Tài liệu Luận văn tốt nghiệp: " Mức độ tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite trong nguyên liệu cá tra" doc

i TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BÙI THỊ THU CÚC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2009 MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN LIỆU CÁ TRA ii TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BÙI THỊ THU CÚC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.S VƯƠNG THANH TÙNG 2009 MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN LIỆU CÁ TRA iii Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài: “MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN LIỆU CÁ TRA” do sinh viên Bùi Thị Thu Cúc thực hiện và báo cáo ngày 16 tháng 07 năm 2009, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Luận văn đã chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng và được giáo viên hướng dẫn xét duyệt. Cần Thơ, ngày 19 tháng 07 năm 2009 Cán bộ hướng dẫn Th.S Vương Thanh Tùng i LỜI CẢM TẠ Luận văn là bước đánh giá cuối cùng của quá trình học tập, rèn luyện một sinh viên trong môi trường đại học. Thực hiện tốt luận văn không chỉ nhờ sự cố gắng bản thân mà còn nhờ nhiều vào sự giúp đỡ từ thầy cô cán bộ. Để hoàn thành được đề tài luận văn này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Vương Thanh Tùng đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện. Ghi lòng biết ơn đến cô cố vấn học tập Lê Thị Minh Thủy vì đã hết lòng giúp đỡ không chỉ trong đợt luận văn mà còn trong suốt khóa học. Chân thành cảm ơn đến thầy cô giảng dạy bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến đã truyền đạt những kiến thức quý báu và bổ ích. Cảm ơn đến chị Lương Diễm Trang học viên cao học K13 và anh Nguyễn Thanh Phong cán bộ phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ thực hiện các thao tác thực nghiệm cho tôi hoàn thành đề tài. Cám ơn cha mẹ và gia đình đã quan tâm, chăm sóc và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài này. Gởi lời cảm ơn và chúc thành công đến tất cả các bạn lớp Chế Biến Thủy Sản K31, những người luôn giúp đỡ tôi trong khi thực hiện đề tài. Cần Thơ, tháng 05 năm 2009 Sinh viên thực hiện Bùi Thị Thu Cúc ii TÓM TẮT Trong tình hình hiện nay, xuất khẩu thủy sản của nước ta phải đối mặt với một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dịch bệnh và dư lượng hóa chất, kháng sinh trong thủy sản. Dư lượng các hóa chất, kháng sinh còn tồn đọng trong thủy sản rất có hại đối với sức khỏe con người và nền kinh tế nước nhà. Vì vậy, việc xác định “mức độ tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite trong nguyên liệu cá tra” được thực hiện nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite trong cá tra. Đề tài bao gồm hai thí nghiệm: Thí nghiệm (1) Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tươi bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ. Từ đó, có thể chọn ra một phương pháp cho hiệu suất tốt nhất để tiến hành thí nghiệm (2) xác định mức độ tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite green trong cá tra. Thí nghiệm (2) cá được gây nhiễm hai lần gồm ba nồng độ MG gây nhiễm: 0,1 ppm, 0,15 ppm và 0,2 ppm với 9 mức thời gian thu mẫu: trước khi gây nhiễm T 0 , sau gây nhiễm lần 1: 6 giờ (T 1 ), 72 giờ (T 2 ). Sau gây nhiễm lần 2: 6 giờ (T 3 ), 72 giờ (T 4 ), 7ngày (T 5 ), 14 ngày (T 6 ), 28 ngày (T 7 ), 56 ngày (T 8 ). Chất phân tích sau khi chiết tách được xác định bằng LC-MS. Kết quả cho thấy phương pháp 2 là phương pháp tốt nhất với hiệu suất đạt và chọn làm thí nghiệm (2). Ở thí nghiệm (2) nồng độ MG tìm thấy trong cơ và da cá khi gây nhiễm ở tất cả các nghiệm thức đều giảm xuống sau 72 giờ gây nhiễm lần. Hàm lượng MG phát hiện trong cá ở nghiệm thức 0,1 ppm và 0,15 ppm cho thấy sau 28 ngày gây nhiễm nồng độ MG thấp hơn mức ấn định dư lượng tối đa của MG và LMG (không được vượt quá hai phần tỉ (ppb)) trong sản phẩm thủy sản của các quốc gia trong khối Liên hiệp Âu Châu và Úc Châu (Quyết định số 2002/657/EC ngày 22/12/2003). Sau 56 ngày sau gây nhiễm thì nồng độ MG vẫn còn tồn lưu trên cá tra với nồng độ thấp (0,31-2,42 ppb). iii CÁC TỪ VIẾT TẮT MG Malachite green LMG Leucomalachite green MW Molecular Weight MF Chemical Formula ppb Parts per billion ppm Parts per million ng Nanogram µm Micrometer HPLC High pressure Liquid chromatography MS Mass spectrometry LC-MS Liquid chromatography- Mass spectrometry EU Thị trường Châu Âu BTS Bộ Thủy Sản GDP Gross Domestic Product ACN Acetonitrile HA Hydroxylamine.HCl DEG Diethylene glycol TSA p-toluen sulfonic acid monohydrate TMPD N,N,N,N-tetramethyl- 1,4- phenilenediamine dihydrochloride iv DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 15 Hình 3.2: Hệ thống cô quay chân không 18 Hình 3.3: Qui trình li trích MG ở phương pháp 1 19 Hình 3.4: Thiết bị li tâm lạnh 22 Hình 3.5: Bình chiết 23 Hình 3.6: Qui trình li trích MG ở phương pháp 2 24 Hình 3.7: Qui trình li trích MG ở phương pháp 33.2.3 Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra 27 Hình 3.8: Bể nuôi 29 Hình 3.9: Sơ đồ bố trí nghiệm xác định mức độ tồn lưu của MG và LMG trong nguyên liệu cá tra 30 Hình 4.10: Đồ thị đường chuẩn 33 Hình 4.11: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm 37 Hình 4.12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm 40 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Tín hiệu trên máy LC-MS đọc được ứng với nồng độ chuẩn 33 Bảng 4.2: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn MG, LMG 39 ppb 34 Bảng 4.3: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG và LMG 35 Bảng 4.4: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG, LMG 36 Bảng 4.5: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm 37 Bảng 4.6: Sự tồn lưu của MG theo thời gian thí nghiệm 39 Bảng 4.7: Sự tồn lưu của LMG theo thời gian thí nghiệm 40 vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ I TÓM TẮT II CÁC TỪ VIẾT TẮT III DANH SÁCH HÌNH IV DANH SÁCH BẢNG V DANH SÁCH BẢNG V MỤC LỤC VI CHƯƠNG 1 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.1 Giới thiệu 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1 1.3 Nội dung nghiên cứu 2 1.4 Thời gian thực hiện 2 CHƯƠNG 2 3 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Tìm hiểu về malachite green 3 2.1.1 Sơ lược về malachite green 3 2.1.2 Tình hình sử dụng MG 4 2.1.3 Các ứng dụng của Malachite green 5 2.1.4 Tác hại của Malachite green 6 2.1.5 Công dụng của Malachite green sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 7 2.1.6 Chất thay thế malachite green 7 2.2 Nguyên liệu cá tra 7 2.2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra 7 2.2.2 Tình hình phát triển ngành nuôi cá tra 8 2.3 Các phương pháp xác định dư lượng Malachite green 8 2.3.1 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong các sản phẩm cá bằng sắc kì lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) 10 2.3.2 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG bằng sắc kí lỏng (LC) với sự oxi hóa LMG 11 2.3.3 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng 11 2.4 Mức độ tồn lưu của chất kháng sinh 11 2.5 Một số qui định của các quốc gia về việc cấm sử dụng một số loại thuốc và hoá chất 12 CHƯƠNG 3 14 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 14 3.1 Phương tiện nghiên cứu 14 3.1.1 Địa điểm 14 3.1.2 Nguyên vật liệu 14 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 14 vii 3.2 Phương pháp thí nghiệm 14 3.2.1 Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tra bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ 14 3.2.2 Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra . 28 3.3 Xử lý số liệu 32 CHƯƠNG 4 33 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Xây dựng đường chuẩn MG, LMG 33 4.2 Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tra bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ 33 4.2.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) 34 4.2.2 Phương pháp 2: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) 35 4.2.3 Phương pháp 3: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) 36 4.3 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống 37 4.3.1 Sự tồn lưu của MG + LMG 37 4.3.2 Sự tồn lưu của MG 39 4.3.3 Sự tồn lưu của LMG 40 CHƯƠNG 5 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề xuất 43 PHỤ LỤC 1 44 PHỤ LỤC 2 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 [...]... th y s n trong nư c và i s ng c a ngư i dân lao ng nư c ta Vi c xác nh ư c dư lư ng các ch t kháng sinh còn t n lưu trong các loài ng v t th y s n cũng ã ư c nghiên c u nhi u trong và ngoài nư c, nhưng s t n lưu MG trong cá tra, ng v i i u ki n nuôi ng B ng Sông C u Long thì ít ư c nghiên c u Nên nh ng thông s v “m c t n lưu Malachite green và Leucomalachite green trong nguyên li u cá tra” r t c n thi... y trùng trong các h gây cá gi ng và trong các mô hình nuôi tr ng th y s n 5 2.1.4 Tác h i c a Malachite green Khi vào cơ th cá, MG s b phân h y thành ch t chuy n hóa (metabolite) là Leucomalachite Green Th i gian ào th i c a MG nhanh, ngư c l i ch t LMG có th t n t i trong th i gian r t lâu trong th t và nh t là trong m c a cá ã b nhi m MG c tính c a MG có liên h t i nhi t nư c nhi t th p, cá có th... detector Sau ây, m t vài phương pháp xác c a nó trong cá c a nhi u nhóm tác gi : nh dư lư ng MG và ch t chuy n hóa ∗ Phương pháp xác nh dư lư ng malachite green và leucomalachite green trong nguyên li u cá tra b ng s c kí l ng ghép v i ph kh i lư ng (LCMS/MS) Nhóm tác gi Van de Riet JM, Murphy CJ, Pearce JN, Potter RA, Burns BG ∗ Phương pháp xác nh dư lư ng Malachite green và Leucomalachite green b ng s c... ngành nuôi cá tra Trong h cá tra có m t s loài ư c nuôi trong h t lâu i, c bi t là cá tra (cá tra nuôi) Ngày nay ngành cá nuôi tr thành m t công nghi p nuôi và ch bi n mà h cá tra là tr ng i m Trên à nghiên c u cho ngành cá nuôi có r t nhi u báo cáo v môi trư ng s ng, th c ăn c a h cá tra trong i u ki n thiên nhiên và trong i u ki n "gia ngư hóa" Hình th c nuôi: Nuôi thâm canh, bán thâm canh v i các mô... tích dư lu ng MG trong nguyên li u cá tra sau các giai o n lây nhi m, tài nh m xác nh th i gian t n lưu c a hoá ch t MG 1 trong nguyên li u cá tra T ó có thêm thông tin cho các nhà nuôi tr ng và ch bi n trong vi c hư ng t i vi c s d ng hoá ch t, kháng sinh hi u qu và an toàn nâng cao ch t lư ng và an toàn nguyên li u cá tra trư c khi ưa vào ch bi n 1.3 N i dung nghiên c u Kh o sát các phương pháp ki... green và Leucomalachite green Reduction - HCl - Cl H3C N Oxidation N CH3 CH3 H3C N CH3 N CH3 CH3 CH3 Leucomalachite green (LMG) Malachite green (MG) Malachite green, Green malaquite, Grenoble green Tên qu c t (IUPAC): [4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methylidene]1-cyclohexa-2,5-dienylidene]-dimethyl-ammonium chloride 3 Kh i lư ng phân t (MW): 364,911 Công th c phân t (MF): C23H25N2Cl Malachite green. .. tra dư lư ng kháng sinh MG trong cá tươi b ng s c kí l ng cao áp ghép kh i ph Thí nghi m xác nh th i gian t n lưu c a MG và LMG trong cá tra 1.4 Th i gian th c hi n T tháng 01/2009 n tháng 05/2009 2 Chương 2 LƯ C KH O TÀI LI U 2.1 Tìm hi u v malachite green 2.1.1 Sơ lư c v malachite green Các qu c gia trong kh i liên hi p Âu Châu và Úc Châu n nh ng ch s t i a c a MG và LMG trong th y s n là ph i m c... green b ng s c ký l ng (LC) v i s oxi hóa Leucomalachite green Nhóm tác gi Andersen WC, Roybal JE, Turnipseed SB ∗ Phương pháp xác nh dư lư ng Malachite green và Leucomalachite green trong cá h i B c M b ng s c ký l ng và s c ký l ng ghép v i ph kh i lư ng Nhóm tác gi Halme K, Lindfors E, Peltonen K 2.3.1 Phương pháp xác nh dư lư ng MG và LMG trong các s n ph m cá b ng s c kì l ng ghép v i ph kh i lư... dùng trong phòng thí nghi m nhu m vi khu n và bào t c a nó T lâu, MG ươc xem là ch t di t n m (lo i saprolegnia ssp) và di t kí sinh trùng nhóm nguyên sinh v t (protozoa) Leuco malachite green ư c sinh ra t s kh malachite green b i các enzyme trong cá, m t h p ch t chuy n hoá r t b n c a MG LMG ư c tích lu bên trong, v béo cơ th t, t n tr lâu dài trong cơ th t c a cá 2.1.1.2 Công th c c u t o c a Malachite. .. ngh cá và hàng h i Hàn Qu c (MMAF), MG ã ư c tìm th y trong các tr i nuôi cá H i và cá Chép tám vùng c a Hàn Qu c Trong các ngày t 15/9 n 3/10/2005, c c thanh tra ch t lư ng th y s n qu c gia Hàn Qu c (NEPQIS) ã ti n hành ki m tra kh p các tr i nuôi cá nư c ng t và nư c l trên c nư c và ây là l n u tiên Hàn Qu c phát hi n th y MG trong các tr i nuôi cá nư c này Lư ng hóa ch t dao ng t 0,1-3 ppm (www.Intrafish.com) . VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN LIỆU CÁ TRA iii Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài: “MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN VÀ. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2009 MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN LIỆU CÁ