xác định glucose và fructose từ quá trình đồng phân hóa glucose bằng hplc xác định hàm lượng đường glucose và fructose trong nguyên liệu mía bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion

xác định glucose và fructose từ quá trình đồng phân hóa glucose bằng hplc xác định hàm lượng đường glucose và fructose trong nguyên liệu mía bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA

BÁO CÁO TIỂU LUẬN MÔN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

GVHD: Nguyễn Đức Vượng Lớp : DHPT6LT

Nhóm : 06

Danh sách nhóm

1. Hoàng Duy Hào

2. Nguyễn Thị Thu Hoài

3. Nguyễn Ngọc Hoàng

4. Trương Thắng Hồi

5. Lê Minh Hiếu

6. Phan Huỳnh Tuấn Khoa

7. Phan Thanh Phú

8. Trần Văn Trình

9. Nguyễn Minh Tú

XÁC ĐỊNH GLUCOSE VÀ FRUCTOSE TỪ QUÁ TRÌNH

ĐỒNG PHÂN HÓA GLUCOSE BẰNG HPLC

1 Giới thiệu chung về glucid

2.Vài nét về glucose và fructose

3 Phương pháp xác định

4 Xác định glucose và fructose từ quá trình đồng phân hóa glucose bằng phương pháp HPLC với đầu dò UV

Giới thiệu chung về glucid

1 Tổng quan về glucid:

Lượng glucid trong các nguyên liệu thực vật và động vật rất khác nhau Trong thực vật, glucid là thành phần chủ yếu, chiếm tới 85-90% trọng lương chất khô Đường và tinh bột được chứa bên trong các tế bào còn non, còn ở thành tế bào thì có các polysacchrid như cellulose, hemicellulose, protopectin

Trong các thực phẩm động vật, thường lượng glucid lại rất ít (thường không vượt quá 2% so với lượng chất khô) Thịt và trứng có rấi ít glucid, chỉ cá, sữa là tương đối nhiều hơn.

Nguồn glucid mà thực phẩm cung cấp cho con người chủ yếu lấy từ thực vật

Glucid có bản chất hóa học là polyhydroxy aldehyde hoặc polyhydroxy ketone Đa số các glucid có công thức tổng quát là (Cm(H2O)n) Ngoài ra còn có một số loại glucid đặc biệt, trong cấu trúc của chúng ngoài C, H,

O còn có thêm S, N, P.

Phân loại glucid

1 Theo cấu trúc hóa học:

-Đường đơn (Mono saccharides): đường có 6 carbon phổ biến như đường Glucoza, đường Fructoza, đường Galactoza

-Đường kép (Disaccharides): phổ biến như sucroza, lactoza, mantozo…

-Đường đa (Polysaccharides): tinh bột, glycogen và cellulozo

Hoặc ta có thể chia làm hai nhóm:

- Nhóm oza gồm các loại đường trực tiếp khử oxy do có nhóm andehyt hay xeton tự do trong phân tử VD: glucoza, fructoza, latoza

- Nhóm ozit, không trực tiếp khử oxy do có nhóm aldehyt và xeton ở dưới dạng kết hợp với nhóm chức khác khi thủy phân cho hai hoặc nhiều oza VD: tinh bột, saccaroza…hoặc khi thủy phân ngoài các oza còn cho các chất không phải oza VD: glucozit Những glucozit không có giá trị về dinh dưỡng, mà là những chất có tính chất dược lý dùng làm thuốc chữa bệnh: hoặc là các chất độc.

Phân loại glucid

2 Theo tính chất:

Glucid tinh chế: đây là các Glucid đã thông qua nhiều mức làm sạch

và loại bỏ tối đa các chất thô kèm theo Tỉ lệ các Glucid tinh chế trong thực phẩm càng cao, thực phẩm càng dễ tiêu hóa và nhanh chóng được sử dụng để cung cấp năng lượng cho cơ thể Glucid tinh chế cao có trong sản phẩm đường, bánh kẹo…

Glucid bảo vệ: thuộc nhóm này là các Glucid thực vật dưới dạng tinh bột có kèm theo lượng Cellulo không ít hơn 0.4%, ví dụ như khoai tây, ngũ cốc nguyên hạt Nhóm Glucid này chậm tiêu và rất ít được

sử dụng để tạo mỡ

Vai trò của glucid

Glucid có vai trò rất quan trọng trong cơ thể sống:

• Tham gia mọi hoạt động sống của tế bào

• Là nguồn chất dinh dưỡng dự trữ dễ huy động, cung cấp chủ yếu các chất trao đổi trung gian và năng lượng cho tế bào

• Tham gia vào cấu trúc của thành tế bào thực vật, vi khuẩn; hình thành bộ khung (vỏ) của nhóm động vật có chân khớp

• Tham gia vào thành phần cấu tạo của nhiều chất quan trọng như: AND, ARN…

Đối với công nghệ thực phẩm, vai trò của glucid cũng đa dạng và vô cùng quan trọng:

• Là chất liệu cơ bản, cần thiết và không thể thiếu của ngành sản xuất lên men: rượu, bia, bột ngọt, acid amin, vitamin, kháng sinh - Tham gia tạo cấu trúc, hình thù, trạng thái và chất lượng cho các loại sản phẩm thực phẩm

Vai trò của glucid

• Tạo kết cấu:

Tạo sợi, tạo màng, tạo gel, tạo độ đặc, độ cứng, độ đàn hồi cho thực phẩm: tinh bột, thạch, pectin trong miến, mứt quả, kem, giò lụa… - Tạo kết cấu đặc thù của một số loại thực phẩm: độ phồng nở của bánh phồng tôm, tạo bọt cho bia, độ xốp cho bánh mì, vị chua cho sữa…

• Tạo chất lượng

Chất tạo ngọt cho thực phẩm (các đường) - Tham gia tạo màu sắc và

hương thơm cho sản phẩm (đường trong phản ứng caramen hoá, melanoidin…) - Tạo ra các tính chất lưu biến cho sản phẩm thực phẩm: độ dai, độ trong, độ giòn, độ dẻo… - Có khả năng giữ được các chất thơm trong sản phẩm thực phẩm - Tạo ẩm cũng như làm giảm hoạt độ nước làm thuận lợi cho quá trình gia công cũng như bảo quản

Vài nét về glucose và fructose

1. D-Glucose

2. D-Fructose

Đây là loại monosaccharid phổ biến ở động vật và thực vật Nó

có nhiều trong nho chín nên còn được gọi là đường nho

Trong dung dịch, D-glucose ở dạng pyranose Dễ bị lên men bởi nấm men

D- glucose là thành phần cơ bản cấu tạo nên nhiều loại polysaccharid: tinh bột, glycogen, cellulose,…

CHO

C OH H

C H HO

C OH H

C OH H

CH2OH

D - glucose

O H

H

CH2OH

OH

O H

Đây là loại monosacharid phổ biến ở thực vật Nó có nhiều trong quả và mật hoa D-Fructose có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái nên còn được gọi là levulose Khi khử fructose tạo thành sorbitol và manitol D-Fructose thường tồn tại dưới dạng furanose, dễ bị lên men bởi nấm men…

Sự đồng phân hóa glucose

Phản ứng lên men là một phản ứng hóa học với những enzyme đóng vai trò là những chất xúc tác sinh học Theo Shuler & Kargi (1992) Dưới những điều kiện xung quanh, sự hiện diện của enzyme dẫn đến kết quả là tốc độ trong những phản ứng bậc cao hơn cũng như phản ứng hóa học Vai trò của xúc tác enzym trong hóa hữu cơ và công nghệ sinh học đã tăng lên rất nhiều trong thập niên trước.

Sự đồng phân hóa của D-Glucose thành D-Fructose bằng cách các đồng phân glucose được giữ cố định là một trong những ví dụ về phản ứng lên men Phản ứng này là một phản ứng thuận nghịch và là quá trình quan trọng của công nghiệp để sản xuất đường fructose hiệu năng cao (HFS) với ít nhất là 50% glucose chuyển thành fructose

Vài nét về sắc kí

Sắc kí là một họ các kỹ thuật hóa học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng

sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian Một cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là

"thời gian lưu.“

Lý thuyết sắc ký:

Sắc kí là kỹ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong

phân bố giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong

hỗn hợp Các thành phần của hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnh dựa trên điện tích, độ tan tương đối và tính hấp phụ

Mức lưu giữ

Mức lưu giữ đo tốc độ một chất di chuyển trong hệ thống sắc kí

Ở các hệ thống liên tục như HPLC hay GC mà các hợp chất được

chiết xuất bởi chất chiết xuất, mức lưu giữ được đo bằng thời gian

lưu Rt hay tR, khoảng thời gian giữa tiêm và phát hiện Ở các hệ

thống ngắt quãng như TLC, mức lưu giữ được đo bằng hệ số lưu

Rf, quãng đường di chuyển của hợp chất chia cho quãng đường di chuyển của chất chiết xuất (chạy nhanh hơn hợp chất cần phân tích)

Mức lưu giữ của một chất thường khác nhau đáng kể giữa các thí nghiệm và phòng thí nghiệm do dao động của chất chiết xuất, pha tĩnh, nhiệt độ và thiết kế của thí nghiệm Vì vậy điều quan trọng là phải so sánh mức lưu giữ của hợp chất muốn khảo sát với một hoặc nhiều hợp chất chuẩn trong cùng điều kiện

Vài nét về sắc kí

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Là phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng còn pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng

đã phủ lên một chất mang rắn hay là một chất mang đã được biến đổibằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Qúa trình sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

● Nước được khử ion và acetonitril

● Dung dịch chuẩn được chuẩn bị bằng cách sau: với 2g/100ml của G và F được pha loãng với nước cất và lọc qua bộ lọc Nylon 0,2μm trước khi đem phân tích bằng HPLC

Hóa chất và thiết bị

2.Thiết bị

Hệ thống HPLC trong nghiên cứu này là : 1 Agilent 1100 với bảng điốt của detector UV phát hiện ở 195nm với t0 là 300 C, tốc độ dòng 0,6ml/phút và tốc độ tiêm mẫu 20μL

Cột được dùng là cột Supelco Kromasil NH2( 250nm × 4,5μm)

Tỷ lệ acetonitril và nước khử ion được dùng với tỉ lệ 80% : 20% Một cột bảo vệ được gắn với đầu vào của cột Kromasil để ngăn ngừa sự tắc nghẽn

Từ bảng 1 ta có thể xác nhận rằng fructose(chủ yếu) và glucose có thể được xác định bằng cách sử dụng detector UV Thời gian lưu của fructose là 14,2 phút và glocose là 16,25 phút

Table 1 The retention time tr (min) and the area (mAUs) of glucose and fructose by HPLC-

UV at different concentrations

on a Kromasil NH2 column

Kết quả

Đồ thị của lượng glucose và fructose tại các khoảng nồng độ cụ thể Những giá trị của R2 (cho) cả fructose và glucose xác nhận rằng những kết quả thống kê này đáng tin cậy

Kết quả

Hình trên là kết quả dùng HPLC tách được fructose và glucose bằng cách sử dụng cột Kromasil ở nồng độ 0,5% với detector UV

Kết luận

Từ nghiên cứu trên có thể cho ta kết luận rằng fructose và glucose có thể được xác định bằng phương pháp HPLC sử dụng detector UV (195nm) với dung môi acetonitril và nước tỷ lệ 8:2

Tài liệu tham khảo

[1] Modern Applied Science_www.ccsenet.org/journal.html_Vol.2, No.4 July 2008_ Determination of Glucose and Fructose from Glucose Isomerization Process by High-performance Liquid Chromatography with UV Detection

[2] http://vi.wikipedia.org/wiki/Sắc_kí

[3].http://www.dutchlady.com.vn/?id_pnewsv=270&lg=vn&start

=0&alpha=C

v-s%E1%BB%B0-Chuy%E1%BB%82n-HoA-c%E1%BB%A6a-

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSE

VÀ FRUCTOSE TRONG NGUYÊN LIỆU MÍA BẰNG PHƯƠNG

PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ANION

PHẠM VI ÁP DỤNG Xác định hàm lượng đường glucose và fructose của nguyên liệu mía giới hạn phát hiện từ 0.080% – 0.25%

Carbohydrates thì được tách trên màng mỏng của cột trao đổi anion

và được đo bằng đầu dò xung amperometric (PAD)

Carbohydrates thì được nhận dạng và định lượng bằng cách so sánh với dung dịch chuẩn

THIẾT BỊ

 Sắc ký lỏng: - Bơm có áp suất cao

- Autosampler hoặc van tiêm bằng tay

- Cột HPAEC trao đổi anion amin bậc 4

- Đầu dò xung amperometric với điện cực làm bằng vàng, đường kính 1.4-3mm, phạm vi đo phù hợp là 1µA-5µA

 Cột và đầu dò nhiệt: thiết lập, điều chỉnh ở nhiệt độ 270C

 Kết nối: kết nối với điện hoặc nối với phần mềm máy vi tính Chiều rộng của peak được lựa chọn đảm bảo rằng cùng một loại kết nối được sử dụng từ các peak đường trong phổ đồ của cả mẫu thử và chuẩn Chiều cao của peak được định lượng lớn hơn từ các sự trở ngại bởi các peak kề nhau

He, dung môi rửa giải chảy ra và vent) thì phù hợp chứa pha động

CÁCH TIẾN HÀNH

HIỆU CHUẨN DUNG DỊCH CHUẨN

2 CHUẨN BỊ DUNG DỊCH KIỀM TRA ĐƯỜNG

3 ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH

4 TÍNH TOÁN KẾT QUẢ

1

HIỆU CHUẨN DUNG DỊCH CHUẨN

 Chuẩn bị 4 dung dịch chuẩn để hiệu chuẩn Đối với đường chứa monosaccharides trong khoảng 0.005-0.15% thì chuẩn bị 50g dung dịch chứa 0.25g glucose và 0.25g fructose Ước lượng trọng lượng của dung dịch glucose/fructose và dung dịch lactose, C(c).

 Chuẩn bị chuẩn S1-S4 trọng lượng được sử dụng như sau cho dung dịch glucose/fructose và dung dịch lactose, tương ứng:

- S1: 0.5 và 10g

- S2: 2.5 và10g

- S3: 5.0 và 10g

- S4: 15.0 và 10g

HIỆU CHUẨN DUNG DỊCH CHUẨN

Tất cả dung dịch pha loãng được dựa trên khối lượng của chất nội chuẩn thêm vào Pha loãng khối lượng mỗi chuẩn trong 100ml flask Đưa qua màng lọc 0.45µm và tiêm vào trong sắc ký lỏng với thể tích bơm mẫu là 20-25µl

CHUẨN BỊ DUNG DỊCH KIỂM TRA ĐƯỜNG

Cân 5.0g ± 0.1mg dung dịch kiểm tra Thêm dung dịch lactose C (c) (cân 1.00g ± 0.1g) hoà tan hoàn toàn và làm loãng đến 50ml Ước lượng pha loãng từ 1ml đến 50ml thể tích flask Cho qua màng lọc 0.45µm và tiêm vào trong sắc ký lỏng với thể tích bơm mẫu là 20-25µl

ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH

Tách nhiều loại đường isocratically, sử dụng 250mM NaOH, tốc độ dòng: 1ml/phút, nhiệt độ cột : 270C,thể tích tiêm mẫu: 20-25µl Tiêm 4 dung dịch đã hiệu chuẩn (20-25µl) ở điểm bắt đầu, ở giữa

và điểm kết thúc của mỗi lần kiểm tra dunng dịch

TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH

Data from a typical raw sugar calibration

RRF values calculated raw sugar calibrition data

Bảng 2:

RFF S1 S2 S3 S4 Mean RSD, % GLUCOSE 0.4206 0.4424 0.4422 0.4442 0.4373 2.6

FRUCTOSE 0.6112 0.6423 0.6415 0.6443 0.6348 2.5

TÍNH TOÁN KẾT QUẢ

Hiệu chuẩn: sử dụng kỹ thuật nội chuẩn

RRF (relative response factor): tỷ lệ chiều cao của peak phân chia với tỷ lệ trọng lượng dùng để xác định việc phân tích (glucose và fructose)

H: chiều cao peak

W: trọng lượng của đường

L s

W

W x

H

H RRF  ) (

TÍNH TOÁN KẾT QUẢ

%sugar sample:

Glucose= chiều cao peak glucose x mean x chất nội chuẩn x lactose gốc

Fructose= chiều cao peak glucose x mean x chất nội chuẩn x lactose gốc

chiều cao peak lactose x m raw sugar x solution

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 AOAC official method 2000.17 determination of trace glucose and fructose in raw cane sugar

 Giáo trình phân tích sắc kí-Trần Nguyễn An Sa,Trường DHCNTP.HCM-2008

 AOAC TDLM method verification workshop- example 2: determiantion of low level glucose in sugar