ScanGate document
TAP CHi KHOA HOC No - 1994 NGHIEN CUU THANH PHAN FLAVONOIT LA Clorodendron frangrans Vent VA ANH HUGNG CUA CHUNG LEN HOAT TINH CATHEPSIN Ở HUYẾT THANH MÁU NGƯỜI (IN VITRO) Lê Đức Ngọc Hà Việt Hải Khoa Hóa, đại học Tổng hợp Hà Nội Đào Kim Nhung Khoa Sinh, đại học Tổng hợp Hà Nội Flavonoit nhóm chất polyphenol tự nhiên, có giá trị thực tiễn chúng có nhiều tác dụng sinh học quan trọng độc Khung cacbon flavonoit gồm hai vòng benzen (vòng A B), vịng pyran (vịng C vịng A kết hợp với vòng C tạo thành khung Chroman Tay theo mức độ oxy hóa khung cacbon có mặt nhóm mà phân loại favonoit thành phân nhóm sau: Flavon, Flavonol, Flavanonol, Flavanon, Chalcon, Auron, Catechin, Leucoathoxyanidin Anthoxyanidin Ngồi cịn có chất Izoflavonoit é) & | Khung cacbon flavonoit @ Hoạt tính sinh học chất favonoit phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo hóa học chất Vì vậy, chất flavonoit đa dạng hoạt tính sinh học tác dụng lý Trong số tác dụng dược lý biết, nhiều nhà sinh y học giới đặc biệt quan tâm đến hiệu lực chống khối u, chống di ung thư, chống trình lão hóa chống viêm số avonoit Theo tác giả M Volf K Ransberger (1972) cho biết enzym proteolytic thủy phân protit máu có vai trò trực tiếp chế chống di ung thư q trình lão hóa Khả phụ thuộc vào hoạt tính ensym, đặc biệt hệ enzym cathepsin Các cathepsin hoạt động tối ưu pH 4,5 - 5,5, khu trú chủ yếu lizoxom bạch cầu đa nhân đóng vai trị quan trọng chế tổng quát thực bào Thăm dò ảnh hưởng chất flavonoit chiết suất từ 'hc vật hoạt động enzym proteolytic máu, chủ yếu cathepsin phần giúp cho việc tìm kiếm flavonoit có hoạt tính sinh học phục vụ mục đích nói I ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU A Déi tượng Lá Clorodendron frangrans Vent 38 Tên dân gian: Cây Bạch đồng nữ, Bần trắng Cây mọc hoang nhiều nơi, thuộc nước Đông Nam Á Theo Đỗ Tết Lợi (1977), thành phần hóa học chưa nghiên cứu Trong nhân dân thuốc dùng chủ yếu chữa bệnh bạch đới phụ nữ Theo điều tra nhất, số dân tộc vùng cao sử dụng để chữa nhiều bệnh nan giải, trong:đ, có bệnh gan-mật, xơ cứng mạch mắn, cao huyết áp, giảm đau, ung thư cổ tử cung Máu Huyết máu người bình thường, lấy hai lứa tuổi I- Từ 25 đến 35 tuổi II - từ 35 đến 45 tuổi B Phương pháp Phát ffavonoit phản ứng định tính đặc trưng Chiết suất định lượng favonoit theo phương pháp B C Talli Phân tích Flavonoit phương pháp: Sắc ký lớp mỏng chiều silicagel-G; Hệ dung môi Toluen-etyl axetat axeton-metanol (5:2:2:1) Phát sắc ký đồ điều kiện cần thiết b Quang phổ hấp thụ tử ngoại (QPHTTN) hồng ngoại (QPHN) Xác định hoạt tính Cathepsin huyết theo phương pháp Ácropxki, Arakop (1976) II KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN Phát flavonoit “Tiến hành phản ứng định tính đặc trưng ống nghiệm với thuốc thử: NaOH, muối Morth, Diazo, Shinoda véi dich chiết tổng số cho kết dương (+) chứng tổ có mặt favonoit nguyên liệu nghiên cứu Chiết suất định lượng flavonoit Flavonoit tổng số chiết suất phương pháp B C Talli cho kết định lượng 0,547 0,031 (%) trọng lượng khô Phan tich flavonoit 3.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng Tiến hành sắc ký chế phẩm flavonoit tổng số Kết trình bày bảng Dựa vào màu sắc sắc ký đồ phun thuốc thử đặc trưng rút dự đốn sau: - Vết favonoit thuộc nhóm flavonol - Vết ffavon - Các vết 5, 6, vết lạ khơng thuộc loại flavonoit, chúng hợp chất trung gian ffavonoit trình biến đổi favonoit thực vật - Phản ứng với vanilin không cho màu đỏ sen sắc ký đồ chứng tỏ khơng có catechin 39 Bảng Kết phân tích favonoit SKLM (sắc ký lớp mỏng) Số TT Rf 0,70 0,50 0/73 0,33 0/27 xanh xanh nâu nâu xanh 0,15 đỏ nhạt 0,23 UV 366nm vàng” vàng” vàng vàng lơ" AICI (UV) vàng vàng nâu nâu xanh lơ Amoniac (UV) xanh lam° xanh lam" tối tối - xanh xanh nâu nâu - Wilson (UV) lam° lam” vàng vàng - vàng xanh° vangxanh* nâu nâu - xanh lơ* - - dé tim dé tim lod — Ánh sáng tự nhiên nâu nâu nâu nâu - vàng vàng vàng vàng vang ~ - - tươi tươi xanh xanh tham Ghỉ chú: Khi phun thuốc thử lên mỏng sắc ký quan sát ánh sáng tự nhiên tử ngoại (UV 366 nm) xuất vết có màu đặc trưng Ký hiệu * vết có phát quang soi UV RF [ 10 | | sút | sơ NTE }™ mắt | = ý = vững = vắng xunh = xanh thấm = vdng xanh | Hình Sắc ký đồ favonoit tổng số quan sát ánh sáng tự nhiên 3.2 Thu nhân chế phẩm FL-1 đặc trưng Phân đoạn flavonoit FL-1 tách từ favonoit tổng số phương pháp sắc ký cột Silicagel, có đặc điểm sau: - Phần ứng shinoda (+) - Trên mỏng sắc ký cho vết Rf = 0,07, tương đương với vết số sắc ký đồ favonoit tổng số - Các phần ứng màu đặc trưng mỏng sắc ký sau: Ánh sáng tự nhiên: vàng tươi AICI3/UV: phát quang xanh lam 40 UV 366nm: phát quang xanh lam Wilson/UV: phát quang xanh lam HạO; : chuyển từ màu vàng thành vàng nâu Như phân đoạn FL-1 cho phản ứng điển hình favonol 8.8 Phổ hồng ngoại tử ngoại Phổ hổng ngoại [phận đoạn FL-1} | (phân don FL-1) L— \ L7 | Phổ tử ngoại b) a) Hình Phổ tử ngoại (a) hồng ngoại (b) 8avonoit FL-1 Từ dạng dung dịch, kết tủa flavonoit chloroform thu nhận chế phẩm FL-1 dạng bột vơ định hình màu vàng xanh; hịa tan bột metanol để đo phổ hồng ngoại tử ngoại Trên phổ hồng ngoại xuất đỉnh đặc trưng sau: - Đỉnh 1710 nm đặc trưng nhóm Ơ = O vị trí C4 - Đỉnh 3400 nm đặc trưng nhóm OH, đỉnh rộng chứng tỏ OH dạng liên hợp - Dinh 1460, 1510, 1600 nm đặc trưng cho dao động hóa trị liên kết C= C nhân thơm - Đỉnh 1150nm đặc trưng cho dao động C-O-H Trên phổ tử ngoại xuất cực đại hấp thụ 370 nm 250nm Như dựa vào phổ hồng ngoại tử ngoại ta thấy: phổ hồng ngoại xuất đỉnh đặc trưng dao động ứng với cấu tạo Flavonoit Các đỉnh cực đại hấp thụ tử ngoại nằm vùng cực đại hấp thụ tử ngoại Flavonol Vậy lần giúp ta dự đoán FL-1 Flavonol Ảnh hưởng Flavonoit Clorodendron frangrans Enzym Cathepsin huyết máu người Vent lên hoạt động Trong máu có nhiều loại enzym proteaza, chúng có nhiệm vụ thủy phân protit Tuy nhiên enzym đồi hỏi điều kiện cụ thể để thực chức sinh lý - sinh hóa mình, giá trị pH điều kiện định Các cathepsin hoạt động pH = 5,õ Các enzym 41 nhóm proteaza đóng vai trị quan trong chế tổng quát thực bào, liên quan chặt chẽ với ngun nhân gây bệnh q trình lão hóa Huyết người khỏe mạnh sử dụng để tiến hành thí nghiệm hai lứa tuổi: từ 25-35 35-45 Tiến hành xác định hoạt tinh enzym cathepsin(thi in vitro) điều kiện bình thường điều kiện có mặt Flavonoit tổng số chế phẩm FL-1 Hoạt độ enzym tính theo số mM tyrozin giải phóng sau phản ứng Iml huyết /1 phút 4.1 Hoạt tính cathepsin huyết Kết bảng cho biết giá trị hoạt tính cathepsin lứa tuổi Bảng Hoạt tính cathepsin lứa tuổi khác Lứa tuổi mM Tyrozin 25 - 35 (1) 35 - 45 (II) 0,140 + 0,005 0,110 + 0,008 Rõ hoạt tinh enzym & lira tuéi (1) cao lứa tuổi (II), chứng tổ hoạt độ enzym giảm tuổi đời tăng (ở tuổi trung niên) 4.2 Ảnh hưởng chế phẩm Flavonoit (tổng số FL-1) lên hoạt động cathepsin huyết 4.9.1 Ảnh hưởng Plauonoit tổng số Thí nghiệm tiến hành với nồng độ Flavonoit biến thiên từ để 0,20 mg % Hoạt độ enzym tăng dần đạt giá trị cực đại lứa tuổi (I) nồng độ 0,10 mg% (đạt 135,6%) Hoạt đồ 22 lứa tuổi (II) nồng độ 0,15 mg % (đạt 139,2%) Vượt ngưỡng khả hoạt hóa enzym giảm dần (xem đồ thị 1) 005 01 0.15 9¿ Néng dé flavoneit (mg% ) Đồ thị Ảnh hưởng chế phẩm favonoit tổng số lên hoạt động cathepsin huyết Nếu so sánh theo tỷ lệ % hoạt tính enzim, ta thấy rõ: Flavonoit tổng số hoạt hóa enzim lứa tuổi (II) mạnh lứa tuổi (I) nồng độ Đình hoạt động cực đại enzim lứa tuổi (H) tương ứng với nồng độ Plavonoit cao lứa tuổi (I) có nghĩa nhu cầu Flavonoit cho 42 đạt cực đại hoạt độ enzim tuổi chuyển tiếp từ niên sang trung niên nhiều lứa tuổi niên 4.9.9 Ảnh hưởng chế phẩm FL-1 lên hoạt động cathepsin huyết 'Thí nghiệm tiến hành với nồng độ Flavonoit từ 0,075 đến 0,200 mg 9% Bảng Ảnh hưởng chế phẩm FL-1 lên hoạt động cathepsin huyết Nong dé flavonoit (mg%) Lita tuổi “- 0,075 0/100 0,150 0,200 Hoạt oat I os a5 % entimi ¿ "ự #100 độ 100 1125ì 1254, 118,9¡ 110,2› 1188 1276 - 1304 115,4 Kết trình bày cho thấy khả hoạt hóa ensym chế phẩm FL-1 thấp so với chế phẩm FÌavonoit tổng số Hiện tượng cho phép nghĩ phối hợp thành phần Flavonoit có chế phẩm Flavonoit tổng số cho hiệu lực hoạt hóa ensym cao thành phần riêng biệt < ¬ KẾT LUẬN Từ kết thí nghiệm cho phép rút vài kết luận bước đầu Flavonoit Clorodendron frangrans Vent: Thông qua phản ứng màu đặc trưng sắc ký lớp mỏng ống nghiệm dự đốn thành phần Flavonoit chủ yếu Flavon Flavonol Sắc ký lớp mỏng cho phép tách vết riêng rẽ, có vết thể đặc trưng Flavonoit: vết thể đặc trưng Flavonol, vết thể đặc trưng Flavon Hàm lượng gần Flavonoit tổng số 0,547 + 0,031 (%) Chế phẩm FL-1 tách từ chế phẩm Flavonoit tổng số tương ứng với vết sẮc ký đồ SKLM, sản phẩm tách sạch, cho đầy đủ phản ứng màu có phể hấp thụ tử ngoại đặc trưng Flavonol 4, Hoat déng enzym cathepsin huyết lứa tuổi I (25-35 tuổi) cao lứa tuổi II (35 - 45 tuổi) Chế phẩm Flavonoit tổng số FL-1 hoạt hóa cathepsin huyết người nồng độ thích hợp, Flavonoit tổng số hoạt hóa cathepsin mạnh FL-1 TÀI LIỆU THAM KHẢO 2, Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật - Hà Nội 1977 E Stahl, Analyse chromatographique et microscopique des drogues Entreprise mederne 8”Edition 43 Paris 1975 M D Max Wolf, Pu O Karl Ransberger, Ensyme - Therapy, Biological Research institute New York Vantage press New York Washington, Hollywood, 1972 J B Harborne, Biochemistry of phenolic compounds Academic press - London and New York 1964 _B.II.TeoprwepcKni, ®w3WKO - XHMH€CKHE M€TO/JLbl AHANM3a GHONOTMYeCKMH - BKTHBHBIX BelI€CTB pACTHT€/IEHoro npowcxo3Knenna Man “Mnp” MocKba 1976 THE INVESTIGATION OF THE COMPOSITION OF FLAVONOIDS FROM Clorodendron frangrans Vent LEAVES AND THEIR EFFECT ON THE CATHEPSIN ACTIVITY IN SERUM OF MAN BLOOD (IN VITRO) Le Duc Ngoc and Ha Viet Hat Faculty of Chemistry, Hanoi University Dao Tht Kim Nhung Faculty of Biology, Hanoi University The composition of flavonoids of Clorodendron frangrans leaves and their biological effects on the cathepsin activity in serum of man blood were studied The obtained results showed that the total flavonoids content was 0.547 + 0.031 (% dry weight), the flavon and flavonol groups were the main compositions of flavonoids of Clorodendron fragrans leaves The pure product FL-1, isolated from the total flavonoids possessed all characters of flavonol group They are the special qualitative reactions, infra-red and ultra - violet spectra The total flavonoids and the FL-1 product in the suitable concentraions increased the cathepsin activity, but the effect of the total flavonoids was better The enzyme activity in serum of the 2535 years old person was higher than in that of the 35-45 years old one The maximum enzyme activity in serum of the various ages depended on the used flavonoid concentration The flavonoid concentration, increased the maximum enzyme activity in serum of the 35-45 age was higher than that of the 25-35 age Thus, it was suggested that the flavonoids of Clorodendron frangrans leaves have many valuable bio-pharmaceutical actions, because they increased the cathepsin activity in serum The cathepsin activity takes a considerable role in the mechanism, concerned with the resistenace of the cancer metastasis and falling ill in the ageing 44 ... tyrozin giải phóng sau phản ứng Iml huyết /1 phút 4.1 Hoạt tính cathepsin huyết Kết bảng cho biết giá trị hoạt tính cathepsin lứa tuổi Bảng Hoạt tính cathepsin lứa tuổi khác Lứa tuổi mM Tyrozin 25 -... Rõ hoạt tinh enzym & lira tuéi (1) cao lứa tuổi (II), chứng tổ hoạt độ enzym giảm tuổi đời tăng (ở tuổi trung niên) 4.2 Ảnh hưởng chế phẩm Flavonoit (tổng số FL-1) lên hoạt động cathepsin huyết. .. khả hoạt hóa enzym giảm dần (xem đồ thị 1) 005 01 0.15 9¿ Néng dé flavoneit (mg% ) Đồ thị Ảnh hưởng chế phẩm favonoit tổng số lên hoạt động cathepsin huyết Nếu so sánh theo tỷ lệ % hoạt tính