Luận án tiến sỹ nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzym protease từ b.subtilis s5

Luận án tiến sỹ nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzym protease từ b.subtilis s5 Tài liệu tham khảo Luận án tiến sỹ sinh học " nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng...

TRUONG D~I HOC KHOAHOC TV NHIEN

-YO NGOC B{n

NGHIEN CUU QUA TRINH THUY PHAN PROTEIN CA BANG

ENZYME PROTEASE TU B.5UBTILI5 55

Chuyen nganh: Hml sinh

Mil s6: 1.05.10

TOM TAT LU!N AN TIEN si SINH HOC

THANHPHO HO CHI MINH-2004

Tntong D<;tihQc Khoa hQc Tif nhien TP H6 Chi Minh va Truong

D<;tihQc Thuy san Nha Trang

NguOi huang daD khoa hQc:

1 PGS.TS D6ng Thi Thanh Thu

TP.HCM

2 PGS TS Tr~n Thi Luye'n

Truong D<;tihQc ThUy san Nha Trang

Philo bi~n 1: GS.TSKH Nguy~n Van Thoa

Philo bi~n 2: GS.TSKH Nguy~n TrQngC~n

Philo bi~n 3: PGS.TSKH Ngo Ke'Sudng

Lu~n an dii du<;1cbao v~ truoc HQi d6ng cha'm lu~n an ca'p Nhanuoc hQp t<;tiTruong D<;ti hQc Khoa hQc Tif nhien -D<;ti hQc Qu6c gia

TP H6 Chi Minh

Vao h6i 9 gio 00 ngay 15 thang 10 Dam 2004

Co th~ HIDhi~u luij.n an t~i:

Thu vi~n Truong D<;tihQc Khoa hQc Tif nhien - DHQG TP.HCMho<\icthu vi~n Khoa hQcT6ng h<;1pTP.HCM

Md DAU

1 Ti'nh dIp thie't ciia lu~n an

Protease 1a mt)t nh6m enzyme du<;lcling d\mg trong nhi~u lInh vtfcnhu: Nong nghi~p, cong ngM Thtfc phffm Trong thai gian gh day mt)ts6 nha khoa hQcdii tie'n hanh nghien CUusit d\mg protease trong che' bie'nThuy san Nhung, cac cong trlnh nghien cUu sit d\mg protease trong lInhvtfc nay chua dffy du va v§:ndn du<;lctie'p t\1Cnghien CUu.Bay la lInh vtfccon mai me nhUng co ra't nhi~u tri~n vQng d nuac ta

Nguai ta co th~ thu nMn protease tit nhi~u ngu6n khac nhau nhu titthtfc v~t, tit nt)i tl:lngdt)ng v~t hay tit vi sinh v~t Trong do ngu6n protease

tit vi sinh v~t nha't la tit vi khuffn Bacillus subtilis la huang nghien cUuco nhi~u tri~n vQng vi B.subtilis co kha nang san xua't protease co hol:lttinh

cao va co nhi~u u'u the' hon hh

Trong che' bie'n ThUy san, protease co th~ du<;lcsit d\1ng trong congngM san xua't nuac mAmd~ rut ngAn thai gian che' bie'n ho~c sit d\1ngd~san xua't bt)t dl:lmthuy phan tit ca tl:lp.Ca tl:lPla lol:lica kern gia tri kinhte', tinh rieng tI:liKhanh Hoa, theo s6 li~u th6ng ke cua sd ThUy san, san

lu<;lngkhai thac ca m6i (mt)t lol:li ca tl:lp) chie'm 20% -25% t6ng san lU<;lng

khai thac Ca m6i co co thit khOng san chAcnen gia tri kinh te'tha'p, trong chuang trinh "chi biin cac san phdm co gia tri gia tang" cua Bt) ThUy

san co huang nghien cUu sit d\1ngh<;lp19 cac ngu6n ca tl:lp.Mt)t trong cac

huang "chi biin cac san phllm co gia tri gia tang" tit ca m6i do la sit d\1ng ca m6i d~ san xua't bt)t dl:lmthuy phan Vi v~y, d~ tai "Nghien CIlu qua trlnh thuy phtin protein ca bling enzyme protease ta B.subtilis S5" la

cffn thie't trong lInh vtfc che' bie'n ThUy san

2 Ml}c dich ciia lu~n an

Tham do cac di~u ki~n thich h<;lpd~ khai thac va thu nMn protease tit

canh tru'ang nuoi ca'y vi khuffn B.subtilis S5 Sau do sit d\1ngprotease nay trong san xua't bt)t dl:lmthUy phan tit thit ca m6i thuang (Saurida tumbil)

va thit nghi~m san xua't nuac mAm tit ca com thuang (Stolephorus commersonii).

3 D6i tu(jng va ph~m vi nghien CUll

3.1 D6i tu(jng nghien CUll

B.subtilis 55 la chUng vi khu~n co kha nang san xua't protease voi ho1;tt tinh cao du<Jcphan l~p ttt ttf nhien Ca m6i thuC1ng(5aurida tumbil) va ca cdm thuC1ng(5tolephorus commersonii) du<Jc daub bift t1;tivung bi€n

Khanh Hoa

3.2 Ph~m vi nghien CUll:g6m 3 phh

1) Nghien cUu thu nMn che' ph~m protease ttt canh truC1ngnuoi ca'y vi

khu~n B.subtilis 55 va xac dinh m(}tso'd~c tinh cua enzyme nay.

2) Nghien cUu ung d\mg protease B.subtilis 55 vao san xua't b(}td1;tm thuy phan ttt ca m6i thuC1ng(5aurida tumbil).

3) Nghien CUu qua trlnh thUy phan ca cdm thuC1ng(5tolephorus commersonii) b~ng protease B.subtilis 55 va d~ xua't huang ung d\mg

enzyme nay trong che' bie'n nuoc mifm

4 Phudng phap nghien CUll

Lu~n an sil' d\mg cac phudng phap nghien CUucd ban cua Hoa sinh

hQc co stf h6 tr<Jcua cac 19 thuye't loan hQCd€ phat hi~n ra cac tinh cha't

moi, cac m6i quail M gifi'acac d1;tilu<Jngva ki€m chung cac gia thuye't

5 Cac dong gop mdi v~ mijt khoa hQc

-L~n dh lien nghien cUu m(}t cach hoan chlnh v~ cac d~c tinh cua

qua cua lu~n an gap ph~n lam phong phu them nhfi'ng hi€u bie't v~

protease ttt vi khu~n B.subtilis 55.

- Dff nghien CUllsil'd\mg che' ph~m protease ttt B.subtilis 55 trong thuy

phan thit ca m6i d€ san xua't b(}td1;tmthuy phan Ke't qua nghien CUucualu~n an khi du<Jcap d\mg trong san xua't se gap ph~n vao chudng trlnh

"chi biln cae san phdm co giLltrj gia tang" m(}ttrong b6n chudng trlnh

Ion cua B(}ThUy san

- Ke't qua cua lu~n an la nhfi'ngdftn li~u moi v~ vi~c sil'd\mg protease

B.subtilis 55 d€ rut ngifn thC1igian che' bie'n nuoc mifm Ke't qua nay la cd

sd d€ cac doanh nghi~p san xua't nuoc mifm cai tie'n qui trlnh cong ngh~rut ngifn thC1igian che' bie'n

6 Ke't dIU cua Iu~n an

Lu~n an g6m 156 trang, 88 trang ph\11\1c,14 trang li~t ke 142 tai Ii~utham khao NQi dung lu~n an g6m 3 ch11'dng,trong do co 30 bang va 70d6 thi, hinh anh

Chddng 1 TONG QUAN TAl LI~U1.1 MQt s6 nghien cUu v~ protease

Protease la cac enzyme xuc lac s\f tMy phan lien ke't peptid ( CO

-NH -) Trong cac protease thi nhom protease lieu boa d11'c,1cnghien CUll

sdm va nhi€u hdn ca Tit nam 1950 trd l<;tiday tren the' gWi co hang lo<;tt

protease dQng v~t, th\fc v~t va vi sinh v~t d11'c,1ctach chie't nghien CUll.Trong thai gian g~n day cac nha khoa hQc tren the' gidi t~p trung nghienCUllv€ cac protease vi sinh v~t va dfi d<;ttd11'c,1cnhi€u thanh t\!Uto 1(1nv€nnh v\fc nay Hi~n nay, s6111'c,1ngcac enzyme d11'c,1csan xua't hang namtren the' gWi, d cac n11'dcpMt tri~n cM ye'u la cMu Au, My va Nh~t Ban

VaGkhoang 300.000 ta'n vdi doanh thu tit san xua't enzyme 11'dctinh VaG

khoang 500 tri~u USD Trong do co khoang 600 ta'n protease tinh khie'td11'c,1csan xua't tit vi sinh v~t baa g6m khoang 500 ta'n tit vi khua'n va 100ta'n tit na'm m6c Nhfi'ng n11'dcco cong ngM san xua't va ung d\1ngprotease lien tie'n tren the' gidi la: Dan M<;tch,Nh~t Ban, My, Anh, PMp,

Ha Lan, Trung Qu6c, Duc, Ao Cac n11'dcnay dfi d~u t11'thich dang cho

cong lac nghien CUll,san xua't va ung d\mg protease tit vi sinh v~t Chinh

vi the' nhip dQ san xua't enzyme d qui mo cong nghi~p t<;ticac n11'dcpMt

tri~n hang nam tang vao khoang tit 5%+ 15%.Ngay nay ng11'ai ta co th~san xua't cac enzyme protease c6 dinh tren cac cha't mang khong tan chophep co th~ tai sa d\1ng l<;tienzyme nhi€u Mn Vi v~y ma vi~c ung d\1ngprotease ngay cang gia tang

d Vi~t Nam cling co nhi€u cong trinh cong b6 v€ vi~c nghien CUllsad\1ng protease cM ye'u t~p trung vao cae protease th\fc v~t va dQng v~tcon protease tit vi sinh v~t mdi chi d11'c,1cnghien CUlltrong hdn ch\1cnam

trd l<;tiday Vi v~y dn tie'p t\1Ctang c11'angnghien cUu v€ protease tit vi sinh v~t noi chung va protease tit vi khua'n noi rieng.

'1.2 Gioi thi~u v~ ntioe miim va phtidng phap su' d\mg proteasetrong san xua't ntioe miim

Nuoc miim truy~n th6ng Hike't qua cua qua trlnh thuy phan protein thit

ca duoi tac dQng cua M protease nQi tl;litrong di~u ki~n co mu6i theo coche':

Ciing voi qua trlnh thiiy phan protein thit ca con co hang lol;ltqua trlnhbie'n d6i sinh boa sau sAc do mc dQng cua nhi~t dQ va h~ vi sinh v~t cotrong do ma hlnh thanh mall sAc, huang vi d~c tru'ng cua nuoc mAID.Trong khoang 24 gia d~u tieD, duoi mc dQng cua M protease nQi ti;licua

ca ma chUye'u la cac proteinase serine, proteinase kim 10l;liva proteinaseaspartic mQt ph~n protein thit ca bi thuy phan thanh peptid, polypeptidboa tan trong nuoc b6i (nuoc ca) Sau do protein thit ca, polypeptid vacac peptid du<;lcti;lothanh d tren Il;litie'p t1;1cbi thuy phan ml;lnhme bdicac proteinase kim 10l;litl;lothanh cac axit alliin t1!do, cac peptid ngiin vada: co s1!hlnh thanh huang vi nuoc mAID.Tit giai dol;ln3 + 6 thang duoitac d1;1ngcua cac protease d~c bi~t Ia cac proteinase serine, cac peptid,cac protein, polypeptid con Il;litie'p t1;1cbi thUy phan tl;lothanh cac axitamiD t1!do Khi do chU<;lpda:chin, nuoc mAmnit ra co mall va mlii vi d~etru'ng Ch!t lu<;lngcua nuoe mAm ph1;1thuQe vao 10l;liea, t)1 1~ mu6i sii'd1;1ng,pH, nhi~t dQ, phudng phap ehe' bie'n Trong qua trlnh san xu!t ne'ubie't ph6i h<;lphai boa cae ye'u to'nay thl nuoe mAm se dl;lteh!t lu<;lngcaD.V~ nguyen tAe thl t!t ea cae loai ea bi€n d~u co th€ sii'd1;1ngd€ san

K 'A J Nh d~ 0 th~. K

xuat nuve mam ltng e e e san xuat u<;lenuve mam dm ngon, Qdl;lmcaD va mang Il;lihi~u qua kinh te' thl e~n chQn ca co thit m~m, hamlU<;lngprotein caD, de thuy phan, ti;lora so' lu<;lngnuoe miim nhi~u voihuang vi thdm ngon Cae 10l;liea thuang dlipg d€ san xu!t nuoe mAm la:

ea com, ea n1;1e,ea trieh, ea li~t, ea bo, ca m6i trong do ehu ye'u la eacom va ea n1;1e

Nhln chung cae phuong phap ehe' bie'n nuoe miim truy~n th6ng d nuoc

ta con tho so, thai gian san xu!t dai tit 6+ 12 thang D€ nit ngiin thai giansan xu!t nuoe miim da:co nhi~u cong trlnh nghien CUllnh~m tang euang

ho~t dQngciia h~ protease co siintrongca va Mvi sinh v~t tl)'nhien bAngcach tie'p nhi~t, cho mu6i nhi~u liin, nao daD Nhu'ng thai gian che' bie'nnudc mAm rhea cac phuong phap nay vh con dai Vi v~y da: co mQt so'cong trinh nghien cUu sit dl,mg protease b6 sung them tit bell ngoai dStang cuang kha nang thuy phan protein ca thanh axit amino Phuong phapnay co ttu diSm la thai gian che' bie'n ngAn, luQng mAm c6t nhi~u honnhung san phifm co mui vi va mall sAc kern nudc mAm san xua't rheaphuong phap truy~n th6ng DS khAc phl,lchi~n tuQng nay nguai ta co thScho ch~y qua chuQp t6t dS la'y huang Vi v~y, vi~c nghien cUu san xua'tnudc mAm rhea phuong phap sit dl,lng protease con dn thie't phai duQctie'p tl,lCnghien cUu.

1.3 GiOi thi~o v~ b~t d~m va phu'dng phap su' dvng protease d~

san xoa't b~t d~m thuy phan tit ca

Trong qua trlnh khai thac danh bAt tbUy san d nudc ta, luQng ca t~pkern gia tri kinh te'thuang chie'm ty tr<;}figIOn.Vi v~y, trong chuang trlnh

"chi biin cac san pMm co gid tri gia tang" cua BQ TbUy san co phiin

nghien CUusit dl,lng hQp 19 cac ngu6n ca t~p, mQt trong cac huang che'bie'n do la san xua't bQt d~m tbUy phan Thl)'ccha't cua qua trinh san xua'tbQt d~m ca b~ng phuong phap sit dl,lng protease la qua trinh tbUy phanprotein ca t~o ra cac peptid va axit amin dudi tac dQng cua h~ proteasenQi t~i va protease b6 sung tit bell ngoai Trong qua trinh thuy phan thit

ca b~ng protease co nhi~u ye'u to' anh hudng tdi t6c dQ thuy phan nhu: tyl~ enzyme, nhi~t dQ, pH, ty l~ nudc b6 sung Nen yell ch d~t ra la phaitim ra che'dQ thuy phan thich hQpdS san xua't ra bQtd~m ca d~t yell duoChudng 2 VOl TU(1NGvA PHUONGPHAp NGHIEN CUD2.1 VO'itu'Q'ngnghien CUll

2.1.1 Ngo6n tho nh~n enzyme protease

B.subtilis S5 Ia chung vi khuifn co kha nang san xua't protease vdi ho~t

Sinh hQc Nhi~t ddi TP H6 Chi Minh ChUng B.subtilis S5 nay duQc sit

dl,lng dS nghien cUu san xua't protease b~ng phuong phap nuoi ca'y banrAn Sau khi ditng qua trinh nuoi, thu canh trltang chua protease, sa'y kho,xay min va sit dl,lngdS tach chie't protease

2.1.2 Nguy~n li~u ea d~ san xudt nu'oe miim va bQt d~m

- Ca m6i nguyen li~u: Ca m6i thu'ang (hlnh 2.1) du'<;ledaub bAt t~ivilng bi~n Khanh Hoa, ea tu'di du'<;leb,ta ehQn theo lieu ehu[{nTCVN 3250

- 88 Thit ea m6i thu'ang du'<;lesii'd\1nglam nguyen li~u d~ nghien eUusan

xua't bQtd~m thuy pMn bAngprotease B.subtilis S5.

mnh 2.1 Ca mol thu'CIng(Saurida tumbil)

(Sau day gQitAt "ea m6i thu'ang" la "ea m6i ")

- Ca edm nguyen li~u: ea edm thu'ang (hlnh 2.2) lam nguyen li~u san

xua't nu'de mAmla lo~i ea n6i co mila V\1tir thang 2 + 5 va tir thang 7 + 10hang Dam San lu'<;lngea edm khai iliac (j Nha Trang vao khoang 12.000-

15.000 ta'nInam

II'mh 2.2 Ca cdm thu'CIng(Stolephorus commersonii)

(Sau day gQitAt "ea edm thu'ang" la "ea edm").

2.2 Phu'dng phap nghi~n CUll

- Dinh lu'<;lngprotein boa tan theo phu'dng phap Lowry

- Xae dinh ham lu'<;lngnu'de, lipid, nitd t6ng so' (NTs), mtd NH3, mtdaxil amiD, tro, theo TCVN 3700, 3703, 3706, 3708, 5105- 90.

- Xae dinh thanh ph~n va ham lu'<;lngaxil amiD bAng phu'dng phap sAc

ky khi teen may GC-17A SIllMADZU vdi dQnh~y 10-9

- Xae dinh ham lu'<;lngkim lo~i bAng phu'dng phap quang ph6 ha'p th\1nguyen tii'

-Danh gia earn quaD theo TCVN 3250-88

- Tinh s~eh enzyme theo phu'dng phap sAcky lQegel sephadex G-75

2.3 Phuong phap xii' Iy s61i~u: Xii Iy s6li~u nghien cUurhea phuong

phap th6ng ke sinh hQc M6i thi nghi~m d~u tie'n hanh 3 Ian, m6i I&n3mi1uva ke't qua la trung binh d)ng coa cac I&nthi nghi~m s6 li~u duQc

xii Iy d~ ve d6 thi tren ph&nm~m Excel vdi h~ s6 tuong quail R ?:0,95.

Chu'o'ng3 KET QUA NGHIEN CUU vA THAO LU!N

3.1 Nghien CUllsan xua't protease tit B.subtilis 55

3.1.1 Phuong phap giii' ~m thich hQ'p

Thii nghi~m san xua't protease ttt B.subtilis S5 rhea phuong phap nuoi ea'y ban rAn trong di~u ki~n co thong gio va giG'a"'mrhea 3 phuong phap

nhu san: phuong phap 1: b~ m~t khay nuoi khOng pho vai a"'m;phuongphap 2: b~ m~t cae khay nuoi duQc phO vai a"'m;phu'ong phap 3: b~ m~tkhay nuoi pho vai a"'mva san 4 giOnuoi phon hoi nude qua may th6i khivao phong nuoi d~ t<.10de>a"'m.San 37 gio nuoi, tho canh tru'ong chuaenzyme va xae dinh ho<.1tde>protease Ke't qua th~ hi~n d bang 3.1.Bang 3.1 Anh hudng cua phuong phap giii' ~m toi ho~t dQ protease

B.subtilis 55 tho duQ'ctrong canh truong

Phu'ong phap

giG' a"'m

Ho<.1tde>protease(UI/g canhtru'ong)

Tr<.1ngthai eoa eanh tru'ong

B~ m~t eanh tru'ong bi thO, nUt, vi

khua"'nmQe trAng phia du'di con dphia tren thl thong mQc

Tu'ong tl! nhu' trenB~ m~t canh tru'ong thOng bi thO,kh6i canh tru'ong nong, a"'m,m~m,

vi khua"'n mQc trAng cii tren vadu'di

3.1.2 Xac dinh kha Dang san xua't protease cua B.subtilis 55 trong

di~u ki~n co thong gio va khOng thong gio

Tie'n hflOh san xua't protease tif B.subtilis S5 theo 2 phlidng phap:

phlidng phap 1: nuoi ca'y trong di~u ki~n khOng thong gio va phlidng phap2: nuoi cffy trong di~u ki~n co thOng gio Sau 37 gio, tho canh trliongchua enzyme va xac dinh ho<:ltdQprotease Ke't qua th~ hi~n d bang 3.2.Bang 3.2 Anh hlfdng cua thong gio tOi ho~t dQ protease tho dlf(jc

Ke't qua nghien cUud bang 3.2 cho thffy phlidng phap nuoi ca'y ban dn

co thong gio la thich h<;fpcho vi~c san xufft protease tit B.subtilis S5 3.1.3 Xac dinh thai gian ke't thuc qua trinh nuoi B.subtilis 55 Tie'n hanh san xufft protease tit B.subtilis S5 theo cac di~u ki~n da

chQn, sau 17; 21; 25; 53 gio, tho canh trUong nuoi, sffy kho va xac dinhho<:ltdQenzyme Ke't qua th~ hi~n d bang 3.3

Bang 3.3 Anh hlfdng cua thai gian de'n ho~t dQ protease tho dlf(jc

Ke't qua nghien cUu cho tha'y co th~ difng qua trlnh nuoi d thai di~m

41 gio d~ co th~ tho dli<;fccanh trUong co ho<:ltdQprotease cao

3.1.4 D~ xua't quy trinh san xua't protease tit B.subtilis 85

Tif cac ke't qua nghien cUu d teen d~ xufft quy trlnh nuoi ban din san

xufft protease tif B.subtilis S5 nhli sau:

(UI/g canh trUong)

de'n 55°C, vi khuffn phat tri6n kern,canh trlfong roi rc

Wi 45°C, vi khuffn rnQc triing d teen

va dlfdi, canh trlfong cleo dinh

(gi<'1)

Hot d(> 5,0 8,0 12,5 17,5 23,5 31,5 33,2 33,1 32,0 29,5 protease (DUg)

Nuoc 80% so voi nguyen lieu BOt blip + kh6 d~u I,!c + cam

ffinh 3.1 Sd d6 quy trlnh san xua't protease tt'i B.subtilis 85

* Thuye"t minh quy trlnh

+ Nhan gi6ng B.subtilis 85: gi6ng B.subtilis 85 phan l~p tu tt! nhien

va du'<;1ebaa quan (j 5°C tren moi tru'ong giG'gi6ng co thanh ph~n: agar:2%, eao thit: 0,5%, peptone: 0,5%, NaCl: 0,25%

Chuy~n gi6ng B.subtilis S5 vao moi tru'ong ho<;ttboa co thanh phh:

agar: 2%, eao thit: 0,5%, peptone: 0,5%, NaCl: 0,25%, tinh bQt: 1% vanu'de ehie't gia d~u xanh (200glHt) Sau khi ho<;ttboa 48 gio, c1y gi6ng

sang m6i tnlong nhiln gi6ng e6 thanh phftn: djeh ehie't earn: 20%, djehthuy philo kh6 dftu I~e: 10%, NaCl: 0,36%, MgSO4: 0,05%, CaCO3: 0,6%,

pH =7 Truac khi effy gi6ng, hffp va khi't trung m6i truong nhiln gi6ngb~ng hdi nude bao hoa (j ap sufft latm trong thai gian 30 phut Qua tdnhnhiln gi6ng tie'n hanh tren may Hie vdi t6e dQ 200 vong/phut, sau 24 gioki€m ITa gi6ng b~ng each Iffy gi6ng dang Hie effy tren m6i truong ho~thoa sau 24 gio thffy gi6ng mQe t6t, d~u kh6ng e6 khuffn l~e I~ Ia du<;le

Sau khi nhan gi6ng Iy tam tho B.subtilis 55 dung d€ san xufft enzyme + San xua't protease tit' B.subtilis SS

M6i truong nu6i B.subtilis 55 san xufft protease (152,19kg/me) e6

thanh phftn nhu sau: bQt belp xay mill: 70kg, earn g~o: 30kg, kh6 dh l~e(45% protein): 50kg, NaCl: 540g, CaCO3: 900g, DAP: 750g, pH = 7.

trQnvdi nguyen li~u sau d6 hffp(j 100°C trang 2gio, lam nguQi de'n nhi~t

dQ 37°C va effy gi6ng theo ty l~ 5% so vdi nguyen li~u, sau d6 philn d~u

ra cae khay m6i khay 12kg

Trong qua trlnh san xufft b~ m~t cae khay nu6i du<;lephil vai ffm vasau 4 gio nu6i belt dfiu phon hdi nude d€ t~o dQ ffm eho phong nu6i vaokhoang 90+ 100% Nu6i trong di~u ki~n e6 th6ng gi6 vdi m\le dich d€du<3iCO2, giai nhi~t va eung effp oxy eho vi khuffn

Sau 41 gi<'1nu6i (j nhi~t dQ phong tho eanh tru'<'1ngehua enzyme, sffykh6 (j nhi~t dQ50°C, xay mill va d6ng vao trong cae tui PE d€ baa qUaD.3.2 Nghien cUu tach chie't va mQt s6 d~c tinh cua protease

3.2.1 Xac djnh dung djch chie't rut protease tit' B.subtilis SS

Protease B.subtilis 55 du<;leehie't rut ra kh6i bQt eanh truong ehua

enzyme bhg cae dung djeh: nude efft, dung dieh d~m Britton pH 6, dungdieh d~m phosphat pH 6 va dung dieh mu6i sinh 1:9.Sau khi ehie't rut lytam tho djeh ehie't (DC) enzyme va xae dinh ho~t dQ protease, ke't quath€ hi~n (j hinh 3.2

.Nudc dlt f)~m britton GI f)~m phosphat GI Mu6i sinh 19 I Dung djch chi"t enzyme

Hinh 3.2 AOOhuang ena dung dieh ehie't rut de'n ho~t dQ proteaseTli ke't qua hlnh 3.2 cho tha'y nudc ca't chinh la dung moi thich hQp cho

vi~c chie't rut protease tli B.subtilis S5.

3.2.2 Xae djnh tae nhdn ke't tna protease B.subtilis SS

Tie'n hanh ke't tua protease B.subtilis S5 ra khai DC enzyme b~ng

aceton, ethanol va sulphat amon d cling n6ng de>70% Sau do ly tam thuche' ph£m enzyme (CPE), boa tan trong cling me>tth~ tich nudc ca't va xacdinh ho~t de>protease Ke't qua nghien cUuth~ hi~n d hlnh 3.3

Tac nhan k"t IDa

Hinh 3.3 AOOhuang ena tae nhdn ke't tna tOi ho~t dQ protease CPETli hlnh 3.3 cho tha'y ethanol chinh la tac nhan thich hQp cho vi~c ke'ttua d~ thu protease CPE

E>~chQn duQc n6ng de>tac nhan ke't tua thich hQp tie'n hanh ke't tua

protease B.subtilis S5 bhg ethanol d cac n6ng de>khac nhau: 60%,65%, , 80% ke't qua duQCth~ hi~n d hlnh 3.4

Ke't qua a hinh 3.4 cho tha'y ethanol an6ng dO 75% la thich hQp chovi~c ke't tua thu protease CPE.

3.2.3 Anh hu'dng cua pH de'n ho~t dQ protease B.subtilis SS

Ke't qua nghien CUuduQc th~ hi~n a hinh 3.5

L :~L li~0 2 ~ 3 U/-4 U 5 U : :6 ~ ~7 U 8 U 9 ~

Hinh 3.5 Anh hu'dng cua pH de'n ho~t dQ protease B.subtilis SS

Ke't qua nghien cUu a hinh 3.5 cho tha'y khoang pH thich hQp cho ho<.tt

dOprotease B.subtilis 55 la 5,5 - 7 va pH t6i thich la 6.

3.2.4 Anh hu'dng cua nhi~t dQ de'n ho~t dQ protease B.subtilis SS

3.2.4.1 Xac dinh nhi~t dQthich hf/p cho ho~t dQ enzyme

Ke't qua nghien cUu anh huang cua nhi~t dO de'n ho<.ttdO protease DC

va CPE duQc th~ hi~n a hlnh 3.6

Tit hinh 3.6 cho tha'y ca protease DC va CPE d€u co nhi~t dOtmch

hQp la 55°C

3.2.4.2 Xac dinh dQ b~n nhi~t cua protease B.subtilis SS

cac khoang thC1igian 0; 5; 10; ;35 phUt 5au do nhanh chong lam l<.tnhvaxac dinh ho<.ttdOprotease Ke't qua th~ hi~n a hinh 3.7

IDnh 3.7 DQ b~n nhi~t cua protease B.subtilis S5

Ke't qua hlnh 3.7 cho tha'y protease B.subtilis 55 kern b~n voi nhi~t so

voi cac protease tu tht!c v~t va b~n hdn protease tu na'm m6c

3.2.5 Aoo hudng cua n6ng dQmu6i an t8i ho~t dQprotease

Ke't qua nghien CUllanh hudng cua NaCl toi hol;ltdQ protease CPEduejc th~ hi~n d hlnh 3.8

trong che' bie'n thuy san nen sa dl;mgtrong cac di~u ki~n cang co it mu6i

an cang t6t ho~c ne'u phiii b6 sung them mu6i an vao h6n hejp thuy phan

co protease B.subtilis 55 thl nen cho mu6i nhi~u l~n.

3.2.6 Anh hudng cua cae ion kim lo~i hoa trf 2 va mQt so' cha't d~c

hi~u OOomtm ho~t dQ protease B.subtilis S5

Tie'n hanh nghien CUllanh hu'dng cua cac ion kim 10l;liboa tri 2 va mQts6 cha't d~c hi~u nh6m thu'ong co vai tro quan trQng d6i voi hol;lt dQprotease Ke't qua du'ejCth~ hi~n d hlnh 3.9

0