(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc dịch tả lợn trên tế bào bằng công nghệ microcarrier tại công ty hanvet

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẶNG THÙY CHINH NGHIÊN CỨU SẢN SUẤT VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC DỊCH TẢ LỢN TRÊN TẾ BÀO BẰNG CÔNG NGHỆ MICROCARRIER TẠI CÔNG TY HANVET Ngành: Mã số: Người hướng dẫn khoa học: Thú y 64 01 01 PGS.TS Nguyễn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2020 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2020 Tác giả luận văn Đặng Thùy Chinh i TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Cho đến tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Nhân dịp xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới thầy, giáo Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành đến thầy cô hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên môn Vi sinh vật truyền nhiễm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian nghiên cứu hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị em bạn bè đồng nghiệp công ty TNHH Dược Hanvet tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Cuối xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh, chị em người động viên, giúp đỡ tơi để tơi hồn thành tốt luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2020 Tác giả luận văn Đặng Thùy Chinh ii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận văn x Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình dịch bệnh giới nước 2.1.1 Tình hình dịch bệnh giới 2.1.2 Tình hình dịch bệnh Việt Nam 2.2 Bệnh dịch tả lợn 2.2.1 Vi rút dịch tả lợn 2.2.2 Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh DTL 2.2.3 Triệu chứng bệnh tích bệnh DTL 11 2.3 Tổng quan sản xuất vắc xin 14 2.3.1 Lịch sử hình thành phát triển vắc xin 14 2.3.2 Sơ lược loại vắc xin giới 14 2.3.3 Một số loại vắc xin DTL 16 2.4 Tổng quan nuôi cấy tế bào 18 2.4.1 Một số đặc điểm tế bào động vật 18 2.4.2 Thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy tế bào 18 2.4.3 Điều kiện nuôi cấy tế bào 20 2.4.4 Sự tạp nhiễm cách hạn chế 20 2.4.5 Sự sinh trưởng tế bào động vật nuôi cấy 20 2.5 Hệ thống Microcarrier 21 iii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 2.5.1 Lý lựa chọn phương pháp nuôi cấy Microcarrier 21 2.5.2 Sự phát triển hạt chất mang 24 2.5.3 Một số ứng dụng Microcarrier 25 Phần Nội dung - vật liệu - phương pháp nghiên cứu 28 3.1 Nội dung nghiên cứu 28 3.1.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình ni cấy tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 28 3.1.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình gây nhiễm Vi rút tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 28 3.1.3 Đánh giá số tiêu vắc xin DTL sau thu hoạch 28 3.2 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 28 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu 28 3.3 Địa điểm nghiên cứu 30 3.4 Thời gian nghiên cứu 30 3.5 Phương pháp nghiên cứu 30 3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 31 3.5.2 Phương pháp gây nhiễm 36 3.5.3 Phương pháp đánh giá số tiêu vắc xin DTL sau đông khô 40 3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu 43 Phần Kết thảo luận 44 4.1 Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 44 4.1.1 Nghiên cứu tốc độ khuấy lưu lượng khí 44 4.1.2 Nghiên cứu số lượng đầu vào tế bào 49 4.1.3 Xác định mơi trường ni cấy pH thích hợp cho tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 51 4.1.4 Xác định đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 55 4.2 Nghiên cứu quy trình gây nhiễm vi rút dịch tả lợn Microcarrier 57 4.2.1 Xác định mơi trường trì sau gây nhiễm vi rút pH mơi trường trì 57 4.2.2 Xác định liều gây nhiễm (MOI) cho vi rút DTL 59 iv TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 4.2.3 Xác định đường cong sinh trưởng vi rút DTL 60 4.3 Đánh giá số tiêu vắc xin dịch tả lợn sau đông khô 62 4.3.1 Tính an tồn vắc xin lợn 62 4.3.2 Xác định tính sinh miễn dịch vắc xin DTL 63 Phần Kết luận kiến nghị 68 5.1 Kết luận 68 5.2 Kiến nghị 68 Tài liệu tham khảo 69 v TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CPE Cyto Pathogenic Effect CSF Classical Swine Fever CSFV Classical Swine Fever Vi rút DMEM Dulbecco’s Modified MEM Medium DO Dissolved Oxygen DTL Dịch Tả Lợn EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FBS Fetal Bovine Serum KS Kháng sinh LH Lactalbumin Hydrolysate M199 Medium 199 MEM Minimum essential medium MOI Multiplicity of infection NSSS Năng suất sinh sản PBS Phosphate Buffered Saline pH Hydrogen power PK 15 Pig Kidney 15 TB Tế bào TCID 50 50% Tisue culture infective dose TE Trypsin – EDTA vi TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Kiểm tra độc lực vi rút DTL Bảng 2.2 Một số ứng dụng Microcarrier ngành sản xuất vắc xin 26 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp 31 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định tốc độ khuấy thích hợp 31 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm xác định lưu lượng khí bình ni 32 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm xác định lượng tế bào tối ưu cho nuôi cấy 32 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy 33 Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm xác định pH tối ưu cho nuôi cấy 33 Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm xác định mơi trường nuôi cấy 36 Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm xác định pH tối ưu cho nuôi cấy 37 Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm xác định liều gây nhiễm thích hợp 37 Bảng 3.10 Bố trí thí nghiệm kiểm tra tính an tồn vắc xin DTL lợn 40 Bảng 3.11 Bố trí thí nghiệm kiểm tra tính sinh miễn dịch vắc xin DTL 40 Bảng 4.1 Kết theo dõi điều chỉnh tốc độ khuấy 44 Bảng 4.2 Mức độ bám tế bào PK 15 vào hạt Cytodex giá trị DO khác 46 Bảng 4.3 Kết theo dõi suất sinh sản tế bào sau 48h nuôi cấy 47 Bảng 4.4 Kết điều chỉnh lưu lượng khí cấp vào mơi trường nuôi 48 Bảng 4.5 Kết xác định số lượng tế bào PK 15 thích hợp cho nuôi cấy 49 Bảng 4.6 Khả bám phát triển tế bào PK 15 loại môi trường 52 Bảng 4.7 Bảng suất tế bào PK 15 loại môi trường thời điểm 72h nuôi cấy 52 Bảng 4.8 Kết xác định tỉ lệ hạt có tế bào bám sau nuôi cấy 24h với điều kiện pH khác 53 Bảng 4.9 Kết xác định điều kiện pH thích hợp cho ni cấy tế bào PK 15 thời điểm 72h nuôi cấy 54 Bảng 4.10 Kết số lượng tế bào PK 15 theo thời gian nuôi cấy Microcarrier 55 Bảng 4.11 Kết xác định hiệu giá vi rút DTL loại môi trường nhiễm 57 Bảng 4.12 Kết hiệu giá vi rút Dịch tả lợn điều kiện pH khác 58 Bảng 4.13 Kết hiệu giá vi rút liều gây nhiễm (MOI) 59 vii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Bảng 4.14 Kết hiệu giá vi rút DTL qua thời điểm thu hoạch 60 Bảng 4.15 Biểu lâm sàng lợn sau tiêm vắc xin DTL nhược độc 63 Bảng 4.16 Biến động kháng thể lợn tiêm vi rút DTL nhược độc xác định ELISA 63 Bảng 4.17 Hiệu giá kháng thể trung hòa lợn tiêm vắc xin DTL nhược độc 64 viii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc vi rút DTL Hình 2.2 Hình ảnh trình tế bào tách biệt với sản phẩm tiết 22 Hình 3.1 Hệ thống Bioreactor – Bioflo 320 30 Hình 3.2 Mơ hình nhân số lượng tế bào cho nuôi cấy Microcarrier 34 Hình 3.3 Buồng đếm tế bào 35 Hình 4.1 (1) Bình ni có bọt, (2) bình ni cấy khơng có bọt 45 Hình 4.2 Lấy mẫu theo dõi suất nhân tế bào PK 15 46 Hình 4.3 Năng suất sinh sản tế bào giá trị OD khác 47 Hình 4.4 Hệ thống khí vào hệ thống Microcarrier 49 Hình 4.5 Năng suất sinh sản tế bào PK 15 theo mật độ tế bào đầu vào khác 50 Hình 4.6 Hình ảnh tế bào PK 15 Microcarrier 51 Hình 4.7 Năng suất sinh sản tế bào mơi trường ni 53 Hình 4.8 Năng suất sinh sản tế bào nuôi cấy pH khác 54 Hình 4.9 Đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 55 Hình 4.10 Đồ thị thể hiệu giá trung bình (3 lơ) loại mơi trường trì 58 Hình 4.11 Hiệu giá vi rút theo liều gây nhiễm khác 59 Hình 4.12 Đường cong sinh trưởng vi rút DTL 61 Hình 4.13 Hình ảnh nhuộm IFA vi rút DTL 61 Hình 4.14 So sánh hiệu suất ni cấy vi rút hệ thống Microcarrier Tflask 62 Hình 4.15 Đồ thị biến động kháng thể lợn tiêm vi rút DTL 64 Hình 4.16 Biến động kháng thể trung hịa lợn sau tiêm vắc xin DTL tế bào 65 Hình 4.17 Bệnh tích lợn công cường độc 67 ix TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com chiếm nhiều diện tích T-flask Chính vậy, tơi lựa chọn sản suất tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier 4.2 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GÂY NHIỄM VI RÚT DỊCH TẢ LỢN TRÊN MICROCARRIER 4.2.1 Xác định môi trường trì sau gây nhiễm vi rút pH mơi trường trì 4.2.1.1 Xác định mơi trường trì sau gây nhiễm vi rút Mơi trường trì tế bào sau nhiễm môi trường nuôi tế bào có khơng có huyết động vật Mơi trường trì có tác dụng trì sinh trưởng ổn định tế bào tạo điều kiện tối ưu cho trình xâm nhập nhân lên vi rút Để tìm loại mơi trường trì tế bào trình gây nhiễm vi rút đạt hiệu giá vi rút cao thu hoạch Tiến hành thử nghiệm công thức môi trường: MEM, DMEM, M119 LH Tuy nhiên, trì sinh trưởng tế bào bị ảnh hưởng hàm lượng huyết pH môi trường Tất công thức môi trường bổ sung 1% huyết pH=7,2±0,1 theo nghiên cứu hệ thống chai Tflask Thí nghiệm thực lần với điều kiện nuôi tế bào, phương pháp gây nhiễm, thông số tối ưu giống Kết theo dõi khả gây bệnh tích tế bào thể bảng 4.11 Bảng 4.11 Kết xác định hiệu giá vi rút DTL loại môi trường nhiễm Hiệu giá (TCID 50 /ml) LH M199 MEM DMEM Lô 106,1-106,3 106,3-106,5 106,9-107,1 106,5-106,7 Lô 106,3-106,3 106,1-106,3 106,7-106,9 106,3-106,5 Lô 106,1-106,1 106,3-106,5 106,7-106,9 106,3-106,5 TB 106,2±0,11 106,33±0,13 106,87±0,13 106,47±0,13 Từ bảng 4.11 ta có đồ thị hình 4.10 57 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hình 4.10 Đồ thị thể hiệu giá trung bình (3 lơ) loại mơi trường trì Nhìn vào kết ta thấy: Hiệu giá trung bình vi rút dịch tả lợn ni cấy loại môi trường cho hiệu giá vi rút chênh lệch không nhiều Tuy nhiên, môi trường MEM cho hiệu giá trung bình cao lơ, trung bình lơ đạt 106,87±0,13 TCID 50 /ml Mơi trường LH hiệu giá trung bình lơ đạt 106,2±0,11TCID 50 /ml, mơi trường M199 trung bình đạt 106,33±0,13TCID 50 /ml, Mơi trường DMEM trung bình đạt 106,47±0,13TCID 50 /ml Sử dụng phần mềm Minitab 16 (ANOVA), P< 0,005 Như vậy, lựa chọn môi trường MEM 1% FBS có bổ sung 1% kháng sinh 1% Hepes làm nuôi cấy để tiếp tục tiến hành thử nghiệm vi rút dịch tả lợn 4.2.1.2 Xác định pH mơi trường trì sau gây nhiễm vi rút Sau xác định mơi trường trì cho ni cấy vi rút DTL tiến hành xác định pH tối ưu để nuôi vi rút đạt hiệu cao Tơi tiến hành thí nghiệm với pH = 7,0±0,1; pH= 7,2±0,1; pH= 7,4±0,1 Kết trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Kết hiệu giá vi rút Dịch tả lợn điều kiện pH khác Hiệu giá (TCID 50 /ml) pH = 7,0±0,1 pH = 7,2±0,1 pH= 7,4±0,1 Lô 105,9-106,1 106,9-107,1 106,3-106,5 Lô 105,7-105,9 106,7-106,9 106,1-106,3 Lô 105,9-105,9 106,9-106,9 106,3-106,3 Trung bình 105,9±0,12 106,9±0,12 106,27±0,12 58 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Ở điều kiện pH môi trường nuôi khác thu nguyên dịch vi rút với hiệu giá vi rút khác Tuy nhiên lơ thí nghiệm cho kết điều kiện mơi trường ni có pH = 7,2±0,1 cho hiệu giá(106.9±0,12TCID50/ml)cao hẳn môi trường nuôi pH = 7,0±0,1; pH = 7,4±0,1 Sử dụng phần mềm Minitab 16 (ANOVA), P< 0,005 nên lựa chọn pH= 7,2±0,1 để nuôi vi rút DTL 4.2.2 Xác định liều gây nhiễm (MOI) cho vi rút DTL Để xác định liều gây nhiễm vi rút thích hợp tơi tiến hành thí nghiệm với liều MOI khác Kết theo dõi thí nghiệm trình bày bảng 4.13 Bảng 4.13 Kết hiệu giá vi rút liều gây nhiễm (MOI) Thời gian Hiệu giá vi rút (log 10 TCID 50 /ml) gây nhiễm vi rút (giờ) 0,01 0,005 0,001 0,0005 48h 6,5 6,1 4,7 4,1 54h 5,9 5,7 5,5 4,8 72h 5,5 5,3 7,1 6,3 96h 4,9 5,1 6,5 6,7 Từ bảng 4.13 tiến hành xây dựng đồ thị hình 4.11 Hình 4.11 Hiệu giá vi rút theo liều gây nhiễm khác 59 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Ở liều gây nhiễm 0,01 sau 48 gây nhiễm hiệu giá vi rút đạt cao nhất, trung bình 106,5 TCID50/ml sau 54 gây nhiễm vi rút hiệu giá bắt đầu giảm, theo dõi đến 96 sau nhiễm hiệu giá vi rút 104,9 TCID50/ml Ở liều gây nhiễm 0,005 sau 48 gây nhiễm hiệu giá vi rút đạt cao nhất, trung bình 106,1 TCID50/ml sau 54 gây nhiễm vi rút hiệu giá bắt đầu giảm, theo dõi đến 96 sau nhiễm hiệu giá vi rút 105,1 TCID50/ml Ở liều gây nhiễm 0,001 hiệu giá vi rút tăng dần theo thời gian gây nhiễm, hiệu giá đạt cao sau 72 gây nhiễm (107,1 TCID50/ml), sau 96 nuôi nhiễm hiệu giá vi rút bắt đầu giảm dần Ở liều nhân nhiễm 0,0005 liều nhân nhiễm thấp, mức độ thể CPE thấp nên hiệu giá vi rút đạt cao sau 96 gây nhiễm (106,7 TCID50/ml) Sử dụng phần mềm minitab 16 (ANOVA), P< 0,005 nên sử dụng liều gây nhiễm 0,001 vi rút đạt hiệu giá cao thời điểm 72h thu hoạch 4.2.3 Xác định đường cong sinh trưởng vi rút DTL Do vi rút khơng gây bệnh tích tế bào, khơng thể quan sát bệnh tích kính hiển vi thơng thường Do để xác định xác thời điểm thu hoạch vi rút ưu, tiến hành lấy mẫu thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 80h, 96h,108h, 120h sau chuẩn độ hiệu giá xác định có mặt vi rút DTL phản ứng IFA Kết theo dõi thí nghiệm trình bày bảng 4.14 Bảng 4.14 Kết hiệu giá vi rút DTL qua thời điểm thu hoạch Thời điểm thu hoạch vi rút (giờ) Lần Hiệu Lần giá vi Lần rút TB 24 36 48 60 72 84 96 108 120 104,5 104,7 105,9 106,5 107,1 107.3 106,5 105,3 104,5 104,3 104,9 105,7 106,3 107.3 107,1 106,7 105,5 104,7 104,1 104,5 105,7 106,7 107,3 107,1 106,5 105,3 104,5 104,23±0,2 104,7±0,2 105,77±0,1 106,5±0,2 107,17±0,2 107,13±0,2 106,57±0,2 105,37±0,1 104,57±0,1 Từ bảng số liệu xây dựng đường cong sinh trưởng giống vi rút DTL hình 4.12 60 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hình 4.12 Đường cong sinh trưởng vi rút DTL Qua bảng số liệu đồ thị sinh trưởng, phát triển vi rút DTL cho thấy: Sau gây nhiễm 24 vi rút bắt đầu qúa trình sinh trưởng, hàm lượng vi rút phát triển tăng dần theo thời gian nhiễm đạt cao vào khoảng 72 – 84 sau gây nhiễm (107.13±0,2TCID 50 /ml.) Sau thời điểm 96 giờ, hiệu giá vi rút giảm nhanh chóng Đến thời điểm 120 sau gây nhiễm hiệu giá vi rút 104,57±0,1 TCID 50 /ml Từ chúng tơi rút kết luận: thời điểm thu hoạch vi rút tốt 72 sau gây nhiễm Tại thời điểm hàm lượng vi rút đạt cao hiệu giá vi rút ổn định Sau hình ảnh bệnh tích vi rút DTL tế bào PK 15 nhuộm phản ứng IFA: Hình 4.13 Hình ảnh nhuộm IFA vi rút DTL ( a.P/ư (+): có mặt vi rút DTL;b P/ư (-): Khơng có mặt VR DTL) 61 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Sau chốt thơng số cho quy trình thu hoạch vi rút hệ thống Microcarrier Tôi tiến hành so sánh với hiệu giá vi rút thu hệ thống Microcarrier với hệ thống T-flask công ty áp dụng sản xuất trước Kết thể qua đồ thị sau: Hình 4.14 So sánh hiệu suất ni cấy vi rút hệ thống Microcarrier T- flask Nhìn vào hình 4.14 ta nhận thấy hiệu giá vi rút DTL thu sản suất công nghệ Microcarrier cao thu thời điểm 72 107.17 TCID 50 /ml hiệu giá vi rút cào nhật nuôi cấy Tflask thu thời điểm 96h sau gây nhiễm 106.3 TCID 50 /ml Như hiệu giá vi rút Dịch tả lợn nuôi cấy Microcarrier cao T-flask gấp 7,4 lần Mặt khác, sử dụng công nghệ Microcarrier giảm thiểu nhận lực làm việc, giảm thiểu tạp trùng, hạn chế thao tác, hệ thống gọn không cồng kềnh, khơng tốn diện tích Tflask Chính vậy, lựa chọn sản suất vi rút DTL hệ thống Microcarrier 4.3 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU VẮC XIN DỊCH TẢ LỢN SAU ĐƠNG KHƠ 4.3.1 Tính an tồn vắc xin lợn Tính an tồn vắc xin DTL nhược độc đánh gia thơng qua thí nghiệm mô tả phần phương pháp nghiên cứu Kết thu sau: 62 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Bảng 4.15 Biểu lâm sàng lợn sau tiêm vắc xin DTL nhược độc Số lợn có phản ứng liều tiêm 10 liều 20 liều 30 liều Đối chứng Phản ứng mẫn, sốc phản vệ 0/5 0/5 0/5 0/5 Phản ứng vị trí tiêm 0/5 0/5 0/5 0/5 Giảm ăn, bỏ ăn 0/5 0/5 0/5 0/5 Ủ rũ, mệt mỏi 0/5 0/5 0/5 0/5 Tiêu chảy 0/5 0/5 0/5 0/5 Các phản ứng khác 0/5 0/5 0/5 0/5 Chỉ tiêu theo dõi Qua kết kiểm tra an toàn vắc xin Dịch tả lợn sản xuất hệ thơng Bioreactor cho thấy vắc xin có tính an toàn cao, tiêm cho lợn với liều gấp 30 lần liều sử dụng lợn khỏe mạnh bình thương Kết hồn tồn dễ hiểu chủng vi rút dùng để thích nghi tế bào vi rút DTL chủng C, chủng vi rút an toàn, chứng minh qua nửa kỷ Hơn nữa, vi rút nhân nuôi tế bào dịng PK 15 ni cấy bioreactor với hiệu suất cao, vi rút sau thu hoạch trải qua trình tinh để loại bỏ protein thơ khơng cần thiết nên tuyệt đối an tồn tiêm cho lợn 4.3.2 Xác định tính sinh miễn dịch vắc xin DTL 4.3.2.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể Sau miễn dịch cho lợn hành lấy máu, chắt huyết lợn thời điểm khác thực phản ứng ELISA Kết thu thể bảng 4.16 Bảng 4.16 Biến động kháng thể lợn tiêm vi rút DTL nhược độc xác định ELISA Nhóm thí nghiệm %blocking trung bình lợn thời điểm lấy máu D0 D7 D14 D21 D28 D35 Miễn dịch 29,920 42,180 53,560 61,600 69,740 78,980 Đối chứng (không tiêm) 20,220 15,120 15,880 8,800 9,360 8,080 63 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Kết kiểm tra kháng thể phản ứng ELISA cho thấy, nhóm lợn miễn dịch có đáp ứng kháng thể tốt sau tiêm vacxin Sau tiêm vắc xin DTL nhược độc 14 ngày lợn bắt đầu có kháng thể máu Hàm lượng kháng thể tăng dần đạt hàm lượng cao thời điểm 35 ngày sau miễn dịch Trong đó, lơ đối chứng khơng tiêm hàm lượng kháng thể ln âm tính suốt q trình theo dõi Kết tương đồng với kết (Chris Morrisy, 2010) xác định hiệu lực vắc xin Dịch tả lợn chủng C thích nghi tế bào PK 15A Biến động kháng thể lợn tiêm vắc xin DTL nhược độc thể qua hình 4.15 Hình 4.15 Đồ thị biến động kháng thể lợn tiêm vi rút DTL Cùng với việc xác định kháng thể lợn ELISA chúng tơi cịn xác định hiệu giá kháng thể lợn phản ứng trung hòa tế bào Kết thể qua bảng 4.17 Bảng 4.17 Hiệu giá kháng thể trung hòa lợn tiêm vắc xin DTL nhược độc Hiệu giá kháng thể trung hòa/ngày lấy máu (Log 2) Nhóm thí nghiệm D0 D7 D14 D21 D28 D35 Miễn dịch 2,8 5,0 6,0 7,5 8,2 Đối chứng (không tiêm) 0 0 0 64 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Biến động hàm lượng kháng thể trung hịa máu lợn thí nghiệm Được thể qua hình 4.16 Hình 4.16 Biến động kháng thể trung hòa lợn sau tiêm vắc xin DTL tế bào Qua kết theo dõi biến động kháng thể trung hịa máu lợn thí nghiệm cho thấy: Nhóm lợn tiêm vi rút DTL nhược độc có hàm lượng kháng thể trung hịa máu tăng dần theo thời gian, đạt cao sau 35 ngày miễn dịch chưa có dấu hiệu giảm Trong đó, lơ đối chứng hiệu giá kháng thể giảm dần gần sau 35 ngày theo dõi 4.3.2.2 Khả bảo hộ thử thách với vi rút cường độc Để đánh giá toàn diện hiệu lực vắc xin Dịch tả lợn sản xuất công nghệ nuôi cấy Microcarier, tiến hành công cường độc cho lợn chủng vi rút Dịch tả lợn cường độc với liều 102 MLD, kết thu sau:  Biểu lâm sàng lợn sau công cường độc Bảng 4.18 Biểu lâm sàng lợn sau công cường độc Chỉ tiêu theo dõi Ủ rũ Giảm ăn, bỏ ăn Tím tái, xuất huyết Tiêu chảy Sốt Chết Lợn miễn dịch 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Lợn đối chứng 3/3 3/3 3/3 2/3 3/3 2/3 65 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Qua bảng kết cho thấy: tất lợn đối chứng có biểu ủ rũ, bỏ ăn giảm ăn, tiêu chảy, sốt, xuất huyết vùng da mỏng; 2/3 lợn đối chứng chết với biểu bệnh tích đặc trưng DTL Trong tất lợn miễn dịch khơng có biểu bất thường xảy  Kết kiểm tra bệnh tích giải phẫu lợn thí nghiệm Sau cơng cường độc, lợn đối chứng có biểu sốt, bỏ ăn, ủ rũ, xuất huyết vùng da mỏng (bụng, bẹn, gốc tai…) Ở ngày thứ 5,10 sau công, lợn đối chứng bị chết Chúng tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích Bệnh tích chủ yếu gồm: Xuất huyết da, tích nước xoang bao tim, xuất huyết tim, xuất huyết sụn tiểu thiệt, xuất huyết hạch lâm ba, van hồi manh tràng loét cúc áo 66 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hình 4.17 Bệnh tích lợn cơng cường độc 67 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier thích hợp với thơng số sau: Tốc độ khuấy 60 vòng/phút, tế bào bám hạt sau 24h, phát triển 90-100% sau 72-96h, môi trường nuôi không tạo bọt; giá trị DO=50% tế bào phát triển tốt lưu lượng khí cấp vào bình ni cấy PK 15 thích hợp 0,6 lít/phút, thời gian ổn định DO dao động từ 8-9h; môi trường MEM bổ sung 5% FBS+KS pH môi trường = 7,0±0,1; mật độ tế bào PK 15 cấy vào Microcarrier 1,5 x 105 tế bào/ml Sản xuất vi rút DTL hệ thống Microcarrier sử dụng MOI: 0,01; môi trường nhiễm MEM 1% FBS + 0,1% KS + 1% hepes; pH= 7,2±0,1; vi rút đạt hiệu giá cao sau khoảng 72 sau gây nhiễm đạt 107.17 TCID 50 /ml Cao nuôi cấy Tflask 7,4 lần Vắc xin DTL nhược độc chủng C sản xuất công nghệ Microcarrier an toàn cho lợn tiêm với liều gấp 30 lần liều sử dụng sinh miễn dịch tốt Khi gây miễn dịch cho lợn với liều 1/100 liều sử dụng lợn bảo vệ hoàn toàn thử thách cường độc thời điểm 35 ngày sau miễn dịch 5.2 KIẾN NGHỊ - Đề nghị Ban lãnh đạo cơng ty Hanvet cho áp dụng quy trình sản xuất vắc xin Dịch tả lợn Microcarrier vào thực tiến sản xuất để nâng cao suất, hạ giá thành sản phẩm 68 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn (2011) Hướng dẫn biện pháp phịng chống bệnh dịch tả lợn, thuvienphapluat Blüml G., Reiter M., Zach N., Gaida T., Schmatz C., Strutzenberger K., Mohr T., Rauschert B & Katinger H (1992) Development of a new type of macroporous carrier In: Animal Cell Technology Elsevier: 501-504 Butler L (2004) Animal cell culture & technology, Taylor & Francis, 51-55 Chris Morrisy T X H C (2010) Bệnh Dịch tả heo: Phát triển vacxin Dịch tả heo Báo cáo nghiệm thu Dự án 014/07 VIE Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn Việt Nam phủ Úc Cục thú y (2013) Báo cáo kết công tác năm 2013 kế hoạch năm 2014 Clark J M & Hirtenstein (1981) High yield culture of human fibroblasts on Microcarriers: a first step in production of fibroblast-derived interferon (human beta interferon) 1(3): 391-400 Chun J J D I B S (1981) Serially subcultivated cells as substrates for poliovi rút production for vaccine 47: 25-33 Dewulf J., Laevens H., Koenen F., Mintiens K & De Kruif A J P V M (2004) Efficacy of E2-sub-unit marker & C-strain vaccines in reducing horizontal transmission of classical swine fever vi rút in weaner pigs 65(3-4): 121-133 Fan Y., Zhao Q., Zhao Y., Wang Q., Ning Y & Zhang Z J V G (2008) Complete genome sequence of attenuated low-temperature Thiverval strain of classical swine fever vi rút 36(3): 531-538 Freshney R I (2015) Culture of animal cells: a manual of basic technique & specialized applications, John Wiley & Sons Fuchs (1968) Schweinepest in H&buch der vi rút infektionen bei Tieren Giard D J., Loeb D H., Thilly W., Wang D., Levine D J B & Bioengineering K (1979) Human interferon production with diploid fibroblast cells grown on Microcarriers 21(3): 433-442 Hirtenstein M & Clark J J T C I M R (1980) Attachment & proliferation of animal cells on Microcarriers (Cytodex 1) Pergamon Press, Oxford Hùng V (2006) Công nghệ sinh học tế bào NXB Nông nghiệp, Hà Nội 69 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lê Độ (1980) Bệnh dịch tả lợn miền Bắc Việt Nam 20 năm 1960 -1980, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y III - Luo Y., Li S., Sun Y & Qiu H.-J (2014) Classical swine fever in China: a minireview 172(1-2): 1-6 Montagnon B., Fanget B & Nicolas A J D I B S (1981) The large-scale cultivation of VERO cells in micro-carrier culture for vi rút vaccine production Preliminary results for killed poliovi rút vaccine 47 55-64 Nilsson, K (1988) Microcarrier cell culture Biotechnology and genetic engineering reviews, 6(1), 404-439 Nilsson K., Buzsaky F & Mosbach K J B T (1986) Growth of anchorage–dependent cells on macroporous Microcarriers 4(11): 989-990 Nilsson K & Mosbach K J F L (1980) Preparation of immobilized animal cells, 118(1): 145-150 Nguyễn Như Hiền (2007) " Sinh học phân tử tế bào, sở khoa học công nghệ sinh học" Nguyễn Ngọc Hải (2007) Công nghệ sinh học thú y NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên & Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2012) Bệnh truyền nhiễm động vật nuôi biện pháp khống chế NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn, Bá Hiên, Thị Lan Hương Trần "Giáo trình miễn dịch học ứng dụng." (2010) Nguyễn Hồng Lộc (2006) Cơng nghệ tế bào NXB Đại học Huế Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên & Trần Thị Lan Hương (2001) Vi sinh vật Thú y NXB Nông nghiệp, Hà Nội Oie (2016) Recognition of the Classical Swine Fever Status of Member Countries Oie (2017) Recognition of the Classical Swine Fever Status of Member Countries Olekháng sinhiewicz M B., Rasmussen T B., Normann P & Uttenthal A (2003) Determination of the sequence of the complete open reading frame & the 5'NTR of the Paderborn isolate of classical swine fever vi rút, Vet Microbiol 92(4): 311-25 Trần Thị Tố Liên & Đỗ Trọng Đạt (1985) Một số nét đặc trưng dịch tễ học lâm sàng bệnh lý lâm sàng bệnh dịch tả lợn cổ điển Việt Nam Phạm Văn Phúc (2009) Công nghệ sinh học người động vật NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh Trần Đình Từ (1990) Bệnh dịch tả lợn, Trung tâm Nghiên cứu - Công ty thuốc thú y TW II 70 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Trần Anh Đào (2009) Một số đặc điểm bệnh lý lợn mắc bệnh dịch tả Tạp chí Khoa học Phát triển 7(2): 165-170 Trần Thị Dân, Nguyễn Thị Cẩm Tuyền & Hà Thị Thanh Lao (2000) Biểu lâm sàng bệnh tích dịch tả lợn lợn giết thịt lị mổ Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y Page M & Dufour C J J C B (1979) Growth of human colon carcinoma cells on beaded Microcarriers, 83: 302A Postel A., Austermann‐Busch S., Petrov A., Moennig V., Becher P J T & Diseases E (2018) Epidemiology, diagnosis & control of classical swine fever: Recent developments & future challenges 65 248-261 Sang H J., Kwon T., Yoo S J., Lee D.-U., Lee S., Richt J A & Lyoo Y S J E I D (2018) Classical swine fever outbreak after modified live LOM strain vaccination in naive pigs, South Korea 24(4): 798 Shirokaze J., Yanagida K., Shudo K., Konomoto K., Kamiya K & Sagara K (1995) Il-4 production using macroporous Microcarrier In: Animal Cell Technology: Developments Towards the 21st Century Springer: 877-881 Spier R., Whiteside J J B & Bioengineering K (1976) The production of foot‐&‐mouth disease vi rút from BHK 21 C 13 cells grown on the surface of DEAE sephadex A50 beads 18(5): 659-667 Tamura T., Nagashima N., Ruggli N., Summerfield A., Kida H & Sakoda Y J V R (2014) N pro of classical swine fever vi rút contributes to pathogenicity in pigs by preventing type I interferon induction at local replication sites 45(1): 47 Van Hemert P., Kilburn D., Van Wezel A J B & Bioengineering K (1969) Homogeneous cultivation of animal cells for the production of vi rút & vi rút products 11(5): 875-885 Van Wezel A (1973) Microcarrier cultures of animal cells in Tissue Culture: Methods & Applications, Kruse PF & Peterson MK (eds)(pp 372–377) New York London, Academic Press Wan D H (2000) Hog cholera desease of swine, Fourth Edition: pp.189-225 71 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ... nuôi cấy tế bào chất mang Microcarrier, thực đề tài:? ?Nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc Dịch tả lợn tế bào cơng nghệ Microcarrier cơng ty Hanvet? ?? 1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Đề tài thực nhằm mục... loại vắc xin DTL nhập sản xuất nước song giá thành cịn cao, vắc xin giá rẻ chất lượng hiệu sử dụng vắc xin chưa ổn định Tại Hanvet vắc xin DTL nhược độc tế bào sản xuất tế bào PK 15, nuôi cấy chai... cường độc từ mô bào máu lợn) vắc xin vô hoạt tế bào: nuôi cấy vi rút tế bào thêm bổ trợ nhũ dầu Nhưng hai loại vắc xin có hiệu nên chúng không áp dụng nhiều *) Vắc xin nhược độc cổ điển: vắc xin sản