng sinh trong thủy sản để đảm bảo uy tín, chất lượng và giữ vững thương hiệu, đồng thời tránh ra các thiệt hại lớn về kinh tế do bị phát hiện có dư lượng cá hóa chất và kháng sinh có hại trong các lô hàng thủy sản xuất

khẩu (Sở Nông Nghiệp An Giang, 2/2/2005)

2.2 Nguyên liệu cá tra

2.2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra

Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi trồng thủy sản đang được phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (tập trung chủ yếu ở hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp) là một trong

những loài cá có giá trị xuất khẩu cao Có thân dẹp, da trơn, có râu ngắn, màu sắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng

Cá sống chủ yếu ở vùng nước ngọt, có thể sống ở vùng nước lợ (10-14 %

Cá trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18

kg hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m Cá nuôi sau một năm đạt 1-1,5 kg (năm đầu), những năm sau cá tăng trọng nhanh hơn có khi đạt 5-6 kg/năm

Tài liệu phân loại gần đấy nhất của tác giả W.Rainboth xếp cá tra nằm trong giống cá tra dầu và được phân loại như sau:

Bộ cá nheo Siluriformes

Họ cá tra dầu Pangasiidae

Giống cá tra dầu Pangasianodon

Loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus

Mùa sinh sản: từ tháng 2 – 10

Mùa thu hoạch: quanh năm

Kích thước thu hoạch: 30 – 40 cm, lớn nhất 90 cm

Sản phẩm xuất khẩu: dưới dạng nguyên con, philê đông lạnh, các mặt hàng chế biến và hàng giá trị gia tăng

2.2.2 Tình hình phát triển ngành nuôi cá tra

Trong họ cá tra có một số loài được nuôi trong hồ từ lâu đời, đặc biệt là cá tra (cá tra nuôi) Ngày nay ngành cá nuôi trở thành một công nghiệp nuôi và chế biến mà họ cá tra là trọng điểm Trên đà nghiên cứu cho ngành cá nuôi có rất nhiều báo cáo về môi trường sống, thức ăn của họ cá tra trong điều kiện thiên nhiên và trong điều kiện "gia ngư hóa"

Hình thức nuôi: Nuôi thâm canh, bán thâm canh với các mô hình nuôi bè, nuôi trong ao hầm

Hình thức khai thác: Lưới, rùng, đăng, vó

2.3 Các phương pháp xác định dư lượng Malachite green

MG là một thuốc sát trùng không đắt, được sử dụng có hiệu quả trong ngành nuôi cá từ những năm 30, chủ yếu trong những nước Châu Á Việc sử dụng

MG được xem là bất hợp pháp, bởi vì có liên quan đến những tác hại lâu dài đối với con người

Do đó, đã có rất nhiều phương pháp kiểm tra dư lượng MG và hợp chất chuyển hóa của nó là LMG trong các sản phẩm cá Nhưng theo sự quyết định của Hội đồng Châu Âu EC / 657 / 2002, một phương pháp kiểm nghiệm có thể được tiến hành, phải có độ phát hiện tổng hàm lượng MG và LMG trong thịt cá là 2 µg/kg Theo Julie Kowalski, một nhà hóa học nhiều sáng kiến, đã đưa ra một phương pháp đo sắc ký chung để xác định dư lượng MG và LMG Đó là phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp, với hệ hấp phụ pha ngược HPLC

Để phân tích MG và LMG bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, với hệ hấp phụ pha ngược HPLC, cột chứa octadecylsilane đặc trưng làm cột bảo vệ, đồng thời cũng đóng vai trò là pha tĩnh Thành phần pha động là hỗn hợp dung dịch đệm và chất hữu cơ, với một tỷ lệ 50 : 50, acetonitrile là hợp chất hữu cơ sử dụng phổ biến nhất Dung dịch đệm có pH thích hợp từ 4,0 đến 4,5

Chiều dài cột là 100 mm hoặc dài hơn

Ngày nay, có 3 loại detector được dùng cho kỹ thuật HPLC để xác định

MG và LMG là detector đo phổ hấp thụ phân tử UV-Vis, phổ huỳnh quang phân

tử và phổ khối lượng MS

MG có cực đại hấp phụ ở 620 nm và LMG ở 265 nm, làm chúng ta khó quan sát cả hai trong một phép đo phổ hấp thu Điều này có thể được khắc phục bằng cách nối thêm vào sau cột phân tích HPLC một cột chứa chất oxi hóa (như chì oxit) để chuyển LMG về MG

- HCl

Malachite green (MG) Leucomalachite green (LMG)

LMG sau khi chuyển về dạng MG cũng được xác định trên sắc đồ, MG này có thể được phân biệt với MG trước bởi thời gian lưu khác nhau

Detector phát phổ huỳnh quang được gắn vào đường dẫn dung môi rửa giải, để phát hiện ra LMG bởi sự kích thích phát xạ ở 265 nm và sự phát xạ ở 360

nm

Với phép ghi phổ khối lượng cho phép phát hiện cả hai hợp chất mà không

sự oxi hóa hoặc sử dụng hai detector

Sau đây, một vài phương pháp xác định dư lượng MG và chất chuyển hóa

của nó trong cá của nhiều nhóm tác giả:

∗ Phương pháp xác định dư lượng malachite green và leucomalachite green trong nguyên liệu cá tra bằng sắc kí lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-

MS/MS) Nhóm tác giả Van de Riet JM, Murphy CJ, Pearce JN, Potter RA, Burns BG

∗ Phương pháp xác định dư lượng Malachite green và Leucomalachite green bằng sắc ký lỏng (LC) với sự oxi hóa Leucomalachite green Nhóm tác giả

Andersen WC, Roybal JE, Turnipseed SB

∗ Phương pháp xác định dư lượng Malachite green và Leucomalachite green trong cá hồi Bắc Mỹ bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối

lượng Nhóm tác giả Halme K, Lindfors E, Peltonen K

2.3.1 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong các sản phẩm cá bằng sắc kì lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS)

Một phương pháp phân tích bằng LC-MS khác đã được phát triển trong việc xác định dư lượng MG và LMG trong nhiều cá nước ngọt bởi nhóm tác giả:

Van de Riet JM, Murphy CJ, Pearce JN, Potter RA, Burns BG MG và hợp chất chuyển hóa của nó được chiết từ những mẫu thịt cá đã được nghiền đồng nhất bằng dung dịch acetonitrile – perchloric acid Sau khi ly tâm, dịch trong được lấy

và đem cô đặc rồi chuyển vào cột chiết chứa pha rắn octadecyl C18 Tiếp theo, ta tiến hành rửa giải bằng cách cho dung dịch acetonitrile qua cột, thu dịch rửa giải đem cô quay đến khô cạn Phần cặn đã khô cạn được hòa tan với acetonitrile và pha loãng với nước cất để chuẩn bị phân tích LC-MS MG và hợp chất chuyển hóa của nó sẽ được phân tích bằng LC pha đảo sử dụng cột Luna C18 với dung dịch đệm ammonium hydroxide-formic acid trong gradient acetonitrile Phép ghi phổ khối lượng phát hiện định phân ở nhiều giai đoạn phản ứng Các mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 1 ng/g có hiệu suất thu hồi là 81 % đối với LMG và 98 % cho

MG Phương pháp này có giới hạn phát hiện cho cả hai hợp chất trên là 0,1 ng/g

2.3.2 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG bằng sắc kí lỏng (LC) với sự oxi hóa LMG

Một phương pháp sắc ký lỏng (LC) khác đã được tìm ra để xác định dư

lượng MG trong cá bởi nhóm tác giả: Andersen WC, Roybal JE, Turnipseed SB

Dư lượng MG và LMG được trích từ thịt cá hồi bằng dung dịch đệm acetate và acetonitrile Tiếp theo, dịch trích được chiết tách lại bằng dichloromethane LMG

sẽ bị oxi hóa trở về dạng MG bằng phản ứng với benzoquinone Mẫu phân tích được làm sạch hơn bằng sự chiết với pha rắn gồm alumina và propylsulfonic acid Cuối cùng, dịch chiết được phân tích bằng LC với bước sóng phát hiện ở 618 nm sử dụng cột rửa giải phân tách C18 Phương pháp đã phân tích được 35 mẫu cá hồi nuôi với sự thêm chuẩn ở 1, 2, 4, và 10 ng/g (ppb) thì có được hiệu suất thu hồi trung bình là 95,4 %, độ sai số ± 11,1 % Với 5 mẫu cá hồi trong hộp với sự thêm chuẩn ở 10 ng/g thì hiệu suất thu hồi trung bình là 88,9 %, độ sai số ± 2,6 % Giới hạn phát hiện của phương pháp này

2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-là 1 ng/g

2.3.3 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng

Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ bằng

sắc ký lỏng được báo cáo bởi nhóm tác giả: Halme K, Lindfors E, Peltonen K , có

giới hạn phát hiện tương ứng là 0,8 và 0,6 µg/kg Hai hợp chất trên được chiết với một hỗn hợp dung dịch đệm acetate-acetonitrile và được chiết tách lại trong methylene chloric Sử dụng hệ thống chiết pha rắn tự động gồm những cột chiết chứa pha rắn acid propylsufonic và alumina để làm sạch dịch chiết Sự phân tách

MG và LMG hoàn toàn trên cột Chrompher 5B, sử dụng pha động là dung dịch đệm acetate-acetonitrile LMG được chuyển về dạng MG bằng phản ứng sau cột trước khi đo phổ ở bước sóng 600 nm Hiệu suất thu hồi của MG và LMG trong một dãy mẫu kiểm soát có thêm chuẩn từ 2 đến 50 µg/kg tương ứng là 65 % (trong dãy 63,4 – 65,9 %, độ sai số 3,9 – 16,1 %) và 74 % (trong dãy 58,3 – 82,6

%, độ sai số 3,3 – 11,4 %)

Việc xác định dư lượng các cặn bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phép ghi phổ khối lượng, phương pháp này có giới hạn phát hiện là 2,5 và 1 µg/kg tương ứng với MG và LMG

Theo quy định của Bộ Thủy Sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên Viện nghiên cứu và phát triển thủy sản Hàn Quốc- NFRDI (2002) thử nghiệm tồn lưu của 2 chất Oxytetracyline HCl và Sulfadimethoxine trên đối tượng cá catfish cho kết quả thời gian đào thải là sau

30 ngày, đối với Lươn sự đào thải của Ciprofloxacine và Ofloxacin là 35 ngày Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu trong cá Chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới 100 ngày, với cá Hồi chấm là không dưới 10 tháng (Raoul và ctv, 2002)

Theo quá trình theo dõi và phân tích sự tồn lưu MG trên cá tra để trị bệnh

kí sinh trùng cho thấy (www.vietlinh.com.vn):

2.5 Một số qui định của các quốc gia về việc cấm sử dụng một số loại thuốc

và hoá chất

Trước tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản một cách tràn lan, Bộ Thủy Sản đã ra quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/2/2005 về ban hành danh mục hoá chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản; Chỉ đạo các cơ quan Báo, Đài tại địa phương tuyên truyền

về tác hại của các loại thuốc thú y, hoá chất, kháng sinh trong danh mục hạn chế

sử dụng và cấm sử dụng theo quy định của Bộ Thủy sản, đặc biệt là MG (http://www.fistenet.gov.vn cập nhật ngày 27/9/2006)

Khối EU có những qui định nghiêm ngặt cho phép sử dụng kháng sinh, hoá chất trong nuôi trồng thủy sản, Theo chỉ thị EC số 2377/90 qui định danh mục cấm sử dụng gồm 10 kháng sinh và 01 hoá chất Malachite green, 31chất hạn chế sử dụng (Theo website:http://www.nafiqaved.gov.vn/ NAFIQAVED cập nhật ngày 25/3/2006)

Mỹ là Quốc gia có qui định nghiêm ngặt về việc cho phép sử dụng thuốc, hoá chất trong nuôi trồng thủy sản Danh mục các chất cấm sử dụng là 11 chất (http://www.nafiqaved.gov.vn NAFIQAVED, cập nhật ngày 7/9/2006)

Theo qui định của Bộ Thủy sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu trong cá Chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới 100 ngày, với cá Hồi chấm không dưới 10 tháng (Raoul et al, 2002)

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Phương tiện nghiên cứu

Mục đích: chọn ra phương pháp có hiệu suất tốt nhất từ đó áp dụng tiến

hành cho thí nghiệm xác định sự tồn lưu của MG và LMG trong nguyên liệu cá tra

Phương pháp gây nhiễm

Cá được chọn là sạch bệnh, không nhiễm MG Tiến hành gây nhiễm bằng cách cho trực tiếp MG và LMG với nồng độ 1 ppm vào mẫu cá sau khi chuẩn bị

mẫu xong để phân tích

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí với 1 nhân tố với 2 lần lặp lại

Nhân tố phương pháp kiểm tra dư lượng MG trong nguyên liệu cá tra

M1 M2 M3

Máy phân tích

Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1

Tiến hành thí nghiệm

Cá Tra fillet tiến hành xay nhỏ qua cối xay thịt có đường kính lỗ sàng 2-3

mm Mẫu thử sau khi đã chuẩn bị xong được gây nhiễm hóa chất MG, LMG ở nồng độ biết trước và tiến hành khảo sát 3 phương pháp kiểm ra dư lượng MG, LMG trong cá tra

3.2.1.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu

cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS)

I Nguyên tắc

MG, LMG được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch hydroxylamine.HCl và acetonitrile Dịch chiết thu được cho qua đầu lọc 0.2 µm rồi đem phân tích bằng LC-MS

II Trang thiết bị

1 Các loại dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm

2 Ống ly tâm nhựa loại 15 ml

2 Acetonitrile loại tinh khiết phân tích HPLC

3 Pha động A: Ammonium acetate 0.1M có pH = 4,5

4 Pha động B: Acetonitrile

5 Chuẩn MG tinh khiết, loại có giấy chứng nhận hàm lượng

6 Chuẩn LMG tinh khiết, loại có giấy chứng nhận hàm lượng

7 Dung dịch chuẩn MG gốc 1000 ppm: Hòa tan 100 mg MG bằng methanol trong bình định mức 100 ml Định mức đến vạch bằng methanol Bảo

8 Dung dịch chuẩn trung gian MG 10 ppm: Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn MG gốc 1000 ppm với methanol trong bình định mức 100 ml Định mức

10 Dung dịch chuẩn LMG gốc 1000 ppm: Hòa tan 100 mg LMG bằng methanol trong bình định mức 100 ml Định mức đến vạch bằng methanol Bảo

11 Dung dịch chuẩn trung gian LMG 10 ppm: Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn LMG gốc 1000 ppm với methanol trong bình định mức 100 ml Định mức

bền 6 tháng

12 Dung dịch chuẩn trung gian LMG 1ppm: Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn LMG gốc 10 ppm trong bình định mức 10 ml Định mức đến vạch bằng

13 Mẫu cá phân tích là các mẫu cá tra fillet sạch bệnh

IV Quy trình phân tích

1 Chuẫn bị mẫu: Nghiền đồng nhất 50 g mẫu cá Bảo quản dung dịch

hoàn toàn

2 Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống

nghiệm falcon 15 ml Tiến hành ly trích MG và LMG

3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát có thêm chuẩn: Cân 3 g mẫu cá đã được

nghiền đồng nhất vào ống nghiệm falcon 15 ml Thêm 39 µl dung dịch chuẩn MG

1 ppm và LMG 1 ppm Tiến hành ly trích MG và LMG

4 Ly trích MG và LMG

- Cân thật chính xác 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm

ly tâm bằng nhựa có nấp đậy 15 ml

- Thêm vào ống nghiệm 3 ml dung dịch hydroxylamine.HCl 5 g/l Khuấy mạnh bằng máy lắc vortex khoảng 1 phút rồi để yên khoảng 10 phút

- Sau đó thêm tiếp 5 ml acetonitrile, rồi lắc bằng máy với vận tốc trung bình khoảng 15 phút Tiếp theo đem ly tâm 4000 rpm trong 3 phút Thu lấy dịch trong, cho vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml khác thật sạch

- Phần cặn còn lại được thêm tiếp 5 ml acetonitrile, rồi lắc đều khoảng 15 phút Tiếp theo đem ly tâm 4000 rpm trong 3 phút Thu lấy dịch trong cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết ban đầu Phần cặn sau cùng được bỏ

- Mang ống nghiệm đã chứa toàn bộ dịch chiết trong 2 lần chiết ly tâm

4000 rmp trong 10 phút

- Dung dịch tách 2 lớp, hút lớp trên vào bình cầu 100 ml, sau đó đem cô quay đến khô

Hình 3.2: Hệ thống cô quay chân không

- Hòa tan cặn khô bằng 1 ml hỗn hợp dung dịch đệm : ACN (50:50) trong

bể siêu âm Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình

Lấy khoảng 1 ml dịch trong đem lọc qua đầu lọc 0.2 µm

Cô quay chân không đến khô Hoà tan cặn bằng 1 ml dung dịch đệm acetate : ACN (50:50)

3.2.1.2 Phương pháp 2: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên

liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS)

I Nguyên tắc

MG và LMG được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch đệm acetate - acetonitrile Dịch trích được làm sạch bằng qui trình chiết lỏng - lỏng với chloroform Dịch chiết sau đó được cô đến khô ở 48 °C Hòa tan cặn thu được trong pha động Lọc dung dịch qua đầu lọc 0.2 µm và đem phân tích bằng LC-MS

II Trang thiết bị

1 Các loại dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm

2 Ống ly tâm nhựa loại 2 ml, 5 ml, 50 ml

III Hóa chất, dung dịch

Tất cả các hóa chất sử dụng trong quy trình là loại tinh khiết phân tích

1 Acetonitrile loại tinh khiết HPLC

2 Chloroform loại tinh khiết HPLC

3 Methanol loại tinh khiết HPLC

4 Nước cất hai lần

5 Diethylene glycol (DEG)

6 Sodium acetate trihydrate

7 p-toluen sulfonic acid monohydrate (TSA)

8 N,N,N,N-tetramethyl-1,4-phenilenediamine dihydrochloride (TMPD)

9 Acid acetic

10 Hydroxylamine.HCl (HA)